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Mtodo de Bradford: (Bradford, M. Anal. Biochem.

, 72:248, 1976), el mismo est


basado en el cambio de color del colorante Coomassie brilliant blue G-250 en respuesta
a diferentes concentraciones de protenas. Este compuesto interacciona con
aminocidos bsicos (especialmente arginina) y aromticos. Esta unin del colorante
con las protenas provoca un cambio en el mximo de absorcin del colorante desde
465 a 595 nm. Por lo tanto, este mtodo se basa en la propiedad del Azul Brillante de
Coomasie G-250 de presentarse en dos formas con colores diferentes, rojo y azul. La
forma roja se convierte en azul cuando el colorante se une a la protena.
Experimentalmente se mide la diferencia de Absorbancias entre 595 y 465 nm (595-
465nm).

http://www.labome.es/method/Protein-Quantitation.html#ref4
Algunas ventajas y/o desventajas del Mtodo

La intensidad de absorcin depende del contenido de aminocidos bsicos y


aromticos.
El complejo colorante-protena tiene un alto coeficiente de extincin lo cual es
imprescindible para aumentar la sensibilidad en la medicin de protenas.
La unin colorante-protena es un proceso muy rpido (2min) y el complejo
permanece estable durante un tiempo relativamente largo, una hora. Haciendo
de este un proceso muy rpido, y que no requiere un tiempo crtico para el
ensayo.
Se pueden utilizar un gran nmero de muestras (muy reproducible) y es
adaptable a la automatizacin.
Las interferencias o no existen o son mnimas por cationes tanto sodio como
potasio y carbohidratos como la sacarosa. Otras sustancias que interfieren en el
ensayo son los agentes fuertemente alcalinos (fcilmente solucionable con la
utilizacin de buffers). Los nicos componentes encontrados que dan una

Ensayo de Bradford o azul brillante de Coomassie (rango: 20-2000 ug/ml)


El ensayo de Bradford, originalmente descripto por la Dr. Marion
Bradford en 1976, es una de los mtodos mas populares para la
determinacin de la concentracin de protenas. Se basa en la
formacin de un complejo entre el colorante azul brillante de
Coomassie G-250 y las protenas en solucin. El colorante libre
existe en cuatro formas inicas. La forma azul mas aninica se une
a protenas y absorbe a 590 nm. La concentracin de protenas
puede ser evaluada determinando la cantidad de colorante en su
forma inica azul y midiendo la absorbancia de la solucin a 592 nm
utilizando un espectrofotmetro [16]. El colorante se une
principalmente a residuos de arginina, triptfano, tirosina, histidina y
fenilalanina [4].
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Figura 2. Representacin esquemtica del ensayo de Bradford.
La mayora de los investigadores utilizan ASB como estndar
proteico ya que es econmica y de fcil disponibilidad pero no
siempre es adecuada. De hecho, una de las desventajas de utilizar
ASB es que exhibe una respuesta fuerte al colorante y puede
subestimar el contenido de protenas. Inmunoglobulina G (IgG) o
lisozima, u otro estndar proteico debera ser utilizado dependiendo
del tipo de protena de la muestra [16].
Entre las ventajas de este mtodo se encuentran su compatibilidad
con agentes reductores utilizados para estabilizar las protenas en
solucin, los cuales no son compatibles con el ensayo de Lowry y
en algn grado con el ensayo de BCA, y la posibilidad de medir
protenas de alto peso molecular ya que el colorante no se une a
pptidos de bajo peso molecular [4, 16].
La principal limitacin del ensayo de Bradford es su incompatibilidad
con detergentes, los cuales se utilizan de rutina para solubilizar
protenas de membrana. Solo un nivel de detergente no inico muy
bajo, tal como Triton X-100 a una concentracin final de 0,008 %
(v/v), puede mejorar la sensibilidad y variabilidad del ensayo de
Bradford [17]. Los detergentes pueden ser removidos por
cromatografa de exclusin molecular o por dilisis, lo que lleva a la
dilucin de la muestra; o por precipitacin con fosfato de calcio [16]
o acetona, ambos mtodos que permiten recuperar como mucho el
70 % de la cantidad inicial de protena. En una publicacin reciente
Cheng et al [18] describen un mtodo basado en el ensayo de
Bradford que permite la cuantificacin de protenas de manera
rpida incluso cuando la solucin de protenas contiene substancias
que interfieren. El mtodo demuestra una tasa de recuperacin de
protenas mejorada luego de tan solo 1 hora de precipitacin en
acetona posterior a la adicin de sacarosa, un componente que no
interfiere con el ensayo de Bradford.