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1 MANUAL PRCTICAS BIOQUMICA

MANUAL PRCTICAS
BIOQUMICA
PRESTACIN DE SERVICIOS

UNIVERSIDAD DE CRDOBA
FACULTAD DE CIENCIAS BSICAS
DEPARTAMENTO DE QUMICA

DEPARTAMENTO DE QUMICA
2 MANUAL PRCTICAS BIOQUMICA

UNIVERSIDAD DE CRDOBA
LABORATORIO DE BIOQUMICA
PRACTICA N 1
PROPIEDADES FSICAS Y QUMICAS DE LOS AMINOCIDOS

OBJETIVOS
Observar algunas propiedades fsicas de los aminocidos.
Reconocer la presencia de aminocidos por la reaccin de estos con la
Ninhidrina
Identificar algunos grupos funcionales presentes en aminocidos especficos
mediante la formacin de productos coloreados.

TEORA RELACIONADA
Las clulas vivas producen macromolculas que son biopolmeros constituidos por
unidades monomricas o bases estructurales. Para las protenas, estas unidades son
los L aminocidos. Las propiedades biolgicas de estas macromolculas estn
determinadas en gran parte por las clases de aminocidos presentes, el orden en el que
estn dispuestos en una cadena de polipptidos y por lo tanto la relacin espacial de un
aminocido con otro. Los aminocidos contienen grupos funcionales amino y carboxilo.
En un aminocido, ambos estn unidos al mismo tomo () de carbono. De los
aminocidos presentes en la naturaleza, slo 20 de ellos aparecen en las protenas de
todas las formas de vida, vegetal, animal o microbiana. Los aminocidos intervienen en
la transmisin de impulsos en el sistema nervioso (Glicina y acido glutmico). Los
aminocidos esenciales deben ser suministrados en la alimentacin, ya que nuestros
cuerpos no pueden sintetizarlos en cantidades adecuadas para respaldar el crecimiento
(nios) o para conservar la salud (adultos).

Reaccin de la Ninhidrina: Es un agente oxidante poderoso, reacciona con todos los


aminocidos a un pH entre 4 y 8 para dar un compuesto de color prpura. Esta reaccin
se efecta tambin con los aminocidos prolina e hidroxiprolina, pero en este caso se
obtiene un color amarillo en vez de prpura.

Reaccin Xantoproteica: Los aminocidos que contienen un ncleo aromtico forman


nitroderivados de color amarillo cuando se calientan con cido ntrico concentrado. Las
sales de estos derivados son de color rojo naranja.

Reaccin de Millon: Los compuestos que contienen el radical hidroxibenceno reaccionan


con reactivo de milln formando compuestos rojos. Los nicos aminocidos fenlicos son
la Tirosina y sus derivados y solamente ellos dan una reaccin positiva. El reactivo
original de Millon es una solucin de nitrato mercrico en cido ntrico 50% v/v.

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Reaccin del cido Glioxlico para Triptfano: Grupo indlico del triptfano reacciona con
cido glioxlico en presencia del cido sulfrico concentrado dando un color prpura.

Reaccin de Sakaguchi: El nico aminocido que contiene grupos guanidinos es la


Arginina; esta reacciona con naftol y un agente oxidante tal como agua de bromo o
hipoclorito en un medio alcalino, dando un color rojo.

MATERIALES Y REACTIVOS
10 Tubos de ensayo 1 Gotero.
1 Gradilla 1 Estufa
1 Pinza para tubos de ensayo. 1 Beaker de 500mls
3 Pipetas de 1, 5 y 10 mL Papel indicador

Soluciones al 0.5% de aminocidos: Glicina, Tirosina, Triptfano, Fenilalanina, Arginina.

Ninhidrina: Disolucin al 0.2% en alcohol o acetona.

HNO3 al 10% - Naftol: 0.2%


NaOH al 20% o amoniaco. Nitrito de sodio.
Fenol, disolucin al 0.1% cido glioxlico
Reactivo de Milln. Acido sulfrico.
Agua de bromo

PROCEDIMIENTO

1. Examen Fsico: Anote el estado fsico de la sustancia (Aminocidos): Slido,


lquido, polvo, solucin, cristal. Si es homognea.
Color: Ver si es uniforme o si cambia durante el proceso.
Olor: Percibir si se trata de olor caracterstico o relacionado con un grupo qumico.
2. Reaccin de la Ninhidrina: Coloque 1 ml de solucin de aminocido (glicina,
tirosina y triptfano) en un tubo de ensayo y ajuste el pH cerca de la neutralidad (ya esta
ajustado); agregue 5 gotas de solucin de ninhidrina, deje hervir por 3 minutos y anote
sus resultados.
3. Reaccin Xantoproteica: Adicione 1 ml de solucin de cido ntrico a
aproximadamente 1 ml de solucin de aminocido (glicina, tirosina, Triptfano, y
fenilalanina), calentar por 3min, deje enfriar y observe el cambio de color. Agregue
suficiente NaOH al 20% hasta que la solucin sea fuertemente alcalina. El cambio de

