LABORATORIO DE BIOQUIMICA I MACROMOLECULAS UNIVERSIDAD DEL CAUCA FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES, EXACTAS ¥ DE LA EDUCACION DEPARTAMENTO DE QUIMICA Practica #5: Actividad de la amilasa salival 1. INTRODUCCION: Se llaman enzimas a las proteinas especificas que poseen funcién caialitica: Mediante el uso de los enzimas puede verificarse numerosos procesos quimicos, que en conjunto constituyen la esencia de! metabolismo. Influyendo en la velocidad de las reacciones metabolicas, los enzimas son capaces de regular efectivamente los procesos vitales: Similarmente a los catalizadores inorganicos, ios enzimas aumentan la velocidad de lac reacciones quimicas a cuenta de la disminucién de la energia de activacion, Sin embargo, estos catalizadores biolégicos, poseen mayor eficiencia en la disminucion de dichd energia y, como regia general, desempefian su funcién, a una temperatura moderada, Presion baja y condiciones de pH cercanas al neutro. Los enzimas son sensibles a lac Natiaciones de las condiciones del medio en el que estén cumpliendo su funcién y tienen una Serie de particularidades relacionadas a su naturaleza proteinica: su especificidad, Sensibilidad al cambio de la temperatura y el pH del medio asi como a la presencia de los activadores e inhibidores La actividad catalitica de los enzimas, esta relacionada con la presencia en su molécula de regiones especiales responsables de la fijacion y la activacion del sustrato: el centro de facion del sustrato y el centro activo. Ambos consisten en una combinacién unica de los restos de amincacidos de la cadena polipeptidica situados a larga distancia el uno del otro. Al acercarse dan lugar a un centro catalitico en los que participan también componentes no proteinicos afines a la regidn activa de la enzima. Cualquier influencia exterior que altere la formacién nativa de la molécula de proteina contribuye a la inactivacién de su la actividad catalitica. Entre los factores que afectan la actividad enzimatica se pueden citar los siguientes: Labilidad térmica La temperatura de! medio influye mucho en la actividad de los enzimas. El rango de temperatura Optima para la accién de los enzimas es la temperatura corporal de los animales que oscila entre 36°C y 41°C. Con cierto aumento de la temperatura del ambiente intemo 0 externo ocurre aceleracién de la reaccién enzimatica por activacion en las"moléculas del sustrato, pero a la vez, se produce un debilitamiento por temperatura de los enlaces que mantienen al enzima en su conformacién activa, La desnaturalizacion del enzima comienza y se acelera cuando se sobrepasan los 50°C de temperatura. Este proceso es irreversible al contrario de la inactivacién producida por el enfriamiento. Influencia del pH sobre la actividad Para cada enzima existe un valor éptimo de pH que aporta las condiciones mas favorables para el mantenimiento de la conformacién funcionalmente activa de la molécula. Ya que se consigue la formacién de iones en los grupos amino y carboxilo en los aminodcidos que conforman la molécula del enzima, que participan en el mantenimiento de la conformacién de la molécula proteinica necesaria para la formacién de los centros cataliticos. Especificidad de los Enzima Los enzimas a diferencia de los catalizadores inorgénicos tienen una especificidad muy alta, Inicialmente se forma un complejo enzima-sustrato, en donde la molécula de sustrate Se liga _con el centro activo del enzima, existe aqui una correspondencia geométrica Elaborado por Revisado por ‘Aprobada