PROYECTO: OBTENCIN DE CIDO

LCTICO COMO FUENTE DE MATERIA

PRIMA EN LA INDUSTRIA.
 OBJETIVO
Aumentar la obtencin del cido lctico a travs de un medio de fermentacin con
suero de sangre por medio de la bacteria Lactobacillus Delbrueckii Bulgaricus

Introduccin
El hombre necesita de los procesos bioquimicos para la obtencion de
productos beneficos y necesarios para la industria.actualmente el consumo del
acido lactico, esta limitado principalmente a la industria de alimentos y farmaceutica.
Por ello se hace necesaria la investigacion de el sustrato compuesto por sacarosa
y suero de sangre de res, este sustrato, ofrece al microorganismo los nutrientes
necesarios para un buen crecimiento, bajo condiciones optimas de ph (5,5-6,0) y
temperatura de 48 c .

PLANTEAMINETO DEL PROBLEMA

Cmo mejorar la eficiencia en el proceso de fermentacin para la obtencin
del cido lctico?

MARCO TERICO
CIDO LCTICO
El cido lctico fue descubierto en 1780 por el qumico sueco Scheele, quien lo aisl
de leche agria, fue reconocido como producto de fermentacin por Blonodeaur en
1847 y tan solo en 1881, Littlelon inicia la fermentacin a escala industrial. Es un
compuesto muy verstil utilizado en la industria qumica, farmacutica, de alimentos
y de plsticos.
El cido lctico tiene un amplio rango de aplicaciones en la industria alimenticia,
qumica, farmacutica, qumica y cosmtica, entre otras. Recientemente se ha
acelerado la investigacin en L (+) y D (-), cido lctico, por va biotecnolgica,
debido a su posibilidad de transformacin en poli-lctico biodegradable (PLA). Los
esfuerzos en la investigacin del cido lctico, estn enfocados a disminuir los
costes de produccin a travs de nuevos sustratos, nuevas tecnologas de
fermentacin y separacin, y nuevos microorganismos capaces de alcanzar altas
concentraciones de cido lctico, altos rendimientos y altas productividades.

Propiedades del cido lctico

 Frmula C3H6O3

Peso molecular 90,08

ndice de refraccin 1,4414

Punto de fusin L(+) y D(-) 52,8 a 54 C

Punto de ebullicin 125-140 C

Gravedad especfica 1206

Calor de combustin 3616 cal/g
Viscosidad 40,33 mNsm-2

Densidad 1,249
Constante dielctrica 22

Obtencin del cido Lctico - LAB

Las bacterias que pueden utilizarse para la produccin de cido lctico son cocos y
bacilos Gram positivos, anaerobios facultativos, no esporulados, inmviles y
catalasa negativo, pertenecientes a los gneros Lactobacillus, Carnobacterium,
Leuconostc, Tetragenococus.

Las bacterias del cido lctico (LAB) tienen requerimientos nutricionales complejos
debido a su limitada habilidad para sintetizar aminocidos y vitamina B. La mayora
de LAB producen nicamente una forma isomrica de cido lctico. Las especies
de los gneros Aerococcus, Carnobacterium, producen nicamente ismeros L,
mientras las especies del gnero Leuconostc producen nicamente ismeros D. Sin
embargo, algunas LAB producen formas racmicas donde el ismero predominante
depende de cambios en la aireacin, cantidad de NaCl, tipo de fermentacin,
incrementos en el pH y concentracin de sustrato.

De las LAB, Lactobacillus delbrueckii es el microorganismo ms utilizado en la

produccin a gran escala de cido lctico, ya que tiene la ventaja de producir
nicamente ismeros L (+), consumir eficientemente glucosa y ser un
microorganismo termfilo con temperatura ptima de crecimiento 41.5C, lo que
reduce costes de enfriamiento y esterilizacin, as como riesgos de contaminacin
microbiolgica en el fermentador. Este microorganismo crece bien a un pH entre 5,5
y 6,5 por lo que el cido producido debe ser continuamente neutralizado.

