Prepara tubos segn tapar con parafilm y

Rotular 4 tubos A-B-C-D Bao de maria - 37 * 1h

cuadro mezclar invesin

Separar en grupos: +2ml solucin cido

DETERMINACIN DE Centrifugar tubos a 2500
A y B= 1 (piruvatos); C y tricloroacetico 10%, a
PIRUVATO RPM
D= 2 (acetaldehido) c/tubo. Mezclar

Separar 4 ml del Separar 4 ml del DETERMINACIN DE Tubo A1 y B1 + 1 ml 2,4-

sobrenadante tubo A y sobrenadante tubo B y PIRUVATO CON 2,4- dinitrofenilhidrazina.
dividir 2 ml en c/tubo dividir 2 ml en c/tubo DINITROFENILHIDRAZINA Mezclar con fuerza.

+ 2-3 gtsen tubo -> +1 ml DETERMINACIN DE

solucion de hidroxido de Rojo = presencia de PIRUVATO CON Tubo A2 y B2 en bao de
sodio (100g/L). dliuir piruvato NITROPRUSIATO DE maria * 10 min.
hasta 5 ml. SODIO

dejar enfriar y + 1g agregar 2 gts de Mezclar dejar resbalar

anillo verde, azul o rojo
sulfato de amonio solido nitroprusiato de sodio por las paredes,
=piruvato
y mezclar (50g/L). amoniaco [].

tomar 2 ml del
FORMACIN DE + 2ml nitroprusiato de
Centrifugar tubos C y D, sobrenadante de c/tubo
ACETALDEHIDO A PARTIR sodio; 2 ml de piperidina
10-15 min 2500 RPM. y colcarlo en tubo
DE GLUCOSA acuosa. Agitar
rotulado C1 y D1.

azul=acetaldehido
Cuestionario

1. Explique la razn por la cual, en condiciones normales, no se detectan metabolitos

intermediarios
Debido a que los metabolitos intermediarios pueden ser degradados no sola por la ruta
metablica sino que por rutas secundarias (Williams. 1993).
2. En qu se basa la determinacin de piruvato mediante nitroprusiato de sodio? Explique
Es un agente que atrapa el intermediario de piruvato acumulado formando un compuesto
que no puede metabolizarse. El nitroprusiato de sodio detecta grupos citnicos como el
presente en el piruvato (Voet, 2009).
3. Por qu razn emplea la 2,4-dinitrofenilhidrazina para determinar el piruvato?
Porque el 2,4- DNFH puede utilizarse para distinguir entre diversos compuestos con grupo
carbonilo, puede utilizarse para detectar grupos citnicos como el presente en el piruvato
(Voet, 2009).
4. Investigue un mtodo (diferente a los utilizados en esta prctica) para determinar
metabolitos intermediarios en la glucolisis y descrbalo brevemente.
Analisis de metabolitos intermediarios por cromatografa liquida acoplada a
espectrofotometra de masas tndem, (Lc-Ms/ Ms) es una metodologa analtica de elevada
selectividad y sensibilidad. Los metabolitos son marcados isotpicamente (Ferrier y Albiol,
2008).
5. Explique la razn por la cual, en la determinacin de piruvato, la solucin de levadura se
prepara en medio cido alcalino. Qu diferencias espera encontrar en dichas
condiciones?
La enzima piruvato deshidrogenasa es la responsable de catalizar el piruvato, pero esta
enzima no es activa en soluciones ligeramente alcalinas por lo cual el piruvato se acumula
(Williams, 1993).
6. Qu funcin ejerce el sulfito de sodio? Explique
La acumulacin de acetaldehido se logra al adicionar el sulfito de sodio, este agente
acompleja el acetaldehdo formando un producto bisulfito de adicin soluble en agua. El
acetal es regenerado por tratamiento cido o base y es identificado hacindolo reaccionar
con un agente especfico para formar un producto coloreado (Voet, 2009).
7. Invetigacin

REFERENCIAS
Ferrer, P. y Albiol, J. (2008). Anlisis cuantitativo y Modelizacin del Metabolismo de la
Levadura Pichia paasturis (Tesis doctorado, Universidad Autonoma de Barcelona).
Recuperado de: www. Tdx.cat/bitstream/handle/10-203/5324/55j`de`.pdf
Voet, D. (2009). Bioqumica. Argentina: Medica Panamericana
Williams, H. (1993). Medica interna (2 ed). Espaa: Medica panamericana