por Foca | _Aprobacien: r. Ricardo Benitez Or. icarco Benitez Prestente Comié Tecnica Dr. Luis Alberto Lenis Responsable del area ‘Ambiental Mag. Ettén Giraldo Comité ce Plan del Dpto de Quimica Comité de Desactivacin de Residues OuimicosLABORATORIO DE BIOQUIMICA I MACROMOLECULAS UNIVERSIDAD DEL CAUCA FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES, EXACTAS Y DE LA EDUCACION DEPARTAMENTO DE QUIMICA exacta entre la molécula del enzima y la molécula de sustrato, por lo que la accién catalitica del enzima solo puede darse en estos casos. La actividad enzimatica entonces consiste en el hecho de que el sustrato corresponde al enzima como una liave a una cerradura : : Influencia de los activadores e inhibidores La actividad de los enzimas esta regulada tanto en el medio celular como fuera de él, por una serie de diferentes tipos de sustancias de bajo peso molecular que actian sobre la enzima. Tales sustancias pueden causar efectos activadores, siendo capaces de adicionarse a la molécula de precursor no activo, y cambiar la conformacién dando lugar a la formacién del compuesto que posee actividad. Esta actividad se asocia con iones de metales y algunos aniones. Algunos agentes muestran una actividad depresiva de la actividad por lo que se denominan inhibidores, pueden alterar la conformacion de la enzima fijéndose a un centro alostérico, pueden ser sales inorganicas, metabolitos u hormonas. 2. OBJETIVO Determinar la actividad enzimatica de la amilasa sobre diferentes tipos de sustrato y bajo diferentes condiciones. 3. CONSULTAS PRELIMINARES 3.1 {Bajo qué condiciones se puede desnaturalizar un enzima? Indique algunos ejemplos especificos. 3.2 {Qué son los enzimas protedliticos? 3.3 ZQué tipo de funcién desarrollan los inhibidores y activadores? De algunos ejemplos especificos de estas sustancias. 3.4 {Qué condiciones generan la inactivacién reversible de un enzima? 3.5 Consulte el significado de las frases R y S para los reactivos a usar en la practica, inférmese de los riesgos de las sustancias consultando las fichas de seguridad. 4. MATERIALES Tubo de ensayo ite Vaso de 100 mL 2 Vaso de 250 mL. 1 Pipeta de 5mL graduada 2 | Pipeta de 2mL graduada 2: Termémetro de 100°C 1 Varilla de vidrio 1 Pinza de madera 2 4 ff ‘il a Gotero Gradilla, Mechero Placa de calentamiento ‘Aprebada por Facade laborado por Feevisado por Aprobacéa: Or, Ricardo Benilez Dr. Ricardo Benitez Present Comile Taco Dr. Luis Alberto Lenis ~ Responsable del érea Ambiental Mag. Etén Girakdo Comité de Pan dal Opto de Quimica Comité de Oesactvacion de Residues QuimicosLABORATORIO DE BIOQUiMICA I MACROMOLECULAS UNIVERSIDAD DEL CAUCA FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES, EXACTAS Y DE LA EDUCACION DEPARTAMENTO DE QUIMICA ae REACTIVOS RELaAET | 25 mL ‘Almidén al 1% "7 700 mi Saliva diluida Reactive de Lugol Smt Fosfato sédico disustituido (NasHPO.), 0,2M. solucion A Acido citrico (CsHsOr-H-0). Solucion 8.(A36,S24/25) Soluciones amortiguadoras ™7 | pH 5: pH 6.8: pH 8.0; 25ml. clu Solucién al 2% de sacarosa CzHzOu 1OmL. Reactivo de Fehling A+ 87 1omt. ‘Solucién de sacarasa ™ Cloruro de sodio al 1% omit Sullato ciprico al 1% (R22-36/38, S22) Tom. [1] Debe enjuagarse la boca con agua destilada. Al tomar en la boca de 20 a 25 mL de agua, ésla se colecta en un vaso de precipitados. [2] Disolver 1g de almidén (CsHio0s)n en 15mL de agua fria, adicionar los restantes 75mL._ de agua hirviendo, agitar hasta homogenizar. [3] pH 5: 515mL de sin A con 485ml de sin B. pH 6.8: 72,5mL de sin Acon 