En la produccin biotecnolgica de cido lctico con bacterias o con hongos, se

utilizan como sustratos, sacarosa proveniente de la caa de azcar y de la
remolacha azucarera, pero debido a que el azcar puro es de alto coste se han
venido investigando otros sustratos (desechos agrcolas) para disminuir los costes
de produccin. Sin embargo la produccin de cido lctico de estas fuentes
renovables requiere de los siguientes pasos:

1) Hidrlisis del sustrato hasta azcares fermentables.

2) Fermentacin de azcares a cido lctico.

3) Separacin de biomasa y partculas slidas del medio de fermentacin.

4) Purificacin del cido lctico obtenido.

En la obtencin comercial con bacterias lcticas, al sustrato puro se le adiciona

una fuente de vitaminas y de cofactores, se utiliza una mezcla de de 10 a 15% de
glucosa, cantidades menores de fosfato de amonio, extracto de levadura y 10%
neutralizante. El medio se inocula y se agita sin aireacin para optimizar la
neutralizacin del cido formado. La fermentacin dura entre 2 a 4 das y se termina
cuando todo el azcar es consumido, con el fin de facilitar la purificacin. Al final de
la fermentacin el medio es ajustado a pH 10 y si se utiliza carbonato de calcio, el
medio es calentado para solubilizar el lactato de calcio y coagular protenas
presentes. Posteriormente el medio se filtra para eliminar sustancias insolubles, as
como biomasa. El cido libre se obtiene por adicin de cido sulfrico seguido de
filtracin para eliminar el sulfato de calcio formado. El cido lctico es entonces
concentrado por evaporacin.

Debido a que el tipo de fermentacin descrito ( en discontinuo) est limitado por

el dao que sufren las clulas por la acumulacin en el medio de fermentacin de
la forma no disociada del cido, se han investigado otros modos de fermentacin
como son la fermentacin en discontinuo con alimentacin intermitente y la
fermentacin en continuo y se han desarrollado una serie de procesos basados en
la eliminacin del producto por filtracin y concentracin de las clulas usando una
unidad de retencin. La fermentacin en discontinuo con alimentacin intermitente
es un proceso en el cual el birreactor es alimentado de continua o secuencialmente
con sustrato, sin la eliminacin del medio de fermentacin, mientras que la
fermentacin en continuo la corriente de producto posee la misma composicin que
el lquido presente en el reactor. La fermentacin en continuo da en la mayora de
los casos mayores concentraciones y mayores rendimientos, comparado con la
fermentacin en discontinuo.

Usos y especificaciones

El cido lctico y sus derivados como sales y steres son ampliamente utilizados
en la industria alimenticia, qumica, farmacuticas, del plstico, textil, la agricultura,
alimentacin animal entre otros.
 En la industria alimenticia se usa como acidulante y conservante. Las industrias
qumicas lo utilizan como solubilizador y como agente controlador de pH. En la
produccin de pinturas y resinas, puede ser utilizado como solvente biodegradable.
En la industria de plsticos es utilizado como precursor del cido polilctico (PLA),
un polmero biodegradable con interesantes usos en la industria y la medicina; se
considera sta la principal aplicacin del cido y la causa por la cual ha aumentado
considerablemente su demanda.

LACTOBACILLUS DELBRUECKII BULGARICUS

El gnero Lactobacillus (lactis-leche; bacillus-pequeos bacilos) se caracteriza por
presentar clulas en forma de bacilos largos y extendidos, aunque con frecuencia
pueden observarse bacilos cortos o coco-bacilos coryneformes (Kandler y Weiss,
citados por Bergey, 1992); lo cual hace que se puedan confundir con gneros
aislados habitualmente de materiales clnicos (Marin, Bantar, Monterisi, Smayevski,
Surez de Basnec y Bianchini,1993). Estos bacilos se presentan comnmente
formando cadenas y en general son no mtiles, pero cuando tienen motilidad es por
la presencia de flagelacin pertrica. Son Gram, positivos y slo las clulas muertas
pueden dar resultados variables a la tincin de Gram.
Adems, no esporulan y algunas cepas presentan cuerpos bipolares que
probablemente contengan polifosfato. Los grandes bacilos homofermentativos
presentan grnulos internos revelados por tincin de Gram o por tincin con azul de
metileno.

