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PRODUCCION DE

PROTEINAS EN CULTIVOS
DE E. COLI
La expresin de protenas recombinantes se ha favorecido con el uso de Escherichia coli
debido a su relativo bajo costo, alta densidad de cultivo, su fcil manipulacin gentica y a
las diversas herramientas biotecnolgicas disponibles que son compatibles. En este artculo
se presentan algunas estrategias para la expresin de Escherichia coli; se destacan
factores genticos y fisiolgicos que incluyen: nmero de copias del vector de expresin,
caractersticas del gen, estabilidad del cido ribonucleico mensajero, promotor empleado,
cepa utilizada, composicin del medio de cultivo, parmetros de operacin en el
fermentador y tambin se abordan la conservacin de cepas y la estrategia de cultivo y
purificacin.

Introduccin
La bacteria Escherichia coli (E. coli) es ampliamente utilizada en la industria biotecnolgica
para la produccin de protenas recombinantes con fines diagnsticos, teraputicos o
vacunales, por procedimientos relativamente baratos, ya que ha sido muy bien
caracterizada desde el punto de vista gentico y fisiolgico (1). Es un bacilo corto
gramnegativo que se localiza en las heces fecales; habita en el conducto intestinal normal
del hombre y de los animales y en algunos casos puede ocasionar enfermedades como:
hepatitis, septicemia, cistitis y otras (2).

Entre las ventajas que este microorganismo brinda como hospedero estn: mayor
velocidad especfica de crecimiento que las levaduras y clulas de mamferos; fcil
manipulacin gentica, no posee requerimientos costosos asociados a medios de cultivo o
equipamiento a diferencia de las clulas de organismos superiores; existencia de gran
variedad de vectores de expresin estables, y ser un microorganismo aprobado por las
entidades reguladoras para su utilizacin como hospedero en la produccin de biofrmacos
(3,4).

Es conocido que las proteasas producidas en el microorganismo pueden destruir las


protenas recombinantes obtenidas. Su empleo para producir protenas tiles en la
industria alimentaria no est permitido, segrega toxinas, por lo que se considera un
patgeno moderado; es incapaz de realizar muchas de las modificaciones
postraduccionales que son comunes en protenas de origen eucariota; no es un eficiente
secretor de protenas al medio de cultivo, es una fuente potencial de pirgenos y su
habilidad para promover la formacin correcta de numerosos puentes disulfuro es
limitada. Pese a estas desventajas, numerosas protenas complejas se obtienen en este
hospedero con la actividad biolgica requerida para ser utilizadas (5).

En las ltimas dcadas se han desarrollado cepas de E. coli modificadas genticamente


para solucionar algunas de sus desventajas. Entre ellas se encuentran varias cepas
mutantes de los genes lonA y ompT, para disminuir la degradacin proteoltica de los
productos recombinantes; tambin se han obtenido cepas deficientes, o bien de la
tioredoxina reductasa (trxB), o de la glutatin reductasa (gor), o de ambas a la vez, por lo
cual en ellas se favorece la correcta formacin de puentes disulfuro en el citoplasma. En
otras cepas desarrolladas pueden obtenerse protenas complejas, con modificaciones
postraduccionales propias de clulas eucariotas, como es el caso de las que portan el gen
de la tirosina kinasa para producir protenas fosforiladas por la tirosina (6, 7).

Para aprovechar las ventajas que ofrece el periplasma, en comparacin con el citosol, para
la expresin de protenas recombinantes se han desarrollado vectores plasmdicos en los
cuales es posible clonar los genes recombinantes fusionados a seales de secrecin que
posibilitan el transporte de la protena de inters a este compartimento (8).

Expresin de protenas recombinantes en Escherichia coli


Entre los parmetros ms importantes en la produccin exitosa de protenas
recombinantes en E. coli se encuentran: la eficiencia transcripcional y traduccional, la
estabilidad de
vector de expresin y de los cidos ribonucleicos (ARN) transcriptos, la estabilidad de las
molculas ante el ambiente proteoltico del hospedero y la localizacin y plegamiento de la
protena (3). Tambin es necesario hacer un estudio con diferentes cepas del organismo
hospedero, con vistas a seleccionar la ms adecuada para la expresin de la protena
recombinante deseada, ya que estudios muestran que esta puede variar al usar una cepa
determinada u otra (9).

Con el objetivo de alcanzar altos niveles de expresin de la protena de inters es necesario


estudiar la influencia de diferentes factores en el proceso de produccin, los cuales pueden
agruparse en genticos y fisiolgicos.
Factores genticos
Entre los factores genticos a considerar se encuentran: nmero de copias del vector de
expresin, caractersticas del gen, estabilidad del cido ribonucleico mensajero (ARNm),
promotor empleado y cepa utilizada.

Nmero de copias del vector de expresin o plasmidio

En la seleccin del sistema de expresin que permita obtener altos niveles de produccin de
la protena recombinante, un aspecto importante es el nmero de copias del vector dentro
de la cepa hospedera. El nmero de copias del plasmidio en E. coli puede variar desde 1
hasta 2 000 por clula, en dependencia de su origen de replicacin en la bacteria.
Generalmente la sntesis proteica aumenta linealmente con el nmero de copias del
plasmidio hasta aproximadamente 600 copias por clula (10). Este aumento depende de la
naturaleza de la protena y del ambiente celular, en el que se incluye el balance de
sntesis/degradacin que puede ser afectado por elevadas cargas gnicas del vector.