227 mL de solucién B. pH 8.0: 972.5mL de sin A con 27.5 mL de sin B. [4] Para realizar el reactivo deben realizarse mezclas iguales de A y B: Fehling A: En SOOmL de gua disolver 34,639g de sulfato de cobre (CuSOx) + tml de H2SOs 1M, Fehling B: En 500mL de agua disolver 1739 de tartrato de sodio y potasio NaKCsH«Os-4Hz0 + 50g de NaOH. CuSO. (A22-36/38, $22) H2SO. (R35, S26-30-45) NaOH (R35, $26-37/39-45) [5] Homogenizar 0,25q de levadura en SOmL de agua. NOTA: Los volimenes de los reactivos estén calculados sélo para siete grupos. Remitirse al manual de riesgo y seguridad y fichas técnicas de seguridad para mayor informacién sobre las reactivos. 6. EQUIPOS* ER Plancha de calentamiento 1 Bafio termostatado (37°C) 1 Vortex (agitador mecanico) 1 *Remilirse al manual de protocolo y calibracion de equipos. 7. METODOLOGIA 7.1 Labilidad térmica de los enzimas + Verter en tres tubos de ensayo numerados (1,2 y 3) 1mL de saliva diluida (amilasa); la saliva en el tubo de ensayo 1 deberd hervirse durante 1 0 2 minutos. + En todos los tubos de ensayo, afiadir 2mL de solucién de almidén. Mezclar en el vortex. Los tubos 1 y 2 se mantienen en un bafio termostatado a 37°C por 10 minutos. El tubo ntimero 3 se lleva 0°C por el mismo periodo de tiempo. * Al transcurrir los 10 minutos, se afiade una gota de Lugol a cada tubo de ensayo. Los datos se deben registrar en la tabla correspondiente a la labilidad térmica. Elaborate por Ravisado por probada por Fecha de Aprobacn: De Ricaroo Benen Or Reade Boner Presdenie Conia Temeo Or. Luis Abert Lenis Responsable del dea ‘Anes Mag, Elen Gira Comité de lan del Dpto de Quimica Comité de Oesactvacién de Residuos OuimiensLABORATORIO DE BIOQUIMICA I MACROMOLECULAS UNIVERSIDAD DEL CAUCA FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES, EXACTAS Y DE LA EDUCACION DEPARTAMENTO DE QUIMICA 7.2 Influencia del pH sobre la actividad de los enzimas + Verter 2mL de las soluciones amortiguadoras de distinto pH (5.0; 6.8; 8.0) en tres tubos de ensayo y afiadir a cada uno tml de saliva diluida (amilasa) y 2mL de almidén. + Mezclar (en el vortex) e incubar los tubos a 37°C durante 10 minutos. + Después de transcurrido éste tiempo, afiadir a cada tubo una gota de reactivo de Lugol. Anotar los resultados y observaciones en la tabla anexa correspondiente al efecto del pH. 7.3 Especificidad de un Enzima + Numerar cuatro tubos de ensayo, verter 2mL de solucidn de almidén en los tubos de ensayo 1 y 2. Enlos tubos de ensayo 3 y 4 adicionar 2mL de solucién de sacarosa. + Afadir Im de saliva diluida (amilasa) en los tubos de ensayo ty 3, en los tubos de ensayo 2y 4 afadir imL de solucion de sacarasa. * Mezclar en el vortex, e incubar todos los tubos de ensayo en el termostato a 37°C por diez minutos. + Después de los 10minutos de incubacién, afadir una gota de reactivo de Lugol en los tubos de ensayo 1 y 2, y en los tubos de ensayo 3 y 4 adicionar 0.5mL de reactivo de Fehling. * Los tubos a los que se adiciond la solucién de Fehling, se deben calentar por 10 minutos hasta ebullicion. Anotar los resultados en la tabla anexa correspondiente a especificidad de los enzimas. 7.4 Influencia de los activadores e inhibidores * Numerar dos tubos de ensayo como ty 2, afjadir a cada uno 2mL de solucién de almidén. Verter en el tubo 1 ImL de solucién de cloruro de sodio y 0,5mL de solucién de sulfato de cobre en el tubo 2. + Agregar 0,5mL. de saliva diluida en ambos tubos de ensayo, mezclar en el vortex e incubar por 10 minutos a 37°C. + Después de transcurrido el tiempo de incubacién agregar una gota de Lugol a cada uno de los tubos. Anotar los resultados de la experiencia en la tabla correspondiente a la influencia de activadores e inhibidores. 