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Disciplina de Profa Daiane Bopp Roteiro de
Microbiologia Clínica Fuentefria aulas práticas
VIII Nível / 2010
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Mac
Conkey
XLD
Hektoen
Observações:
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1. Princípio
Isolar bactérias patogênicas de secreção de orofaringe, especialmente
estreptococos beta-hemolíticos do grupo A, uma vez que se faz necessária a
terapia imediata. A urgência não é justificada apenas pela doença básica
(faringite, amigdalite), mas também para evitar complicações posteriores,
potencialmente graves, como febre reumática, glomerulonefrite e
endocardite reumática.
2. Amostra
2.1. Tipo de amostra
Secreção de orofaringe, faringe, amígdalas e/ou pontos purulentos
dessas regiões.
Procedimento:
• Sentar o paciente e inclinar levemente a cabeça de modo a
obter boa iluminação na cavidade oral;
• Expor o máximo as amígdalas, com o abaixador de língua;
• Esfregar o swab, de maneira rotatória, nas amígdalas e na
faringe posterior. Coletar também qualquer outro ponto de pus;
• Cuidar para não tocar com o swab na parede da cavidade bucal
e não carregar saliva, caso contrário haverá contaminação da
amostra.
• Rolar o swab no início de um quadrante da placa de ágar sangue
(AS) e, posteriormente, fazer um esfregaço em lâmina;
• Caso não esteja disponível a placa de AS, introduzir o swab em
um meio de transporte de Stuart, imediatamente após a coleta.
2.3. Estabilidade da amostra
Amostra em placa: encaminhada em até 2 horas em temperatura
ambiente
Amostra em meio de transporte: 24 horas em temperatura ambiente
3. Metodologia
3.1 Bacterioscopia
Após fixar o esfregaço, corar pelo método de Gram e observar ao microscópio
com objetiva de 100x, verificando a presença de leucócitos, células e
bactérias.
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4. Interferentes
Qualquer antibiótico administrado previamente a coleta poderá fornecer
resultados falso negativos. A falta de uma técnica adequada de coleta poderá
levar a uma contaminação da amostra por bactérias da microbiota normal,
presentes na saliva e na cavidade oral (ex.: Estreptococos do grupo Viridans e
estafilococo coagulase-negativo). Isto pode gerar dificuldades na
interpretação clínica do resultado. Entretanto, este tipo de contaminante não
deve ser valorizado em culturas de orofaringe.
Atividade de quinta-feira:
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Uso da Autoclave
1. Verificar se o nível da água cobre a resistência (a água deve tocar o
fundo do cesto).
8. Colocar o material a ser autoclavado no
cesto, respeitando a carga máxima;
9. Fechar a autoclave;
10. Abrir a válvula de vapor;
11. Ligar a autoclave na temperatura
máxima;
12. Aguardar a saída contínua de vapor da
mangueira;
13. Fechar a válvula de vapor;
14. Aguardar a autoclave atingir a pressão de
1 atm (120oC). Quando a pressão chegar a 1 atm, baixar o termostato para a
temperatura média e marcar o tempo de esterilização;
15. Desligar a autoclave e esperar o indicador
de pressão chegar a zero;
16. Abrir a válvula de vapor;
17. Abrir a autoclave, sem colocar o rosto em
cima;
18. Retirar o material cuidadosamente.
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Quarta-feira
1. Cada dupla receberá uma bactéria em Agar inclinado e deverá proceder a
identificação do microrganismo.
2. Inocular a bactéria nos meios de identificação bioquímica e fazer a prova da
citocromo-oxidase.
3. Incubar as provas de identificação a 35 ± 1 oC por 24 horas.
Quinta-feira
1. Interpretar e anotar os resultados das provas bioquímicas.
2. Colocar os resultados em tabelas de identificação bioquímica.
3. Identificar o microrganismo.
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1. Princípio
Identificar os cocos Gram-positivos até o gênero: Staphylococcus, Streptococcus e
Enterococcus.
2. Prova da catalase
Quando houver suspeita de cocos Gram-positivos, realizar uma bacterioscopia e depois
a prova da catalase.
a) Em uma lâmina limpa, pingar uma gota de peróxido de hidrogênio 20 volumes
b) Com auxílio de uma alça, transferir uma colônia para a lâmina e emulsioná-la no
peróxido
c) Um desprendimento intenso de bolhas indica resultado POSITIVO
3. Catalase-positivos
Inocular a colônia suspeita no plasma e incubar a 35 oC por 4 horas. Após o período de
incubação, a formação de um coágulo indica um resultado positivo e identifica S.
aureus.