Por otro lado, un alto nmero de copias incrementa las complicaciones relacionadas con la
replicacin y expresin intensivas como son las mutaciones, disminucin de la estabilidad
del vector, problemas con el control de la regulacin del promotor y dificultades en la
purificacin de la protena de inters al incrementar tambin los niveles de protenas
codificadas por otros genes plasmdicos, por ejemplo, genes de resistencia a antibiticos
(11).

Caractersticas del gen heterlogo

Entre las caractersticas del gen heterlogo que pueden influir en los niveles de expresin se
menciona el uso de determinados codones especficos en el gen que son poco usados en E.
coli, denominados codones raros. Se ha observado que la presencia de estos, que codifican
el aminocido arginina en genes heterlogos, afectan considerablemente los niveles de
sntesis de la protena (12). Adems, pueden existir determinados codones,
fundamentalmente, los que codifican arginina y prolina, en los genes que favorecen el
corrimiento del marco de lectura
hasta en un 50% del total de protena sintetizada. Esto puede originar una terminacin
prematura de la sntesis de la protena recombinante o alterar completamente la informacin
gentica (11).

Otra caracterstica del gen heterlogo determinante de los niveles de expresin es la


presencia de estructuras secundarias en el ARNm, que pueden afectar el inicio de la
transcripcin y de la traduccin al bloquear la unin de la ARN polimerasa al promotor, o de
las subunidades ribosmicas al sitio de inicio de la traduccin, respectivamente (13).

Estabilidad del ARN mensajero (ARNm)

Una vez sintetizado el ARNm correspondiente al gen de inters, la estabilidad del transcripto
permite un control flexible y muy eficiente de los niveles de sntesis proteica. Por lo general
los ARNm bacterianos tienen una vida media corta. En clulas bacterianas que crecen y se
dividen cada 20 o 30 min, algunos ARNm deben renovarse de 5 a 10 veces en cada
generacin. La vida media del ARNm est regulada por el control del inicio de la
transcripcin y la velocidad de degradacin del mismo. La velocidad de degradacin de los
ARNm provenientes de algunos genes heterlogos es muy alta, siendo muy bajos o nulos los
niveles de sntesis de las protenas recombinantes (14).

Tipo de promotor bajo el cual se encuentra situado el gen de inters

El sistema de expresin es la unidad transcripcional que se inserta en un vector de cido


desoxirribonucleico (ADN) extracromosomal. Si el mismo es inducible, las clulas pueden
crecer hasta altas densidades y obtener cantidades del producto hasta de un 30% de la
protena total de la clulas (15).

Algunos de los promotores ms empleados son:

Promotor triptfano: Es el responsable de la transcripcin de los genes trpE, D, C, B, A, los


cuales codifican para las enzimas que intervienen en la sntesis del triptfano. Se reprime
por la presencia de este aminocido en el medio de cultivo y se induce por su ausencia o
al aadir cido 3-indolacrlico. Constituye un promotor fuerte y ampliamente utilizado (16,
17).
Promotor pL (Brazo izquierdo del fago lambda): Es inducible por cambios de temperatura,
ya que existe un represor termolbil que a temperaturas entre 28-30 C se une al
promotor impidiendo la transcripcin del gen. Su utilizacin ha confrontado problemas en
algunos hospederos, ya que ante un cambio sbito de temperatura, hasta
aproximadamente 42 C, el represor sufre un cambio estructural que impide su unin al
promotor, permitiendo la transcripcin y la expresin de la protena de inters (18). Este
sistema tiene dos

desventajas fundamentales: la primera, es que solamente puede ser empleado en cepas


de E. coli que contengan en su genoma el gen que codifica para el represor cI 857 del
fago lambda y, la segunda, es que al trabajar a los niveles de temperatura de induccin es
posible la degradacin de la protena heterloga. Una de las alternativas para disminuir el
efecto de la primera desventaja es el empleo de cepas comerciales que contengan el gen
del represor o cotransformar con un vector que lo incluya.
Promotor Lac (lactosa): Este promotor se reprime en presencia de glucosa y se induce en
presencia de lactosa o su anlogo isopropil-tiogalactosido (IPTG) (19). La primera puede
ser empleada solamente en cepas que contengan en su genoma los genes que codifican
para las tres enzimas involucradas en el metabolismo de la lactosa (permeasa, beta
galactosidasa y transacetilasa). IPTG es un reactivo caro, por lo que su empleo se reduce
fundamentalmente a las escalas de laboratorio y piloto.
Promotor Tac: Es un hbrido del promotor Lac y el promotor Trp y su funcin es similar a la
del promotor Lac (20).}
CEPA HOSPEDERA

Conservacin de cepas
Bancos celulares / Sistema de lotes de semilla

Los bancos de clulas son elementos fundamentales en el desarrollo y produccin de


productos biotecnolgicos, ya que constituyen los seres vivos que transforman los sustratos
y en condiciones predeterminadas llevan a cabo la sntesis del producto de inters (23).