Nutricin y condiciones de crecimiento

Los lactobacilos presentan particularidades para cada especie respecto a los
requerimientos nutricionales complejos para los aminocidos, pptidos, derivados
de cidos nucleicos, vitaminas, sales, cidos grasos o steres de cidos grasos y
carbohidratos fermentables.
Requieren no slo carbohidratos como fuentes de Carbono y energa, sino tambin:
aminocidos, vitaminas y nucletidos. Generalmente estos requerimientos variados
suelen suplirse cuando el medio de cultivo de los lactobacilos contiene
carbohidratos fermentables, peptona, extracto de carne y extracto de levadura,
aunque una suplementacin con jugo de tomate, manganeso, acetato y steres del
cido oleico, especialmente Tween 80, resulta estimuladora y hasta esencial para
muchas especies. Por eso, estos compuestos se incluyen en el medio MRS. Existen
especies que se adaptan a sustratos muy particulares y necesitan factores de
crecimiento especiales (Bergey, 1992).
pH
Los lactobacilos crecen bien en medios ligeramente cidos, con pH inicial de 6,4 -
4,5 y con uno ptimo de desarrollo entre 5,5 y 6,2. Su crecimiento cesa cuando el
pH alcanza valores desde 4 hasta 3,6 en dependencia de especies y cepas y
disminuye notablemente en medios neutros o ligeramente alcalinos. Los
lactobacilos son capaces de disminuir el pH del sustrato donde se encuentran por
debajo del valor 4,0 mediante la formacin de cido lctico. De esta forma evitan o
al menos disminuyen considerablemente el crecimiento de casi todos los otros
microorganismos competidores, exceptuando el de otras bacterias lcticas y el de
las levaduras (Bergey, 1992)
Necesidades de Oxgeno
La mayora de las cepas de Lactobacillus son principalmente aerotolerantes; su
crecimiento ptimo se alcanza bajo condiciones microaeroflicas o anaerbicas y se
conoce que un incremento de la concentracin de CO2 (de aproximadamente 5% o
hasta el 10%) puede estimular el crecimiento, sobre todo en el caso del crecimiento
superficial sobre medios slidos (Bergey, 1992)
Temperatura de crecimiento
La mayor parte de los lactobacilos son mesfilos (30 - 40C), con un lmite superior
de 40C. Aunque su rango de temperaturas para el crecimiento oscila entre 2 y
53C, algunos crecen por debajo de 15C y hay cepas que crecen por debajo de
5C. Otros crecen a temperaturas bajas, cercanas al punto de congelacin (por
ejemplo, los que habitan en carnes y pescados congelados).
Los llamados lactobacilos termfilos pueden tener un lmite superior de
temperatura de 55C y no crecen por debajo de 15C. An no se conocen los
verdaderos lactobacilos termfilos que crezcan por encima de 55C (Bergey, 1992)
Metabolismo
En su metabolismo, los lactobacilos van de la vida anaerobia a la aerobia. Estos
microorganismos carecen de sistemas de citocromos para ejecutar la fosforilacin
oxidativa y no poseen enzimas superxido dismutasas ni catalasas.
Los miembros de este gnero transforman la glucosa y las hexosas aldehdicas
similares, los carbohidratos que producen estos azcares simples y los alcoholes
polihidroxlicos en cido lctico por homofermentacin o bien, en cido lctico y
otros productos finales adicionales como cido actico, etanol, dixido de carbono,
cido frmico y cido succnico por heterofermentacin (Kandler, 1983),
constituyendo al menos un 50% de los productos finales el cido lctico, el cual
usualmente no es fermentado (Kandler y Weiss, citados por Bergey, 1992).
Las principales vas de la fermentacin para las hexosas son: la de Embden-
Meyerhof, donde se convierte 1 mol de hexosa en 2 moles de cido lctico por
fermentacin homolctica y la va del 6-fosfogluconato, cuyo resultado es 1 mol de
CO2, 1 mol de etanol (o de cido actico) y 1 mol de cido lctico, por fermentacin
heterolctica. En condiciones aerobias, la mayora de las cepas reoxidan el NADH2
utilizando el O2 como aceptor final de electrones, de modo que el Acetil-CoA no es,
o al menos no es completamente reducido a etanol.
De esta manera, se forma ATP adicional por fosforilacin a nivel de sustrato, as
como proporciones variables de cido actico y etanol, en dependencia del
suministro de Oxgeno (Archibald y Fridovich; 1981 citados por Bergey,1992).
En cuanto a los niveles enzimticos, los lactobacilos heterofermentativos poseen
fosfocetolasas, pero no FDP aldolasas, mientras que los homofermentativos poseen
FDP aldolasas, pero no fosfocetolasas.