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coloracin de amarillo en solucin cida a naranja brillante en solucin lcali constituye


un resultado positivo.
4. Reaccin de Millon: A 0.5 ml de la muestra (Glicina, tirosina, y fenilalanina)
adicione 3 gotas del reactivo de millon y caliente en un bao de agua hirviendo por 10
minutos. Deje enfriar a temperatura ambiente agregue 5 gotas de solucin de nitrito de
sodio, la aparicin de un color rojo ladrillo indica un resultado positivo.
5. Reaccin del cido Glioxlico para el Triptfano: A 1 ml de la muestra (glicina,
tirosina y Triptfano agregue 1 ml de cido glioxlico, Observe bien el color inicial en
cada caso.
Agregue 1 ml de acido sulfrico por las paredes del tubo, la formacin de un anillo color
prpura indica que la reaccin es positiva.
6. Reaccin de Sakaguchi: Mezcle 0.5 ml de lcali fuerte con 1.5 ml de solucin de
aminocido (glicina y arginina) y agregue dos gotas de naftol. Mezcle fuertemente y
agregue cuatro a cinco gotas de agua de bromo. Note el color formado.

PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS
1- Escriba la reaccin para cada prueba realizada.
2- De acuerdo con las pruebas realizadas en esta prctica proponga una clasificacin
para los aminocidos.
3- Identifique los grupos qumicos que caracterizan a los aminocidos.
4- Explique cmo se encuentran estructuralmente los aminocidos en el plasma
sanguneo o lquido intracelular cuyo pH es de 7.4 y 7.1 respectivamente.
5- Cules son las explicaciones prcticas de las pruebas realizadas.

BIBLIOGRAFA

PLUMER, D.T. Introduccin a la bioqumica prctica. Mxico. MaGraw- Hill


Latinoamericana, S.A.

CONN, E y Stumpf, P.K. Bioqumica F.

LOPEZ, E y ANZOLA, C. Guas de laboratorio de Bioqumica. Facultad de ciencias.


Universidad Nacional de Colombia sede Bogota.

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PRACTICA N 2
ALGUNAS PROPIEDADES DE LAS PROTENAS
OBJETIVOS

Comprobar la desnaturalizacin y coagulacin de protenas.


Realizar ensayos de precipitacin de protenas al mezclarlas con sales de metales
pesados, o con reactivos cidicos.
Verificar la importancia de la reaccin de Biuret para el reconocimiento de
protenas.

TEORA RELACIONADA

Las protenas son un grupo de biomolculas caracterizados por su gran variedad


estructural y enorme diversidad de funciones biolgicas. Las protenas de cada ser vivo,
animal o vegetal son especficas ya que estn codificadas por su genoma. A pesar de
que desempean la misma funcin, las protenas presentan ligeras variaciones
estructurales en las diferentes especies. Qumicamente pueden diferenciarse en
protenas simples, constituidas nicamente por aminocidos y protenas complejas que
contienen material adicional como carbohidratos, lpidos o cidos nucleicos.

Las protenas pueden variar sus caractersticas de solubilidad mediante alteraciones en el


medio acuoso en el que se hallen disueltas. Cuando una protena se disuelve en agua, las
fuerzas hidroflicas, electrostticas y los puentes de hidrgeno, participan positivamente,
aportando un mayor grado de solubilidad entre ms efectivas sean estas interacciones.
Sin embargo factores fsicos como el calor, radiaciones, variaciones en los valores de pH
y la presencia de solventes que afecten estas interacciones, pueden producir serias
alteraciones en la solubilidad. Algunas veces pueden ocurrir cambios en la estructura
nativa de la protena y se considera que en estas condiciones la protena se ha
desnaturalizado. El fenmeno fsico observado en este caso, es la formacin de un
cogulo o proceso de coagulacin.

MATERIALES Y REACTIVOS

10 tubos de ensayo 1 Beaker de 400 ml


1 Pinza para tubo de ensayo 1 Gradilla
1 Estufa o calentador 1 termmetro
Reactivo de Biuret
cido Pcrico saturado

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cido Actico 10% Sulfato cprico al 2%


Buffer pH 4.7 Ferrocianuro de potasio acuoso.
Soluciones: Albmina, casena y gelatina Acetato de plomo al 2 %
Acido tnico al 10% Cloruro de mercurio al 2%

PROCEDIMIENTO:

1. Preparacin de soluciones de protenas. Solucin de albmina:

Se prepara mezclando lentamente una clara de huevo con aproximadamente 100ml de


agua, la mezcla se filtra sobre gasa para eliminar la mayor parte de la espuma. Casena:
se toma 1 g de casena y se le agrega lentamente 100 ml de NaOH 0.5 M. Con agitacin
continua, reposar la mezcla durante 5 min y de haber espuma se filtra sobre gasa.
Gelatina: se disuelve 1 g de gelatina en 100ml de solucin salina al 1 %.