Una de las ventajas en la produccin de biotecnolgicos/ biolgicos es la aplicacin de un


sistema de lote semilla, donde se utilizan subcultivos de clulas seriadas, las cuales tienen
una fuente de partida caracterizada y comn para cada lote de produccin. Este sistema se
utiliza para prevenir los cambios posibles de las propiedades bioqumicas y genticas que se
producen con subcultivos repetidos o de generaciones mltiples (24). Los fabricantes pueden
preparar sus propios bancos u obtenerlos de fuentes externas. Ellos son responsables de
asegurar la calidad de su preparacin y de la ejecucin de los ensayos de control.

Bancos de clulas primarias (BCP) / Bancos de reserva

La cepa hospedera, la cual es transformada con el vector de expresin, debe ser deficiente
en la mayora de las proteasas naturales, mantener la estabilidad plasmdica y contener los
elementos genticos necesarios, de acuerdo con el sistema de expresin utilizado.

Se recomienda el empleo de cepas robustas capaces de crecer en medios de cultivo con un


mnimo de nutrientes y que no sean patognicas (21).

Una vez que se han establecido los factores genticos adecuados, se debe garantizar la
estabilidad del clon productor, evitando que existan mutaciones, contaminaciones y prdida
de informacin gentica. Por lo anterior se debe garantizar una forma correcta de
conservacin del microorganismo productor. Para ello se desarrollan los bancos de clulas.

Estrategias de clonaje
A lo largo de ms de dos dcadas se han ido mejorando las estrategias genticas, con el
objetivo de aumentar los niveles de expresin de protenas, as como simplificar los procesos
de recobrado. Estas abarcan desde el diseo de vectores, multimerizacin de genes,
mejoramiento de cepas basadas en diferentes principios como la delecin de genes que
codifican para proteasas, sobreexpresin de codones raros para E. coli.

Tambin es posible adaptar la estructura de la molcula recombinante para potenciar una


propiedad especfica que facilite su purificacin, ya sea modificando su punto isoelctrico o
sus constantes de afinidad (22).
El banco de clulas primarias es una suspensin homognea de clulas iniciales ya
transformadas por el vector de expresin, almacenadas en envases individuales y en
condiciones que garanticen su estabilidad gentica.

Para llevar a cabo la preparacin de un BCP se debern realizar los pasos siguientes:
seleccionar el clon de mayor expresin; tomar el cultivo en la fase logartmica de
crecimiento; lavar las clulas, resuspender en el medio de cultivo y adicionar
crioprotectores (glicerol, dimetil-sulfxido); distribuir en viales estriles y hermticos;
almacenar las alcuotas a -70 C y mantenerlas bajo custodia y control continuo de la
temperatura. Adems, se debe trabajar en ambientes controlados, bajo gabinetes de
seguridad biolgica y evidenciar los estudios de estabilidad y de recobrado de semillas y
bancos, los cuales deben estar documentados.

Control de calidad a los bancos de clulas primarias

Para la caracterizacin de los BCP se deben realizar diferentes ensayos como: pureza
microbiana, viabilidad, anlisis de restriccin, secuencia nucleotdica del gen, estabilidad
plasmdica, reconocimiento inmunolgico, actividad biolgica y nivel de expresin de la
protena a escala de banco.

Banco de clulas de trabajo

El Banco de clulas de trabajo (BCT) se prepara a partir del BCP bajo condiciones definidas
de cultivo. Estas clulas se utilizan directamente en el proceso productivo (24). La

cantidad de viales va a depender del uso, tiempo de vida y condiciones de


almacenamiento. Cada vez que se utilice un vial, este debe ser desechado, ya que los
cambios de temperatura pueden afectar la estabilidad gentica del banco, as como
aumentar los riesgos de contaminacin.

Control de calidad a los bancos de clulas de trabajo

Para el control de los BCT se deben realizar los mismos ensayos que a los BCP, pero el nivel
de expresin de la protena se realiza a la escala productiva y se adiciona el cumplimiento
de las especificaciones de calidad del ingrediente farmacutico activo (IFA) y la integridad
de la protena (secuencia de los extremos amino y carboxilo).

En este caso se mantienen los lotes en cuarentena y se aprueban despus de la revisin


del expediente por parte de la Direccin de Aseguramiento de la Calidad. Despus de
liberados los lotes se termina el expediente del banco y se entrega al productor para su
custodia.

Se recomienda dividir los lotes de semillas y bancos celulares y almacenar las partes en
lugares diferentes, lo cual minimiza los riesgos de prdida totales de los bancos en caso de
catstrofes.
Durante la preparacin de los bancos primarios o bancos de reserva, los bancos de trabajo
o cultivos de trabajo, se debe evitar o minimizar los riesgos de contaminacin o alteracin,
El banco de clulas primarias es una suspensin homognea de clulas iniciales ya
transformadas por el vector de expresin, almacenadas en envases individuales y en
condiciones que garanticen su estabilidad gentica.