8. DATOS Y RESULTADOS Exprese sus resultados en las tablas 8.1 4 8.4 Almidon | 10 min, 37°C 2___| Amilasa | Enzima nativa Almidon_[_10 min, 37°C 3___[Amilasa | 2nzima nativa Almidon [10 min, 0°C Tiaborads por Faveato por ‘probada por Fava de i Aprobacién: De Ficardo Benitez Or Ficardo Baiez Presdente Conia Tecnico Or. Luis AbertgLenis Responsable del rea “Ambiental Mag. Eirén Giralco ‘Comité de Plan del Opto de Quimica Comité de Desactivacién de Resicuos Quimicas iLABORATORIO DE BIOQUIMICA IMACROMOLECULAS | UNIVERSIDAD DEL CAUCA FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES, EXACTAS Y DE LA EDUCACION DEPARTAMENTO DE QUIMICA 5.0_[ Almicon | 10 min, 37°C 6.8 | Almidén | 10 min, 37°C 8.0 | Almidon [ 10 min, 37°C [Amilasa = Amilasa 1_| Amilasa in| 10 min, 37°C [2__|Sacarasa | Almidén | 10 min, 37°C i | 3__| Amilasa | Sacarosa | 10 min, 37°C 1 4 | Sacarasa_[ Sacarosa | 10 min, 37°C 10 min, 37°C | 9, _ PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS 9.1 2Cual es el objetivo de usar la tincién con Lugol y en qué se fundamenta la reacciéri en general? 9.2 {Qué fin tiene el utilizar la solucién de Fehling? 9.3 {Cual es el sustrato especifico de la sacarasa, y sdbre cuales sustratos no especificos ésta podria actuar? ¢Por qué? 9.4 {Cual es la clasificacion de los enzimas, teniendo en cuenta su papel 0 funcién? 9.5 En qué consiste la nomenclatura internacional para los enzimas? Dé por lo menos dds ejemplos. 9.6 Indicar las reacciones que se llevan a cabo en cada tubo de ensayo y concluya acerca de las condiciones ideales de trabajo para el enzima. 10. __RECUPERACION, DESACTIVACION Y/O ALMACENAMIENTO TEMPORAL DE LOS RESIDUOS QUIMICOs. Fara la segregacin de todos los residuos generados por los diferentes grupos de trabajo durante la practica, se deben disponer varios recipientes grandes (vasos de precipitados 0 matraces erlenmeyer de 2L, por ejemplo) para realizar la medicin del volumen de desecho total que debe ser informado al profesor y reportado por éste. 10.1 Recuperacién : No aplica 10.2 Desactivacion No aplica Elaborate por Fewsad por Torobada por Fea de Aprobacién: Or. Ricardo Benitez Or. Ricardo Benitez Presidente Comité Técnico OF. Luis be Lenis Fesponsabie desea Ambiental Mag. Eén Girldo ‘Comité de Plan del Ooi de Ouinica Comité ve Oasactvacén de Resduos OuimicnsLABORATORIO DE BIOQUIMICA I MACROMOLECULAS, UNIVERSIDAD DEL CAUCA FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES, EXACTAS Y DE LA EDUCACION DEPARTAMENTO DE QUIMICA 10.3 Almacenamiento temporal Los residuos:generados en el procedimiento 7.1 deben depositarse en el recipiente para hidrocarburos halogenados. Los generados en el procedimiento 7.2 se deben depositar en el recipiente para acidos y bases. Los residuos del procedimiento 7.3 y 7.4 en el de metales pesados. 11. BIBLIOGRAFIA LOZANO, J. A and TUDELA, J.; “Practicas de bioquimica: Experimentacién y simulacién” ted, Editorial Sintesis, Madrid, 1989. ISBN: 84-7738-027-9. PLUMMER, D. T.; “Bioquimica practica” 2ed. Editorial Mc Graw-Hill Latinoamericana, Bogota, 1981. 1SBI 168-45 1-054-3. Elaborate por Fiavisado por, ‘Aprobada por Fecha da Aprobacn: Dr, Ricardo Benitez Or. Ricardo Benitez Presidanie Comia Técnico Or, Luis Alberto Lenss Responsable del drea ‘Ambiental Mag. Etren Giaido Comité de Pan det Opto de Quimica Comité de Oesactvaciin de Residuos Quimicos