Prctica de laboratorio.

Extraccin de ADN a partir de una muestra sangunea, 1

Reaccin en cadena de polimerasa y electroforesis.Integrantes del equipo: *Lizbeth Chicas
Martnez *Ambar Muoz Ramrez *Javier Snchez Llanes

Introduccin

La sangre se compone principalmente de dos tipos de clulas, glbulos rojos (en su mayora) y glbulos blancos. Los
primeros resultan carentes de ncleo, por lo que no poseen ADN, mientras que las segundas si poseen ncleo. Para lograr la
extraccin del ADN es necesario deshacernos de las clulas rojas, y lograr quedarnos nicamente con las clulas blancas,
de los cuales se extraern los cidos nucleicos.

Para lograr la extraccin de ADN a partir de una muestra de sangre intravenosa, es necesario romper las barreras celulares
que lo mantienen encapsulado y dificultan llegar hasta l. Tal finalidad puede ser lograda a partir de diversos mtodos.

El mtodo utilizado para esta prctica se conoce como Mtodo Salting out, el cual logra conseguir la extraccin del ADN,
a partir de detergentes, sales y etanol que funcionan como elementos que permiten romper y deshacerse de componentes
lpidos y proteicos que recubren la membrana y el ncleo de las clulas.

Reactivos:

Solucin Lisis Tris-Triton (Lisis I)

Solucin isotnica de NaCl (0.85%)
Solucin de Lisis astringente (Lisis II)
Solucin de NaCl 5.3ml (precipita protenas)
Etanol absoluto al 70%

Material:

Puntas p/micropipeta 200ul

Puntas p/micropipeta 1000ul
Dos tubos Eppendorf
Tubo de centrifuga de 1.5ml de capacidad
Gasas

Equipo

Centrifuga clnica
Micro centrifuga
Incubadora
Micropipeta 40-200ul
Micropipeta 100-1000

Procedimiento:

1. Colocar en un tubo Eppendorf 650 ml de Boffer y 650 ml de lisis I, esta romper la membrana celular.
Mezclar por inversin hasta despegar el botn, para que la lisis I rompa las membranas en todas las clulas.
2. Centrifugar a 2500 rpm durante 10 minutos. El material quedar abajo, y es aqu donde se encuentran los ncleos
que sern utilizados.
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Reaccin en cadena de polimerasa y electroforesis.Integrantes del equipo: *Lizbeth Chicas
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3. Decantar. Abrir el tubo y en una gasa colocar el exceso. Y as dejar el ncleo en el tubo Eppendorf.
4. Resuspensin. Consiste en meter y sacar con pipeta, y movimientos suaves, el botn en 500 l de solucin de lisis
II, para romper los ncleos celulares y lograr llegar al ADN.
5. Centrifugar a 10 000 rpm por 1 minuto. Tiene que haber equilibrio en la centrifugadora. Si el botn no es rosado
hay que repetir el procedimiento, ya que quiere decir que no se rompieron las membranas.
6. Volver a agregar la lisis II a 250 l. Para romper la membrana nuclear. Y volver a centrifugar.
7. Precipitar con sales. Agregar 85 l de solucin de precipitacin de protenas, para que las histonas suelten el
material gentico. Esto para lograr que los elementos que hacen que el ADN se mantenga empaquetado se
separen.
8. Incubar durante 15 minutos a 60 C.
9. Centrifugar la muestra a 14 000 rpm durante 5 minutos. Tratar con delicadeza el tubo para no desprender el
material gentico. Esta nueva muestra se pasara a tubos nuevos.
10. Deshidratar, para que la molcula se vuelva a empaquetar y la podamos observar. Se agrega alcohol fro
lentamente.
11. Traspasar el sobrante a un tubo limpio y aadir 500 l de etanol absoluto.
12. Mezclar por inversin cuidadosamente hasta que se observe la madeja de ADN.
13. Centrifugar a 10 000 rpm durante 1 minuto. Se podr visualizar.
14. Tirar y agregar 500 l de etanol al 70%. Mezclar por inversin. Deshidratar por segunda vez.
15. Centrifugar a 10 000 rpm durante 1 minuto.
16. Dejar reposar con etanol al 70% por ms de 8 horas.

EL PRINCIPIO DE LA ELECTROFORESIS DE ADN EN GELES DE AGAROSA

La electroforesis separa molculas travs del sometimiento de cargas elctricas y friccin, para este principio es necesario
comprender que el ADN posee una carga negativa debido a sus grupos de fosfatos, por lo que cuando es sometido a un
campo elctrico, se mover de su lado negativo hacia un polo positivo, tal como lo postulan los principios del magnetismo,
en el que polos opuestos resultan atrados. Otro aspecto importante es la agarosa, que es un polmero que cuando se
consolida forma una malla tridimensional, por lo que el movimiento de las molculas de ADN (de polo negativo) se
desplaza a travs de dicha malla en direccin al polo positivo, permitiendo que las grandes molculas se desplacen ms
lento que las de menor tamao, y as permita que se separe. Los geles de agarosa corren de forma horizontal, por lo que para
analizar las muestras es necesario colocarlas en los pocillos alineados, y al inducir el campo elctrico las muestras saldrn
de los pocillos y se movern a travs del gel en direccin del polo positivo.