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CAT
Stap
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Identificação de Enterococcus
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Aula 08 – Urocultura
1. Princípio
Crescimento bacteriano em meios de cultura seletivos e diferenciais que
propiciam o desenvolvimento de patógenos de interesse em infecções urinárias
e sua quantificação pela semeadura com alça calibrada. O objetivo é isolar e
quantificar bactérias patogênicas do trato urinário, diferenciando infecção de
colonização.
2. Amostra
2.1. Tipo de amostra
Urina colhida por micção (jato intermediário), punção suprapúbica,
cateterização ou sonda uretral.
2.2. Preparo da amostra
Não é exigido
3. Estabilização e armazenamento
A urina que não for transportada ao laboratório em até uma hora ou semeada
dentro de duas horas após a coleta deve ser refrigerada até o momento da
semeadura, podendo permanecer nestas condições por, no máximo, 24 horas.
4. Materiais inadequados
- Jato primário de urina (a não ser por solicitação médica)
- Amostra em frasco não estéril
- Urina colhida com coletor e contaminada com fezes (bebês)
- Amostra colhida de bolsa coletora de pacientes sondados
5. Metodologia
5.1. Semeadura e isolamento
• Para a cultura quantitativa de urina utilizar a alça calibrada de 1 µl
(1:1000) ou 10 µl (1:100).
• Após a homogeneização da amostra, proceder a semeadura com
alça apropriada em ágar CLED e ágar Mac Conkey, pela técnica de
esteira. Esta semeadura constará inicialmente de uma estria central
na superfície do Agar, seguida de um estriamento perpendicular a
esta estria inicial, possibilitando assim, a obtenção de colônias
isoladas para contagem.
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6. Interpretação
De acordo com o número de microrganismos isolados e sua quantidade,
proceder a interpretação de acordo com a necessidade.
O crescimento de uma ou duas espécies em contagem superior a 100.000
UFC/ml dever ser sempre valorizado (identificação + antibiograma).
Desenvolvimento de três ou mais espécies em contagens inferiores a 100.000
UFC/ml devem ser analisadas criteriosamente em cada caso.
Cultura negativa
Contagem de colônias: zero UFC/ml
7. Interferentes
O uso de antibióticos e diuréticos pode diminuir sensivelmente a contagem de
colônias. Amostras colhidas inadequadamente poderão apresentar contaminação
bacteriana por microbiota normal da uretra e/ou vaginal. Amostras não
refrigeradas poderão apresentar um subcrescimento de bactérias
contaminantes, “positivando” a cultura.
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Aula 09 – Coprocultura
1. Princípio
O crescimento bacteriano em meios de cultura seletivos e diferenciais propicia o
enriquecimento e o desenvolvimento de patógenos de interesse nas
gastroenterites. A partir disto é possível a sorotipagem de bactérias
enteropatogênicas (Salmonella, Shigella, E. coli invasora EIEC e E. coli
enteropatogênica - EPEC) presentes na amostra.
2. Amostra
Fezes recentes em frasco de boca larga estéril ou em meio de transporte ou
swab retal em meio de transporte.
Estabilidade e armazenamento da amostra: A amostra, em meio de transporte,
pode permanecer até 24 horas em temperatura ambiente. O armazenamento
após a semeadura direta e enriquecimento da amostra, deve ser feito sob
refrigeração por mais 24 horas. Entretanto, a refrigeração pode inviabilizar
algumas cepas de Shigella.
3. Metodologia
3.1Exame macroscópico
Anotar sempre o aspecto das fezes (p. ex.: diarréicas, moldadas,
mucosanguinolentas, etc)
3.3Bacterioscopia de Gram
Realizar apenas quando solicitado pelo médico ou para a pesquisa de
Campylobacter (presença de leucócitos e bacilos Gram-negativos curvos).
Preparar uma suspensão em salina conforme dito acima, deixar secar e corar
pelo método de Gram.
3.4Semeadura e isolamento
Proceder a semeadura direta por esgotamento no meio MacConkey, Hektoen e
no caldo GN. Incubar as placas por 18-24 horas e o caldo GN por 4 horas
(máximo 6 horas). Repicar do caldo GN para uma placa com XLD e incubá-la por
18 – 24 horas a 35oC.
Identificar as colônias de interesse por meio de provas bioquímicas.
Sorologia:
Após a leitura das provas de triagem, realizar a sorologia indicada, caso
necessário, conforme descrito a seguir.