Para llevar a cabo la preparacin de un BCP se debern realizar los pasos siguientes:
seleccionar el clon de mayor expresin; tomar el cultivo en la fase logartmica de
crecimiento; lavar las clulas, resuspender en el medio de cultivo y adicionar
crioprotectores (glicerol, dimetil-sulfxido); distribuir en viales estriles y hermticos;
almacenar las alcuotas a -70 C y mantenerlas bajo custodia y control continuo de la
temperatura. Adems, se debe trabajar en ambientes controlados, bajo gabinetes de
seguridad biolgica y evidenciar los estudios de estabilidad y de recobrado de semillas y
bancos, los cuales deben estar documentados.

Control de calidad a los bancos de clulas primarias

Para la caracterizacin de los BCP se deben realizar diferentes ensayos como: pureza
microbiana, viabilidad, anlisis de restriccin, secuencia nucleotdica del gen, estabilidad
plasmdica, reconocimiento inmunolgico, actividad biolgica y nivel de expresin de la
protena a escala de banco.

Banco de clulas de trabajo

El Banco de clulas de trabajo (BCT) se prepara a partir del BCP bajo condiciones definidas
de cultivo. Estas clulas se utilizan directamente en el proceso productivo (24). La

cantidad de viales va a depender del uso, tiempo de vida y condiciones de


almacenamiento. Cada vez que se utilice un vial, este debe ser desechado, ya que los
cambios de temperatura pueden afectar la estabilidad gentica del banco, as como
aumentar los riesgos de contaminacin.

Control de calidad a los bancos de clulas de trabajo

Para el control de los BCT se deben realizar los mismos ensayos que a los BCP, pero el nivel
de expresin de la protena se realiza a la escala productiva y se adiciona el cumplimiento
de las especificaciones de calidad del ingrediente farmacutico activo (IFA) y la integridad
de la protena (secuencia de los extremos amino y carboxilo).

En este caso se mantienen los lotes en cuarentena y se aprueban despus de la revisin


del expediente por parte de la Direccin de Aseguramiento de la Calidad. Despus de
liberados los lotes se termina el expediente del banco y se entrega al productor para su
custodia.

Se recomienda dividir los lotes de semillas y bancos celulares y almacenar las partes en
lugares diferentes, lo cual minimiza los riesgos de prdida totales de los bancos en caso de
catstrofes.
Durante la preparacin de los bancos primarios o bancos de reserva, los bancos de trabajo
o cultivos de trabajo, se debe evitar o minimizar los riesgos de contaminacin o alteracin,
Factores fisiolgicos
Los factores fisiolgicos asociados a la expresin y crecimiento celular de la protena de
inters se ponen de manifiesto en el proceso de fermentacin. Entre los ms importantes
se encuentran: composicin del medio de cultivo, parmetros de operacin en el
fermentador y estrategia de cultivo.

Proceso de fermentacin

Los microorganismos y las clulas en general presentan una identidad propia, especificada
por su integracin gentica y manifestada en su funcionamiento con las enzimas que
contienen. Para que los individuos y las especies que ellos forman sobrevivan y sean
perpetuados esta especificacin gentica y su sistema de funcionamiento se deben
mantener y reproducir a travs del crecimiento.

El primer objetivo de una fermentacin industrial es la obtencin de un producto de calidad


a un costo de produccin tan bajo como sea posible. La necesidad de minimizar los costos
de produccin es el factor que controla la seleccin
de las materias primas y que conduce al mejoramiento de las tecnologas y a la bsqueda
de nuevas cepas (9).

Composicin del medio de cultivo

Requerimientos nutricionales del crecimiento

Fuente de carbono y energa

Aproximadamente el 50% del peso seco del material celular es carbono, por lo que en todo
medio de cultivo debe existir un sustrato que proporcione el esqueleto carbonado bsico
para la sntesis de las unidades estructurales que dan origen a las macromolculas y
estructuras de la clula. En la mayora de los casos este compuesto es de origen orgnico y
entre los ms usados se encuentran los azcares como: glucosa, sacarosa, fructosa,
lactosa, entre otros. Por lo general en los procesos degradativos o catablicos de estos
compuestos se produce tambin la energa necesaria para los procesos biosintticos y el
funcionamiento general de la clula.

La respiracin de las bacterias es un proceso complejo que se acompaa del


desprendimiento de energa que es indispensable para la sntesis de diferentes
compuestos orgnicos. Segn el tipo de respiracin los microorganismos se dividen en:
aerobios estrictos, microaerfilos, anaerobios facultativos y anaerobios estrictos.

Un representante tpico de los anaerobios facultativos es E. coli, la cual en los medios que
contienen fuentes de carbono, se desarrolla como bacteria anaerobia al comienzo del
proceso; desintegra los hidratos de carbono mediante la fermentacin, para despus
comenzar a asimilar el oxgeno; crece como aerobia y oxida los productos de la
fermentacin hasta formar CO2 y H2O. Este tipo de microorganismo posee importantes
ventajas, puesto que puede vivir tanto en ausencia como en presencia de oxgeno.
Fuente de nitrgeno

En orden consecutivo es el segundo elemento en importancia que debe formar parte del
medio de cultivo, ya que juega un papel fundamental en la composicin de las estructuras
principales de la clula. Al nitrgeno le corresponde del 8 al 15% del residuo seco.