SUERO DE SANGRE DE RES (Plasma Sanguneo)

La sangre del ganado bovino ha sido histricamente un enorme problema, su mal
manejo en cuanto a la disposicin ya que generalmente es vertida a los cauces de
agua desaprovechando este recurso y contaminando grandemente el hbitat de
muchas especies de flora y fauna que por la bondad de sus componentes termina
perjudicando el agua, hacen de este recurso un generador de contaminacin
permanente.

En promedio una res tiene 10 litros de sangre la cual contaminar unos 10.000 litros
de agua es decir a un porcentaje de 1 por mil; estos valores tan elevados han llevado
a las autoridades ambientales a exigir una disposicin final adecuada de este
valioso recurso que infortunadamente no es utilizado en los centros de matanza
desencadenando en muchas ocasiones el cierre por lo menos temporal de muchos
centros de matanza.

Los componentes de la sangre

El 45% del volumen de la sangre son clulas, glbulos rojos (la mayora), glbulos
blancos y plaquetas. Un fluido claro y amarillento, llamado plasma, constituye el
resto de la sangre. El plasma, del cual el 95% es agua, contiene tambin nutrientes
como glucosa, grasas, protenas, vitaminas, minerales y los aminocidos
necesarios para la sntesis de protenas. El nivel de sal en el plasma es semejante
al nivel de sal en el agua de mar.
La sangre es un lquido de color rojo escarlata, localizado en el sistema circulatorio
del organismo animal. Es un producto que se obtiene despus del sacrificio de las
reses, la cual se considera apta para consumo humano una vez se somete
previamente a un tratamiento.
Composicin qumica de la sangre.
Belitz, menciona que la sangre esta formada por el plasma, que es un componente
rico en protenas, en el que estn suspendidos los elementos celulares como
eritrocitos, leucocitos y trombocitos. Los glbulos rojos tienen forma de discos, no
poseen ncleos y son elsticos. Estos glbulos contienen el pigmento sanguneo
llamado hemoglobina. Los glbulos blancos son clulas que poseen ncleo pero no
tienen membrana ni color y son mucho menos abundantes que los eritrocitos. En el
plasma se encuentran 25 adems de las sales sanguneas (fosfato potsico, cloruro
sdico y pocas sales de Ca, Mg y Fe), una gran cantidad de protenas, entre las que
se destaca la albmina, diversas globulinas y el fibringeno

Composicin qumica aproximada de sangre (g/100 g porcin comestible)

Propiedades fsicas de la sangre.