Procedimento:
Adicionar 2 – 3 colônias suspeitas a 1 mL de salina e homogeneizar bem.
Colocar em uma placa escavada, 1 gota do anti-soro e misturar com uma
gota da suspensão bacteriana. Homogeneizar por 2 minutos. Observar ao
microscópio (10x) a presença de aglutinação.
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Anti-soros utilizados:
4. Modelo de resultado
Será relatada a presença ou ausência dos enteropatógenos aqui pesquisados,
conforme faixa etária (a EPEC só deve ser pesquisada em crianças até 2 anos de
idade).
Exemplos: “Não houve desenvolvimento de Salmonella, Shigella e E. coli
enteropatogênica clássica”.
“Desenvolvimento de Salmonella”.
5. Interferentes
A bacterioscopia não pode ser realizada com amostra em meio de transporte,
pois este prejudica a coloração e causa interferência no método. A semeadura
em grandes quantidades de amostra pode causar a viragem do pH dos meios e
não permitir a obtenção de colônias isoladas. Algumas cepas de EPEC podem
apresentar aglutinação inespecífica com todos os antisoros (cepas
autoaglutináveis). Nestes casos, re-isolar as cepas e repetir a sorologia. Caso a
aglutinação se repita, o resultado é inconclusivo.
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Aula 10 – Hemocultura
1. Princípio
O Objetivo da hemocultura é a realização do isolamento, identificação e
antibiograma de bactérias que possam estar envolvidas em um processo
infeccioso da corrente sanguínea. Isto é possível através da incubação das
amostras em caldos de enriquecimento na proporção de 1:10, para que haja
diluição das prováveis substâncias inibitórias presentes no sangue. O frasco de
hemocultura contém ainda um anticoagulante (SPS), vácuo e CO2, permitindo
assim o desenvolvimento da grande maioria dos microrganismos envolvidos em
bacteremias. O número de amostras varia conforme solicitação médica. Quanto
maior o número de amostras coletadas, maior será a probabilidade do
isolamento do agente etiológico causador da infecção.
2. Amostra
Tipo de amostra: Sangue venoso ou arterial.
Procedimentos:
• Fazer rigorosa assepsia da pele do paciente, utilizando algodão embebido em
álcool 70%. Deixar o álcool agir por 1 minuto.
• Enquanto isso, friccionar um algodão embebido em álcool 70% na tampa de
borracha do frasco de hemocultura. Identificar o frasco.
• Puncionar a veia do paciente e coletar o volume de sangue recomendado (5 a
10 mL para adultos e 2 a 4 mL para crianças). Tranferi-lo imediatamente para
o frasco de hemocultura. Enviar o frasco para o setor.
• No setor, incubar as amostras e observar uma a uma a cada 24 horas para
pesquisa de hemoculturas positivas.
• No caso da detecção de hemocultura positiva (por turvação, grumos ou
hemólise), proceder da seguinte maneira.
Hemoculturas positivas:
• Homogeneizar bem a amostra e, com auxílio de uma seringa de insulina, coletar
0,1 mL da amostra e transferir uma gota para Agar sangue, Mac Conkey. Incubar
as placas a 37oC por 24 horas. Transferir uma gota para preparar lâminas para
corar pelo Gram.
• Caso haja crescimento, identificar a bactéria com provas bioquímicas e realizar o
antibiograma específico para o patógeno isolado.
Hemocultura negativas:
Devem ser incubadas por 7 dias a 37oC, observando-as a cada 24 horas. Após o
término da incubação, liberar o resultado da hemocultura como Negativo.
1. Princípio
Desenvolvimento e quantificação de bactérias, utilizando o Agar sangue.
2. Tipo de amostra
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Ponta de cateter.
3. Procedimento
• Deixar a placa com Agar sangue a temperatura ambiente.
• Com auxílio de uma pinça estéril (flambada e resfriada), retirar a ponta de
cateter do frasco e rolar o mesmo por toda a extensão da placa (4 a 5
vezes)
• Incubar a 35oC por 24 horas.
• Observar se houve crescimento e, caso positivo, contar o número de
unidades formadoras de colônias (UFC) de cada espécie (geralmente
cresce um único tipo).
• Confeccionar uma lâmina para Gram e proceder a identificação conforme
o tipo de bactéria isolada.
4. Interpretação
Por estar em contato direto com a corrente sanguínea a colonização da ponta do
cateter oferece risco eminente de disseminação destas bactérias para o sangue.
Cateteres colonizados por 15 UFC ou mais constituem uma importante fonte de
infecção.