Es un factor esencial de las protenas y forma parte de los cidos nucleicos, la pared
celular, la membrana celular y otros componentes importantes (26). En la mayora de los
casos se suministra en forma de amonio o de algunas de sus sales, aunque existen otros
que requieren aminocidos, purinas, pirimidinas y vitaminas.

Los requerimientos orgnicos de nitrgeno son relativamente caros, por lo que a veces se
trata de encontrar la satisfaccin de esta demanda en subproductos industriales (suero de
leche) o en productos ms baratos (soya, extracto de
levadura), los cuales pueden aportar algunos factores del crecimiento que se requieren en
cantidades muy reducidas (27).

Velocidad especfica de crecimiento

La velocidad especfica de crecimiento (m) es funcin de: tipo de microorganismo,


composicin del medio de cultivo, temperatura, pH, concentracin de sustrato, velocidad
de agitacin y aireacin. En general se puede plantear que:

= f (T, pH, S, variables de operacin).

Con el objetivo de mejorar la productividad de la protena de inters, obtenida al usar una


cepa de E. coli, se puede correlacionar la velocidad especfica de crecimiento con la
velocidad de produccin del producto de inters. De esta manera se conoce que
manteniendo la velocidad especfica de crecimiento cerca del valor ptimo para la
formacin del producto despus de la induccin, se obtienen altos niveles de expresin de
protena. Utilizando la alimentacin escalonada o constante, despus de la induccin del
cultivo por elevacin de la temperatura, se obtiene una extensin del perodo de
produccin de la protena de manera significativa.

Efecto de la temperatura y el pH

La temperatura de crecimiento ptima para diferentes microorganismos vara en un amplio


intervalo. Por ejemplo: microorganismos psicrfilos: 0-25 C; microorganismos mesfilos:
25-45 C, y microorganismos termfilos: > 45 C. La dependencia de la temperatura de
crecimiento microbiano se podra comprender como el efecto de la temperatura sobre las
distintas reacciones enzimticas que ocurren en las clulas. Este efecto se describe por la
ecuacin de Arrhenius:

=Ae-E/RT

donde:

A : Constante de Arrhenius (h-1).


E : energa de activacin (kJ kmol-1)
T : temperatura absoluta (K)
R : constante de los gases (kJ kmol-1K-1).

El efecto del pH es similar al efecto de la temperatura. La velocidad de las reacciones


enzimticas depende del valor del pH y vara de un microorganismo a otro.

La mayora de las bacterias crecen a una temperatura alrededor de 37 C y un pH neutro.


Manteniendo el cultivo a estas condiciones se logra que la velocidad especfica de
crecimiento dependa solamente de la concentracin de sustrato y de las variables de
operacin.

Efecto de la concentracin de sustrato

La dependencia de la velocidad especfica de crecimiento () sobre la concentracin de


sustrato limitante se obtiene por primera vez por J. Monod (28).

= mxS/(Ks+S)

donde:

mx: Velocidad especfica mxima de crecimiento que se alcanza en la fase exponencial y


depende del tipo de sustrato limitante empleado y de las variables de operacin (h-1). S:
Concentracin de sustrato limitante (g.L-1).
Ks: Constante de saturacin (g.L-1). Esta constante da una medida de la afinidad del
microorganismo hacia el sustrato. Mientras ms pequeo sea Ks, ms afn es el
microorganismo al sustrato en cuestin.

Actualmente existen numerosos modelos que relacionan la velocidad especfica de


crecimiento con la concentracin de sustrato, pero el de Monod sigue teniendo gran
utilidad.

Estrategias de cultivo

Existen diferentes tipos de estrategias para las fermentaciones microbianas: fermentacin


discontinua, fermentacin discontinua incrementada y fermentacin continua.

Fermentacin discontinua

La fermentacin discontinua sigue siendo actualmente el mtodo ms usado en la industria


farmacutica y biotecnolgica. Esta operacin consiste en que se cargan el medio de
cultivo y el inculo en un tanque con agitacin y aireacin, si el proceso lo requiere, donde
ocurre una transformacin biolgica. Teniendo esto se est en presencia de un fermentador
o un biorreactor. La fermentacin discontinua tiene entre sus ventajas: el ser una operacin
simple, presentar bajo riesgo de contaminacin y facilidad para ser utilizada como patrn
para estudios previos. Como desventaja se encuentra que con su uso, se obtiene baja
productividad.

Limitaciones de la operacin discontinua

Existe una concentracin de sustrato limitante inhibitoria al crecimiento. Esto se conoce


comnmente como efecto Crabb Tree y consiste en que el microorganismo en vez de
consumir la fuente de carbono para crecer, produce cido actico y otros metabolitos que
son txicos para las clulas, por lo que se limita la obtencin de altas densidades celulares
(29).
En la fermentacin discontinua existe una contradiccin, al inicio habitan pocas clulas y
existe alta concentracin de sustrato, mientras que al final ocurre lo contrario.