Color.
Tanto la mioglobina como la hemoglobina son protenas conjugadas y son las
responsables del color rojo caracterstico en la sangre, que con la exposicin a la
atmsfera se torna ms oscuro; ambos pigmentos desempean funciones
biolgicas muy importantes: la hemoglobina se encarga del transporte del oxgeno
de los pulmones a los diferentes tejidos, y ah queda retenido temporalmente en la
mioglobina, hasta que se consume en el metabolismo aerbico

Peso especfico y viscosidad relativa

Tratamiento de la sangre.
Uno de los principales problemas que presenta el manejo de la sangre es el proceso
de coagulacin. La sangre se coagula en los 3 a 10 minutos siguientes de
desangrado del animal, dependiendo de la temperatura ambiente, debido a la
enzima trombina que convierte el fibringeno soluble de la sangre en fibrina
insoluble. La coagulacin no se produce en la sangre circulante en el animal vivo
porque existen anticoagulantes naturales.

PLASMA SANGUNEO
Definicin.
El plasma sanguneo es la fraccin de la sangre de la cual se ha extrado por
centrifugacin los elementos celulares pero que contiene fibringeno, que lo hace
diferente del suero.
El plasma obtenido de la sangre de algunos animales como el bovino, es
aprovechado en diversos pases en la alimentacin humana, incorporado en los
alimentos como fuente de protena de bajo costo. Estas protenas sanguneas
tambin pueden utilizarse en la formulacin de alimentos concentrados para
consumo animal y medios de cultivo (Mrquez et al., 1997). Adems de aportar
protena, poseen propiedades funcionales de aplicacin en la industria de alimentos.
El uso de esta protena como agente emulsificante es compleja y depende de
factores como la concentracin proteica, tipo de grasa, velocidad y tiempo de
mezclado, entre otros (Hopper y Cassidy, 2006; Ockerman y Hansen, 2000).
El plasma es un lquido translucido ms denso que el agua y ligeramente alcalino,
con pH de 7.4, en algunos casos puede presentar un ligero color rosado y est
constituido por un 90 % de agua, contiene entre 15 y 20% de protena, con varios
nutrientes esenciales como aminocidos, minerales, vitaminas y cidos grasos,
(Selmane et al., 2008; Liu, 2002). Las protenas del plasma bovino han sido
utilizadas como gelificantes de surimi (Seymour et al., 1997) clarificadoras de vinos,
estabilizadoras de quesos o agentes colorantes, texturizantes, extensores y
emulsificantes de productos crnicos (Ockerman y Hansen, 2000).

Obtencin del plasma bovino

La separacin del plasma de los corpsculos rojos de la sangre, se realiza por

centrifugacin de la misma. Para ello, inmediatamente despus de su recogida se
deposita en recipientes plsticos y se le inyecta 2 y 2.5 gramos del anticoagulante
(citrato de sodio) por 100 ml de agua, y recolectada directamente de la vena yugular,
1000 mL de sangre, con previa higienizacin de la piel. Posteriormente, los
recipientes plsticos con la sangre recolectada fueron refrigerados a 4 C, mediante
el uso de un gel refrigerante y llevado al laboratorio para centrifugar a 7000 rpm
durante 30 minutos. El plasma fue conservado en refrigeracin a 4 C, mediante el
uso de lquidos refrigerantes.
 La siguiente figura corresponde a la seccin de una separadora centrfuga para
sangre. En la misma se ve como sta entra por arriba (1) a travs de una vlvula de
flotacin (2) hasta penetrar en el interior del cuerpo de la separadora por el eje
central donde se distribuye en una serie de discos que estn girando a gran
velocidad

Seccin de una mquina

centrifuga para la obtencin
de plasma a partir de la
sangre

obtencin de plasma para usos alimenticios

En la siguiente figura se observa la instalacin para la recogida y separacin en

plasma y corpsculos de sangre. En esta se aprecia cmo pasa primero a una
especie de embudo con una tela o malla filtrante (1) y de ah a un tanque para su
recogida (2). Inmediatamente la sangre a travs de unas bombas (con variador de
velocidad para tener siempre un caudal ajustado), es enviada a la separadora
centrfuga donde se produce la separacin citada. Los corpsculos rojos van a parar
a los primeros bidones (6) y, el plasma a los dos siguientes (7). El tanque (3) se usa
para los circuitos de limpieza as como para el arranque de la planta, con plasma.
Despus de este proceso se obtienen dos productos finales de la sangre inicial:
Plasma y Corpsculos de sangre.