5. Modelo de resultado
Deve-se relatar a bactéria isolada e o número de UFC encontrado.
Exemplo:
Ou
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1. Princípio
Crescimento bacteriano em meios de cultura seletivos, diferenciais e
enriquecidos, que propiciem o desenvolvimento da maioria dos patógenos de
interesse clínico nesse tipo de material.
2. Amostra
Escarro
Coleta:
Expectorar a amostra de maneira que esta seja representativa do trato
respiratório inferior
Enviar o frasco para o laboratório dentro de 1 hora
3. Material inadequado
Amostra contendo muita saliva
4. Metodologia
BACTERIOSCOPIA
• Observar a presença de leucócitos, células epiteliais e bactérias (fazer o
Gram mesmo que o médico não tenha solicitado)
• Observar em aumento de 10x. Se for observada uma quantidade superior
a 10 células epiteliais e/ou quantidade inferior a 25 leucócitos por campo
(observar 10 campos), incluir no laudo a seguinte observação:
“Amostra não representativa do trato respiratório inferior. Sugerimos
repetir exame, observando rigorosamente as instruções de coleta”.
SEMEADURA E ISOLAMENTO
Semear em ágar chocolate, Agar sangue e Mac Conkey pela técnica de
isolamento. Incubar a 35oC por 24 horas. O Agar chocolate deve ser incubado em
tensão de CO2. Observar o crescimento e fazer uma bacterioscopia (Gram) das colônias
de prováveis patógenos e proceder a identificação.
5. Resultados
5.1 Interpretação
A cultura de escarro é de valor questionável. Isto é devido ao fato deste material
ser invariavelmente contaminado por bactérias da microbiota normal do trato
respiratório superior. Por outro lado, o escarro não é o material mais
representativo do quadro infeccioso do trato respiratório inferior. A análise
microbiológica de outros materiais como lavado brônquico, aspirado traqueal,
leva a resultados mais conclusivos. Para contornar o problema de contaminação
com bactérias não patogênicas, pesquisar principalmente microrganismos cuja
patogenicidade é bem estabelecida neste tipo de material. Dentre estes, os mais
freqüentes são:
Staphylococcus aureus: ++++
Pseudomonas aeruginosa: +++
Streptococcus pneumoniae: ++
Klebsiella pneumoniae: ++
Haemophilus influenzae: ++
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Moraxella catarrhalis: ++
Atividade prática:
Observe as lâminas de escarro coradas pelo Gram e, de acordo com os critérios
acima descritos, classifique essas amostras em adequadas ou inadequadas.
Observe cerca de 10 campos em aumento de 10x e faça uma média.
1. Princípio
Desenvolvimento e quantificação de bactérias Gram negativas e Gram
positivas, utilizando meios de cultura apropriados (Agar sangue, Agar
chocolate e Mac Conkey) e um fluidificante.
2. Amostra
2.1 Tipo de amostra
Aspirado traqueal
2.2 Coleta
Coleta: procedimento médico
SEMEADURA
• Homogeneizar bem a amostra
• Misturar 1 mL da amostra com 1 ml de N-acetilcisteína 1%
(fluidificante) (Diluição ½)
• Da mistura anterior (Diluição ½), adicionar 100 µl mais 900 µl de
solução fisiológica estéril e homogeneizar bem (Diluiçã 1/10)
Diluição final 1/20
• Inocular 1 µl e semear pela técnica de esteira. (Diluição final:
1/20.000)
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3. Resultados
3.1 Interpretação
A quantificação de bactérias neste tipo de amostra é importante para
estabelecer uma melhor correlação com uma infecção e descartar a
probabilidade de uma contaminação pela microbiota normal. Para calcular
o número total de colônias por mililitro de amostra, contar todas as
colônias e multiplicar por 20.000. (Exemplo: contagem de 50 colônias x
20.000 = 1.000.000 UFC/ml)
Valor significativo para aspirado traqueal: 106 UFC/ml (1.000.000
UFC/ml)
O resultado será expresso conforme abaixo.
4. Interferentes
A presença de contaminantes do trato respiratório superior pode fornecer
resultados falso-positivos. Entretanto, nestes casos a contagem de colônias é
geralmente baixa.
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1. Princípio
A meningite aguda é a principal manifestação de infecção do SNC e
representa uma emergência médica. Geralmente a concentração de
microrganismos no líquor é baixa, daí a importância da concentração da
amostra antes do processamento. Por se tratar de um material estéril em
condições habituais, qualquer achado no exame bacterioscópico ou cultura
deve ser considerado e criteriosamente reportado.