En numerosas ocasiones en la produccin de protenas recombinantes la velocidad


especfica mxima de crecimiento no es la ptima para la formacin del producto. Se
conoce
como critica a la velocidad especfica a la que se elimina casi totalmente la produccin de
cido actico, la cual perjudica
tanto al crecimiento como a la formacin del producto. Esto puede variar de una cepa a
otra (si es auxotrfica o prottrofa), como tambin influye el medio en que se cultivan (si
es medio complejo o definido). Kleman reporta que en un medio definido o salino: crit
0,35 h-1 mientras en un medio complejo: crit 0,2 h-1 (29).
Medio complejo se le llama a los medios ricos en extractos, suplementados con fuentes
orgnicas, aminocidos, vitaminas y trazas. Son medios muy ricos por lo que los
microorganismos tienden a producir ms metabolitos que en un medio salino definido.

Por otra parte, se requiere conocer la velocidad especfica de crecimiento para la formacin
del producto (prod). Existen tres formas de determinarla:

En un cultivo discontinuo manipulando la aireacin y la agitacin.


En un cultivo discontinuo con alimentacin variando el flujo de incremento.
En un cultivo continuo variando la velocidad de dilucin, siempre que no se pierda la
informacin gentica.

Fermentacin discontinua incrementada

La produccin de protenas heterlogas en E. coli puede incrementarse significativamente


mediante la utilizacin de sistemas de cultivo incrementado, el cual permite obtener
densidades celulares superiores a 100 g/L de peso seco (30) y disminuir drsticamente los
costos de produccin de protenas recombinantes (31).

Este sistema de fermentacin presupone resolver algunos inconvenientes, como son: la


inhibicin del crecimiento por acumulacin de sustrato; la capacidad limitada de
transferencia de oxgeno y la formacin de subproductos inhibitorios para el crecimiento
como el cido actico.

Para cultivar clulas de E. coli a altas densidades es necesario el diseo de un medio de


cultivo balanceado, que contenga todos los componentes necesarios para el crecimiento
celular y evite la inhibicin por altas concentraciones de nutrientes. Con este objetivo se ha
propuesto ir incrementando lentamente el sustrato limitante, y con ello evitar la
acumulacin de nutrientes y obligar a crecer al microorganismo a una velocidad baja (32).

Mtodos de adicin del incremento

Los flujos de adicin del incremento pueden ser: constante, escalonados y exponenciales, y
constituyen un elemento fundamental para la obtencin de buenos resultados, ya que no
solo afecta a la concentracin celular sino tambin a la productividad del proceso y a la
cantidad de productos de inters a obtener.

A flujos constantes la adicin se realiza a una velocidad predeterminada y el volumen del


cultivo y la densidad celular aumentan, mientras la velocidad especfica de crecimiento
disminuye constantemente (33).

El flujo escalonado o gradual permite que se incremente la velocidad de adicin en la


medida que aumenta la concentracin celular. En este caso las clulas pueden crecer
exponencialmente durante todo el tiempo de cultivo siempre que la velocidad de adicin
del sustrato limitante se aumente proporcionalmente al crecimiento celular.

El mtodo de adicin mediante un flujo exponencial permite el crecimiento a una velocidad


especfica constante (generalmente, entre 0,1 y 0,3 h-1). A travs de este control se puede
minimizar la produccin de acetato (34).

En la actualidad se han desarrollado mtodos ms sofisticados de adicin que presuponen


esquemas de control por retroalimentacin, asociados a parmetros fsicos medibles como:
el oxgeno disuelto (35), el pH y la velocidad de evolucin de CO 2 (36).

Efecto inhibitorio del cido actico y el oxgeno en el crecimiento de los cultivos


incrementados

Es bien conocido que durante el proceso de crecimiento E. coli produce cido actico como
subproducto La cantidad de acetato producido depende fundamentalmente de la cepa
(37), la velocidad especfica de crecimiento
el medio utilizado, pH as como el tipo y la concentracin de la fuente de carbono

La formacin de cido actico y su actividad inhibitoria puede ser controlada mediante


estrategias de alimentacin exponencial (38) y mediante sistemas de monitoreo de la
fuente de carbono y de oxgeno disuelto (39, 40). Existen procedimientos en los que se
combina el proceso de fermentacin con mtodos de filtracin y dilisis (41), as como la
utilizacin de cepas con la enzima fosfotransacetilasa mutadas (42). Otro de los elementos
que puede provocar la inhibicin del crecimiento, as como la estabilidad y calidad del
producto de inters es la concentracin de oxgeno disuelto en el medio. La escasez de
oxgeno puede causar limitaciones en la produccin de aminocidos y problemas con la
estabilidad de los plsmidos (39).

Desventajas del cultivo incrementado

La limitacin de este cultivo va a estar dada por el mayor riesgo de contaminacin que
presenta en comparacin con los cultivos discontinuos, as como por la inestabilidad

plasmdica que puede originarse debido al alto nmero de duplicaciones que se generan
durante el proceso. Este fenmeno puede influir significativamente en la disminucin de los
niveles de expresin de la protena de inters.

Estrategias de purificacin

El desarrollo de estos procesos ha requerido a la par el desarrollo de procesos de


purificacin. Las protenas teraputicas obtenidas por esta va deben cumplir no solo
rigurosos requerimientos de calidad y seguridad establecidos por las agencias regulatorias,
sino tambin su camino hacia el mercado debe ser corto. La estrategia fundamental de la
purificacin de protenas es simple: remover todos los contaminantes mientras se trata de
retener en el mayor grado posible la protena de inters.