Instalacin de recogida y separacin de sangre

METODOLOGIA
IDENTIFICACIN, CUANTIFICACIN Y MANTENIMIENTO DEL
MICROORGANISMO EN CEPA PURA.
El medio de mantenimiento para la familia lactobacillaceae y por ende del
Lactobacillus de Lactobacillus Delbrueckii Bulgaricus es el agar y el caldo MRS.
El agar MRS provee un medio que pudiera evidenciar un buen crecimiento del
lactobacilos y bacterias acido lcticas. Su fundamento es permitir un abundante
desarrollo de especies de lactobacilos. La peptona y glucosa constituye la fuente la
nitrgeno, carbono y de otros elementos necesarios para el crecimiento.

Caldo M.R.S

FORMULA (GRAMOS*LITRO) INSTRUCCIONES

Proteosa peptona num3 10.0
Extracto de carne 8.0
Extracto de levadura 4.0 Suspender 64 g del
Glucosa 20.0 medio en 1 l de agua
Monoleato de sorbitan 1 ml destilada, reposar 5 min y
Fosfato di potsico 2.0 mezclar calentando a
Acetato de sodio 5.0 ebullicin durante 1 a 2
Citrato de amonio 2.0 min. Esterilizar en
Sulfato de magnesio 0.2 autoclave durante 15 min
Sulfato de manganeso 0.05 a 121C
agar 13.0
pH final: 6.4 +- 0.2

MODO DE SIEMBRA
1. Realiza Liofilizado

2. Siembra de cultivo

0.5 g de liofilizado
50 ml de caldo MRS

3. incubacin
48 c durante 24 horas

4. Duplicado Cada tercer da

La adaptacin del microorganismo al medio de fermentacin se da en forma

gradual, usando un medio de adaptacin ya que es el encargado de pasar a los
microorganismos del medio de mantenimiento a un nuevo medio de caractersticas
diferentes.

MEDIO DE FERMENTACIN

COMPOSICION GENERAL DEL MEDIO DE FERMENTACION

SUSTANCIAS REGULADORAS DE PH CARBONATO DE CALCIO.
1. Preparacin de medio de fermentacin

FUENTE DE CARBONO SACAROSA DE 6% AL 12%(P/v)

FUENTE DE NITROGENO SUERO DE SANGRE DE RES 20%
TIAMINA TIAMINA 0.005%
AGUA DESTILADA C.S.P. 1 L.

2. Esterilizacin del medio

3. Inoculacin
se inocula este medio de adaptacin con 1%, 1.5%, 2% y 2.5% Estos sustratos son
inoculados con el micoorganismo, en campana de flujo laminar
4. incubar
Se incuba durante 120 horas a 48c

Para la cual es necesario tener en cuenta dos factores:

A) concentracin del inoculo de 1,0% a 2.5%(v/v)
B) concentracin de las fuentes de carbono y de nitrgeno es el medio
fermentable.
5. cuantificacin del microorganismo
a) siembra en superficie
b) peso seco
Del segundo factor se toma como fuente de carbono la sacarosa no refinada (cruda)
en concentraciones que van de 6% al 12%(p/v). Ya que la sacarosa no debe ser
menor del 5% porque es improductivo e insuficiente para el crecimiento del
microorganismo y no ms del 18% por que causa inhibicin del crecimiento, debido
al aumento de la presin osmtica. La fuente de nitrgeno debe permanecer
constante y no menor del 20% en (p/v), para llevar una fermentacin eficiente. Al
sustrato se le adiciona tiamina en una proporcin de 0.005% pues es un
requerimiento vital para su crecimiento.
MTODO DE ANLISIS DE LA CINTICA DE FERMENTACIN
Para la valoracin de la cintica de crecimiento del Lactobacillus Delbrueckii
Bulgaricus en la fermentacin se realiza determinacin de azcar, biomasa y
produccin de cido lctico
Observaciones
La toma de la muestra se realizar cada 12 horas, debido a que la fermentacin es
lenta y no sera cuantitativo tomar muestras en tiempos ms cortos.
Procedimiento del anlisis de determinacin de azcar se realiz por el mtodo de
o-toluidina, el cual se basa en la formacin de un complejo base de schiff entre el
aldehdo y la o-toluidina. La formacin es medida espectrofotometricamente a 635
nm