Para lograr que ste procedimiento se realice en condiciones ptimas, y la muestra fluya de manera uniforme a travs del
gel, se utilizan dos tipos de buffer: el primero posee una alta densidad que permite que la muestra depositada en el pocillo
permanezca en el fondo pero tambin posee colorantes que permiten saber en qu momento detener la electroforesis antes
de que las molculas se salgan del gel en su camino hacia el polo positivo; mientras que el segundo (buffer TBE) permite
que el campo elctrico fluya hacia el lado positivo de la cama, es decir, a travs del gel, este es aadido en la cama de
electroforesis donde quedar sumergido el gel e inhibe a las nucleasas y mantiene a las muestras en un pH ptimo.

Otro elemento utilizado fue el bromuro de etidio, el cual es utilizado como colorante, ste se intercala entre las bases
nitrogenadas, y se ilumina al ser sometido a luz UV.
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Reactivos

Buffer TBE 0.5 x

3.2 gr de Agaroza
Solcin de Bromuro de etidio 10 mg/ml
Marcador de peso molecular
Buffer de carga

Equipo

Cmara de electroforesis y accesorios

- Peine, Molde para gel y Cables para conectar a una fuente elctrica
Transluminador
Balanza
Fotodocumentador
Potenciometro
Microndas

Reaccin en cadena de polimerasa

Durante este procedimiento se espera multiplicar exponencialmente la cantidad de regiones de ADN, para poder hacerla
visible en un gel de Agarosa, esto es logrado a travs de tres principales pasos:

1. Desnaturalizacin.
Consiste en separar la doble hlice del ADN, para permitir que los Primers se peguen en la regin deseada, lo cual
sucede sometindolo a una temperatura de 94 C.
2. Alineamiento.
Aqu se alcanza la temperatura Melting que es necesaria para mantener la doble hlice desnaturalizada a un 50%,
esta temperatura depender de la cantidad de enlaces que se tienen que romper, por lo tanto es indispensable
conocer bien el nmero de pares de bases de la regin que se va a amplificar as como el porcentaje de
nucletidos.
3. Extensin.
Se lleva acabo a 72C el ADN polimerasa, e inicia a trabajar y genera una cadena complementaria a partir del
primer.

Elementos necesarios para realizar una PCR

1. Muestra de ADN
2. Agua destilada (modo molecular), 12 l por muestra.
3. Se agrega el buffer, 2.55 l.
4. Del Taq polimerasa (Star taq) agregar 0.5 l.
5. dNTPs, son los nucletidos complementarios que ayudan a construir la nueva cadena de DNA, se agrega 0.5 l.
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6. Se agrega la muestra de ADN, 2 l.

7. Para iniciar con el proceso de desnaturalizacin se inician ciclos donde se aumenta la temperatura de la muestra.
Ciclos de desnaturalizacin inicial.
10 minutos a 95 C
30 segundos a 95 C
30 segundos a 52C
90 segundos a 72 C. Ciclo que se repite durante 20 minutos.
Elongacin final 10 minutos a 72 C
Conservacin a 4 C

Procedimiento

Colocar las ligas en el borde de la base del molde para el gel y mojarlas con agua, antes de colocar dentro del
molde y nivelar con ayuda de los tornillos de la base.
Colocar 200 ml de Buffer TBE 0.5x en un matraz de 500 ml, agregar 3.2 gr de Agarosa y calentar por 3
minutos en un microondas.
Concluido el tiempo de calentamiento retirar el matraz del microondas con cuidado verificar que la Agarosa
est totalmente disuelta.
Agregar 3.8 l de Bromuro de etidio al gel de Agarosa y girar con cuidado de no hacer burbujas.
Vaciar el contenido en el molde e inmediatamente colocar los peines y esperar que el gel polimerice.
Agregar el Buffer de carga a la mezcla que ha salido del PCR, de manera que quede a una concentracin 1x.
Retirar los peines y sacar el molde con el gel.
Introducirlo en la cmara de electroforesis con Buffer TBE 0.5x, hasta la medida necesaria.
Dispensar la muestra dentro de los pozos correspondientes.
Tapar la cmara y comenzar el flujo de corriente elctrica.
Sacar el gel y colocarlo en el transluminador y capturarlo con una fotografa digital o fotodocumentador.

Conclusiones

Fotografa 1: Muestra los resultados de electroforesis obtenidos en la prctica

La prctica nos permiti conocer y comprender los procedimientos necesarios para a extraccin de ADN a partir de la
sangre, as como la metodologa y procedimientos de laboratorio necesarios para la lograr la reaccin en cadena de
polimerasa y lograr separar la molculas de ADN a travs de la electroforesis. En nuestra prctica no fueron utilizados
primers especficos, por lo que nicamente logramos observar el alineamiento de las molculas del ADN que se
posicionaron hacia la carga positiva. Por otra parte solo algunas de las muestras extradas en la prctica lograron ser
visualizadas en la electroforesis, por lo que no pudimos inferir ms all de las bandas observadas. Sin embargo logramos as
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conocer algunas de las normativas de laboratorio que se aplican en este tipo de mtodos y tcnicas, que siempre y cuando
realizndolas de acuerdo a las normativas y metodologas necesarias nos permitir obtener los resultados deseados.