De forma general, la purificacin de protenas se puede dividir a partir de su forma de


expresin en dos grandes grupos que determinan la estrategia a seguir: purificacin de
protenas solubles e insolubles. Las protenas recombinantes en E. coli pueden ser
expresadas de dos formas fundamentales: secretadas al medio extracelular (solubles) o
expresadas en el interior de la clula, donde pueden ser localizadas en el espacio
periplasmtico o en el citoplasma celular (Tabla 1). Muchos de los polipptidos
recombinantes producidos en altos niveles en E. coli se localizan en el citoplasma en forma
insoluble y compacta, formando cuerpos de inclusin, aunque en ocasiones puede
encontrarse de forma soluble.

Tabla 1. Formas de expresin de las protenas intracelulares en E. coli

Las extracelulares son generalmente ms estables (a menudo como resultado de los


puentes disulfuro) y por lo general son molculas pequeas. Una alternativa importante
para la purificacin de estas protenas es la cromatografa de lecho o cama expandida, una
tcnica cromatogrfica en la cual la protena es purificada a partir de un extracto crudo (la
muestra aplicada es particulada: medio de fermentacin que contiene clulas), donde se
combina la preparacin de la muestra y captura en un solo paso, muy adecuada para la
purificacin a gran escala.
Otro mtodo empleado para la purificacin de estas protenas es el uso de marcadores
de afinidad. Esta tcnica consiste en la adicin a las protenas (generalmente en su
extremo carboxilo-terminal) de una cola de polihistidina que permite la purificacin de
estas por medio de una cromatografa de afinidad por iones metlicos (IMAC). La insercin
de un sitio de corte de proteasa entre la cola de histidinas y la protena de inters
permite la eliminacin de dicha cola antes de
cualquier paso posterior. Este mtodo de purificacin por afinidad permite obtener
elevados niveles de pureza empleando un solo paso cromatogrfico (44).

En el caso de las protenas solubles expresadas intracelularmente es necesaria la ruptura


de las clulas que la contienen. Existen varios mtodos para lograr esto, como son: ciclos
de congelacin/descongelacin repetidos, ultrasonido, homogenizacin por alta presin o
permeabilizacin con solventes orgnicos. El mtodo a escoger depender de cun frgil
sea la protena y de cun resistente sea la clula que se requiere romper. Los
contaminantes en los extractos proteicos pueden incluir una variedad de macromolculas
(cidos nucleicos, lpidos, polisacridos y otras protenas) as como una serie de pequeas
molculas. Estas ltimas se pueden fcilmente separar de las protenas por mtodos
basados en la talla molecular, tales como la dilisis, la ultrafiltracin o la filtracin en gel.

Las macromolculas son ms difciles de eliminar, especialmente cuando estn presentes


en grandes cantidades. Las bacterias lisadas liberan grandes cantidades de ADN,
originando extractos con alta viscosidad y alta absorbancia a 280 y 260 nm. Este se puede
eliminar por precipitacin con sulfato de protamina (una protena natural con propiedades
de unin al ADN, la cual contiene un 70% de arginina y lisina) o por tratamiento con
compuestos de poliaminas sintticos. Tambin se emplea el tratamiento con enzimas que
ayuden a depolimerizar al ADN y ARN.

Cuerpos de inclusin

Las protenas recombinantes que se acumulan intracelularmente en E. coli frecuentemente


se depositan en forma de cuerpos de inclusin. Estos son agregados insolubles de
protenas incorrectamente renaturalizadas, las que carecen de actividad biolgica y pueden
observarse por microscopia de fase como partculas intracelulares oscuras. El tamao de
los cuerpos de la inclusin vara entre 0,20,6 mm (45).

La protena recombinante desnaturalizada es el componente principal de los cuerpos de


inclusin y la separacin inicial de los mismos por centrifugacin es un paso eficaz de
purificacin. La molcula recombinante nativa se solubiliza usando agentes caotrpicos a
travs de un proceso conocido como extraccin. Posteriormente se restablece la estructura
terciaria de la protena mediante un paso de renaturalizacin, que consiste en la
disminucin de la concentracin de este agente por dilisis, dilucin directa o empleando
una columna cromatogrfica (46, 47). Mientras la renaturalizacin puede ser un proceso
sencillo para las protenas pequeas que no contienen puentes disulfuro, este es un
proceso complejo y de bajos recobrados en muchos casos. Las condiciones ptimas para la
renaturalizacin son dependientes de cada protena y por tanto no se pueden predecir. Sin
embargo, existe mucha informacin en la literatura, disponible en bases de datos (48).

Antes de la extraccin, los cuerpos insolubles colectados se pueden lavar con soluciones
que contienen desnaturalizantes (1-4 mol/L de urea), sacarosa o detergentes para reducir
los niveles de contaminantes, pero a costa de incrementar los costos y la complejidad de
los procesos.

Empleo de los mtodos cromatogrficos

La introduccin de la cromatografa a comienzos de los aos 1960, principalmente la


filtracin en gel y el intercambio inico, proporcionaron nuevas oportunidades para la
purificacin.