PROCEDIMIENTO DEL MTODO DE O-TOLUIDINA

Material y reactivos
Disuelva 1.5 gramos de tiourea (grado reactivo) en 500 ml de cido lctico glacial
(grado reactivo) contenido en un matraz aforado de un litro. Agregar 50 ml de o-
toluidina y complete a un litro con acrobtico glacial. Mezcle la solucin y conserve
a una temperatura ambiente en un frasco mbar.
Patrn de glucosa de reserva ( 10 Mg/ml)
Disuelva en un matraz aforado de 100 ml un gramo (1.000g) de glucosa ahora (
Q.P) en una solucin acuosa de cido benfico (0.2 g/dl)
Patrn de glucosa de trabajo
Diluya apropiadamente el patrn de reserva para obtener los distintos valores
deseados en la calibracin o para los controles diarios ( una dilucin 1:10 del patrn
de reserva proporcionar un patrn de trabajo de 100 Mg/dl)
Procedimiento
* coloque 5 ml de reactivo de o-toluidina en un tubo de rosca de 25 ml
* agregue 0.1 ml de suero y cierre flojamente con un tapn adecuado
* coloque los tubos en bao de agua de 95c a 100c por 10 min
* enfre por 2 a 3 min en agua del tubo
* lea a una longitud de onda dd 635 nm con una cerillas de 12 mm de dimetro
previo ajuste a cero de absorbancia con blanco de reactivos utilizando agua en lugar
de muestra
Calibracin
Para establecer la curva de calibracin recomendamos determinar los siguientes
puntos: 50,100,200,300 y 500 mg/dl.
Con las concentraciones de ms de 350 mg/dl se obtiene absorbentes de las de 1.0
Clculos
la concentracin de glucosa en las muestras se calcula a partir de las siguientes
expresin
Glucosa (mg/dl) = absorbancia de la muestra / absorbancia del patrn *
concentracin del patrn
La concentracin del patrn usado en este trabajo fue de 100 mg/dl
Los mg/dl de glucosa se puede obtener tambin haciendo uso de la curva de
calibracin

DETERMINACIN DE BIOMASA POR PESO SECO

Se realiza tomando un medio de cultivo en donde se ha sembrado el
microorganismo, este medio de volumen conocido se filtra mediante un papel filtro
de 0.22 micras de dimetro de poro, la cual es calcinada hasta peso constante, con
est dato se realiza una curva para las determinaciones posteriores de nmadas
por densidad ptica
Procedimiento
* medir 100 ml de medio de cultivo en donde se ha sembrado el microorganismo
* se filtra en un crisol al vaco en un papel filtro de 0.22 micras
* introducir el crisol con el residuo en la mucha y calentar 4 horas de 520 c a 550 c
* posteriormente se pasa al desecador durante 1 hora y pesar
* repetir la operacin de calibracin y enfriamiento hasta peso constante
* calcular el contenido de cenizas por medio de la sig ecuacin
% de cenizas = ( p3-p1)/(p2-p1)*100
P1 peso del crisol slo
P2 peso del crisol con muestra
P3

DETERMINACIN DE CIDO LCTICO

*UTILIZANDO EL METODO DE VALORACIN CON NaOH 0.1 N
RESULTADOS
Identificacin del microorganismo
Al realizar observaciones microscpicas con tincin de Gram Lactobacillus
delbrueckii Bulgaricus en medio liquido y solido de la cepa pura y del inoculo a
utilizar en las fermentaciones se comprob la identidad del vacilo por las
caractersticas microscpicas que presenta: bacilo no esporulados, largo, simple y
en cadenas Gram positivo y por las caractersticas macroscpicas observadas en
cuanto a : tamao de 1 a 3 mm, forma circular, aspecto untuoso, color blanco crema,
borte dentado, elevacin plana, caractersticas comunes en inoculo de sembrado
en medio slido como en la cepa pura coincidiendo con las caractersticas
reportadas .