2. Amostra
A amostra deve ser coletada em um tubo estéril e encaminhada ao
laboratório a temperatura ambiente o mais rápido possível. Dependendo do
microrganismo presente, prazos superiores a 1 hora podem ser prejudiciais
ao exame. O volume mínimo recomendável para o isolamento de bactérias é
1 mL, porém volumes menores podem ser aceitos. Quando houver pedido de
citologia e bioquímica, o material deve ser primeiramente encaminhado a
bacteriologia e depois aos demais setores.
3. Procedimento
Avaliar em conjunto com a cultura os parâmetros físico-químicos,
citológicos e bioquímicos do líquor.
• Transferir a amostra para um tubo estéril.
• Centrifugar a 4.000 rpm por 15 minutos.
• A partir do sedimento, inocular em Agar chocolate e Agar sangue
(pela técnica de isolamento) e prepara lâminas para corar pelo
Gram.
• Incubar as placas a 35 oC com 5% de CO2 por 24-48 horas.
• Após período de incubação, observar se há crescimento bacteriano.
• Identificar por provas bioquímicas.
4. Resultado
O isolamento de qualquer bactéria é forte indício de meningite, entretanto
observar a correlação dos achados na cultura com características físico-
químicas, bioquímicas e citológicas do líquor é essencial. Liberar no laudo
o gênero e espécie do microrganismo isolado.
Exemplo de resultado:
Cultura de líquor:
“Desenvolvimento de Neisseria meningitidis”.
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Aula 13 – Antibiograma
1. Princípio
Observar a resistência ou sensibilidade que uma determinada cepa
bacteriana apresenta frente a antimicrobianos, através de zonas de inibição de
crescimento in vitro. Na superfície de um meio de cultura, onde é semeada uma
quantidade padrão de microrganismos em teste, são colocados discos de papel,
impregnados com concentrações conhecidas de antibióticos. É então formada
uma concentração em gradiente pela difusão do antibiótico no Agar, e o
crescimento do organismo em teste fica inibido a uma certa distância do disco. A
medida do halo de inibição e a comparação deste com uma tabela normatizada é
que vai fornecer a susceptibilidade do microrganismo.
2. Amostra
Colônias previamente isoladas do microrganismo a ser testado. Importante:
Cultura pura
3. Procedimento
• Com uma alça bacteriológica, tocar umas cinco colônias bem isoladas
da bactéria em teste e inoculá-las em solução fisiológica.
• Ajustar a turvação da suspensão bacteriana para o equivalente do tubo
0,5 da escala de Mac Farland. O ajuste é feito em espectrofotômetro,
utilizando um tubo de solução fisiológica não inoculada para “zerar” o
aparelho. Para a quantidade de colônias de 3 x 10 8 UFC/ml, a 625 nm,
a absorbância deve estar entre 0,08 e 0,10. (Se der > 0,10 = diluir
adicionando mais salina; se der < 0,08 = acrescentar mais colônias).
Ou, pode-se utilizar o ajuste visual, comparando-se com uma escala de
0,5 de Mc Farland com boa luminosidade contra um fundo branco com
listras negras.
• Embeber um swab no caldo inoculado, retirar o excesso nas paredes
do tubo e semear na placa de Mueller-Hinton pela técnica de “8
direções”.
• Aplicar os discos na placa, com auxílo de uma pinça, de maneira que
os discos fiquem a uma distância de, pelo menos, 15 mm de distância
(centro a centro). A seleção dos discos a serem utilizadas depende da
bactéria testada (consultar manual do CLSI).
• Incubar a placa invertida, por 18-24 horas e proceder a leitura dos
halos com auxílio de uma régua e tabela de interpretação.
4. Interpretação
A determinação do perfil de susceptibilidade de uma bactéria pode
fornecer um auxílio muito importante para o clínico. Entretanto, é comum
ocorrer discrepâncias entre as sensibilidades in vitro e in vivo. Cabe ao clínico
perceber as situações e tomar as devidas providências.
5. Modelo de resultado
Urocultura:
Escherichia coli
Contagem de colônias: superior a 100.000 UFC/ml
Antibiograma:
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Referências:
KONEMAN, Elmer W.. Diagnóstico microbiológico: texto y atlas color. Buenos Aires:
Panamericana, 1999. 1432 p.
OPLUSTIL, Carmen Paz. Procedimentos básicos em microbiologia clínica. São Paulo:
Sarvier, 2000. 254 p.
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