Si bien en esta etapa los procesos se enfocaron en mejorar la precisin de los estudios
estructura-funcin de las protenas y los procesos de escalado se vieron limitados por las
caractersticas fsicas de los geles, a partir de los aos 1970, con la aparicin de la
tecnologa del ADN recombinante, el desarrollo de las fermentaciones bacterianas y el
cultivo de clulas de mamferos, los productos biofarmacuticos se ajustaron a procesos de
purificacin basados en los procesos cromatogrficos como la herramienta fundamental y
con tecnologas de membrana que proporcionaron materiales limpios clarificados, cambio
de soluciones, concentracin del producto, eliminacin viral y filtracin estril (49). La
estandarizacin permiti un enfoque ms sistemtico al desarrollo de estos procesos y fue
el basamento para la introduccin del paradigma captura-purificacin-pulido, ahora
extendido en todos los diseos de los esquemas de purificacin de protenas.

La industria desarroll un nuevo y sistemtico diseo integrado de procesos, ingeniera y


control, economa de proceso e higiene y aspectos regulatorios. Los sistemas de
bioprocesos se introdujeron y el control computarizado se impuso en esta tecnologa,
previamente dominada por operaciones manuales. La expansin de la cromatografa como
la herramienta fundamental en la purificacin de las biomolculas se aprecia claramente
en el incremento de los ingresos en bioprocesos para la divisin de Life Science de la firma
GE Healthcare de aproximadamente 36 millones en 1986 a 461 millones en 2006 (50).

Eliminacin de endotoxinas

Otro problema confrontado durante la purificacin de protenas teraputicas expresadas en


E. coli es la eliminacin de las endotoxinas bacterianas.

El trmino pirgeno microbiano en oposicin a endotoxinas de las bacterias gramnegativas


se ha convertido en un trmino descriptivo general para muchas sustancias diferentes. Sin
embargo, las sustancias pirognicas pueden ser producidas por algunas bacterias
grampositivas, micobacterias, hongos y tambin algunos virus, pero los pirgenos
producidos por las bacterias gramnegativas, las endotoxinas, son un asunto a considerar
en la industria farmacutica.
Las endotoxinas bacterianas, encontradas en la membrana externa de las bacterias
gramnegativas son miembros de una clase de fosfolpidos llamados lipopolisacridos (LPS).
Los LPS no son productos exgenos de las bacterias gramnegativas. La liberacin de estos
ocurre despus de la muerte o de la lisis celular. Algunos ejemplos de bacterias
gramnegativas productoras de pirgenos son la E. coli y miembros de los gneros Proteus,
Pseudomonas, Enterobacter y Klebsiella.

Pueden existir varias fuentes de pirgenos en los productos parenterales y en el


equipamiento mdico. Entre estas encontramos el agua usada como solvente o en el
procesamiento, componentes de envase, reactivos, materias primas o equipamiento usado
en la preparacin del producto. Las buenas prcticas incluyen el control de los niveles
microbiolgicos y de endotoxinas en las fuentes potenciales mencionadas.

Teniendo en cuenta la composicin de la molcula de LPS (una porcin de la molcula es


hidrofbica y la molcula posee carga negativa a pH neutro) tambin la cromatografa de
intercambio aninico ha sido reportada para la eliminacin de endotoxinas.

Chen y colaboradores reportan la reduccin de hasta dos mil veces en los niveles de
endotoxinas en un paso cromatogrfico, empleando una resina de intercambio aninico: Q
XL, de la firma GE Healthcare (50), la cual posee un grupo intercambiador amino
cuaternario.

Pureza versus recobrado

La mayora de los protocolos de purificacin de protenas a escala preparativa involucran


varios pasos. Cada paso permite alcanzar un grado de pureza pero un intervalo de
seleccin estrecho. En el caso de las fracciones con mayor pureza, puede reducir
grandemente el recobrado.

Otras prdidas pueden venir de la unin irreversible de la protena a la matriz


cromatogrfica, de la desnaturalizacin, de la oxidacin de la protena, de condiciones
drsticas durante la unin o durante la elucin de las matrices cromatogrficas, exposicin
a iones metlicos pesados y a la separacin de cofactores, grupos prostticos y agentes
estabilizantes de la protena de inters.

Conclusiones
Por ltimo, uno de los objetivos de los investigadores fue alcanzar altos rendimientos
en la produccin de productos
biotecnolgicos expresados en E. coli, con vistas a hacer estos procesos ms
factibles econmicamente y cumplir con las regulaciones vigentes en esta rama de
la industria.

Las estrategias han estado encaminadas desde el mejoramiento gentico de la cepa


y los vectores de expresin hasta los mtodos de cultivo y purificacin de estas
protenas. No obstante, existen retos que deben abordarse en un futuro, entre los
que se encuentran: superar los niveles de expresin de protenas alcanzados;
realizar un adecuado estudio del espacio de diseo durante la etapa de desarrollo de
los procesos de fermentacin y recobrado, para establecer los parmetros que
influyen significativamente en su eficiencia; realizar una adecuada seleccin del
medio de cultivo que facilite tanto la expresin como el crecimiento celular.

Aunque en este artculo se han dado consideraciones generales, el desarrollo de


cada producto requerir un estudio de las caractersticas particulares de las
molculas recombinantes y de las cepas productoras.