Resultados
ADAPATACION DEL MICROOSGANISMO con el medio M.R.S
La adaptacin Lactobacillus delbrueckii Bulgaricus se realiza como se describi
anteriormente, obteniendo los siguientes resultados
Tabla 1 inoculo de 10% T= 48C pH 5.5 -6.0
Tiempo Crecimiento
18 horas ++
24 horas +++
35 +++

Se observa que en el medio de adaptacin presenta un buen crecimiento el

microorganismo a las 24 horas bajo las condiciones establecidas de pH y
temperatura
CUANTIFICACIN DEL MICROORGANISMO
Despus de haber adaptado el microorganismo al nuevo medio de crecimiento se
procede a cuantificarlo.
Tabla 2. Cuantificacin del microorganismo
 Dilucin
U.F.C.
Vertido Superficie
10-5 >300 >300
10-7 >300 >300
10-9 287 >300
10-11 150 269
10-13 <30 176
10-15 <30 <30

Como se ve en la tabla No 2 la mejor dilucin corresponde a 10-11 en donde la

poblacin cuantificable esta entre 30 y 300 u.f.c. que es lo recomendado. En esta
dilucin se determin el peso seco y se realizaron diluciones para construir la curva
patrn.
En la tabla No 3 se relacionan las cantidades de sacarosa, tiamina y protena en
relacin al porcentaje de inoculo adicionado en cada de las 16 fermentaciones.

Tabla 3 composicin de los medios y fermentacin a realizar

Numero Concentracin Porcentaje de Porcentaje de Porcentaje de
fermentacin de sacarosa inoculo tiamina protena
1 60 1.0 0.005 20
2 80 1.0 0.005 20
3 100 1.0 0.005 20
4 120 1.0 0.005 20
5 60 1.5 0.005 20
6 80 1.5 0.005 20
7 100 1.5 0.005 20
8 120 1.5 0.005 20
9 60 2.0 0.005 20
10 80 2.0 0.005 20
11 100 2.0 0.005 20
12 120 2.0 0.005 20
13 60 2.5 0.005 20
14 80 2.5 0.005 20
15 100 2.5 0.005 20
16 120 2.5 0.005 20

Se parti de sustancias de un porcentaje de pureza determinado, no de reactivos

puros. En el caso de la sacarosa se utiliz un mismo lote para surtir todos los
balones de fermentacin, mientras que el suero de sangre de res , se tom de varias
reces, se reuni en un solo lote y se analiz la calidad de protena total.
CURVA CINTICA DE FORMACIN DE CIDO LCTICO
Para evaluar la cintica de formacin de cido lctico usaremos el modelo matemtico
luedekimg y piret
El por qu utilizamos esta ecuacin es para determinar el rendimiento de sustrato en la
biomasa. Utilizando la ecuacin de:
B= (P (t)-Pe)/ (Xf*(t-to).

Bibliografa
http://www.britanialab.com/productos/413_hoja_tecnica_es.pdf

http://www.eis.uva.es/~biopolimeros/alberto/acido_lactico.htm
http://www.bibliociencias.cu/gsdl/collect/libros/import/Actividad_Probiotica_Antimicrobi
ana.pdf
http://www.engormix.com/MA-balanceados/formulacion/articulos/proceso-artesanal-
produccion-harina-t1833/800-p0.htm
http://repository.lasalle.edu.co/bitstream/handle/10185/15765/T43.07%20B419a.pdf?se
quence=1
http://rccp.udea.edu.co/index.php/ojs/article/view/585/530