2. Determinacin del punto de coagulacin de una protena y demostracin de


la desnaturalizacin:
Rotule 2 tubos de ensayo grandes con las letras A y B, agregue a cada uno 4.5 ml de
solucin de albmina de huevo. Agregue 0.5 ml de Buffer pH 4.7 al tubo A.
Coloque los tubos en un bao de Mara y aumente la temperatura en forma gradual
anotando cualquier cambio en los tubos y la temperatura a que ocurre. Contine
calentando hasta la ebullicin del agua y prolongue el calentamiento por 5 minutos ms,
separe el tubo A, djelo enfriar y agregue 4 ml de buffer pH 4.7, llvelos al bao de agua
caliente hasta ebullicin. Determine si el precipitado que se ha formado, redisuelve
despus de enfriar o diluir con agua.
El punto isoelctrico de la albmina de huevo esta alrededor de pH 4.7; aqu la
coagulacin por calentamiento ocurre ms rpidamente a pH diferente; la
desnaturalizacin ocurre primero despus de calentar; entonces se presenta floculacin,
cuando el punto isoelctrico se restablece, el calentamiento da origen a que la floculacin
se transforme en coagulacin.
3. Precipitacin de Protenas
a) Precipitacin con sales metlicas: En una serie de tres tubos se adiciona en cada
uno 1 ml de solucin ALBUMINA de huevo; adicione a uno 4 gotas de solucin de cloruro
mercrico al 2%, al segundo 4 gotas de una solucin de acetato de plomo al 2%, ms 3
gotas de cido actico y al tercero 4 gotas de sulfato cprico al 2%. , obsrvese
cuidadosamente la formacin o no de precipitados. Explique. Repetir el procedimiento con
solucin de casena y luego por solucin de gelatina.
b) Precipitacin con reactivos acdicos: En tres tubos de ensayo coloque en cada
uno 1.5 ml de solucin de casena. Adale al primero 3 gotas de una solucin acuosa
saturada de cido pcrico, al segundo igual cantidad de una solucin de cido tnico al
10% y al tercero 3 gotas de una solucin acuosa de ferrocianuro de potasio y 1 gota de

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cido actico al 10%. Observe lo que ocurre. Repetir el procedimiento remplazando la


solucin de casena por solucin de albmina.
4. Reacciones colorida:
Las protenas pueden formar compuestos coloreados al reaccionar con determinados
reactivos, entre los que se encuentra el reactivo de Biuret.
Reaccin de Biuret: Es caracterstica del enlace peptdico. A 1.5 ml de la solucin
proteica, aada 1 ml de reactivo de Biuret. Deje reposar la mezcla y observe lo que
ocurre.

PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS
1. Consultar en forma clara y breve en que consiste la desnaturalizacin de las
protenas.
Una protena adopta una estructura en el espacio especfica que es esencial para el
desarrollo de su funcin biolgica. Esta estructura tridimensional es conocida con el
nombre de conformacin espacial y se caracteriza por un plegamiento determinado de su
estructura. La desnaturalizacin de las protenas ocurre cundo se pierde esta
conformacin espacial especfica. https://curiosoando.com/que-es-la-desnaturalizacion-
de-proteinas
Se llama desnaturalizacin de las protenas a la prdida de las estructuras de orden
superior (secundaria, terciaria y cuaternaria), quedando la cadena polipeptdica reducida a
un polmero estadstico sin ninguna estructura tridimensional fija.

2. Explique qu sucede cuando el cabello se somete a los tintes, de ris y alisado,


este proceso es reversible o irreversible.
Los tratamientos qumicos sobre todo si se aplican frecuentemente, penetran el cabello a
todos sus niveles dandolo estructuralmente, tambin levantan la cutcula dejndolo
dbil, deshidratado y frgil. Esta condicin aumenta el ndice de friccin entre fibra y fibra
provocando que el cabello se enrede y sea difcil de peinar. El alisado en exceso y hacerlo
de la punta hacia la raz es una de las operaciones ms dainas pues adems de debilitar
el cabello se pierde progresivamente la cutcula. Por lo general estos daos son
irreversibles, adems el alisado debe hacer con cuidado puesto que esto puede ocasionar
que la fibra de queratina se d forme permanentemente

3. Explique por qu las pezuas, los cuernos, las uas, el cabello y las plumas no
se disuelven con el agua.

No se disuelven en agua por que posee una protena llamada queratina la cual, tiene una
estructura fibrosa asiendo que sea inerte e insoluble en agua, y por consiguiente las
pezuas, los cuernos, las uas, el cabello y las plumas que son fanera conformadas por
esta protena sean insolubles en agua dado a que la queratina constituye el componente
principal que forman las capas ms externas de la epidermis de estas

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Explique por qu las pezuas, los cuernos, las uas, el cabello y las plumas no se
disuelven con el agua. http://www.buenastareas.com/ensayos/Desnaturalizacion-De-Una-
Proteina/31543669.html

3. Consultar de qu depende la solubilidad de las protenas.


La solubilidad de las protenas depende de varios factores, entre ellos:
De la cantidad de grupos polares presentes en los aminocidos que conforman la
protena. La presencia de grupos laterales de aminocidos polares y ionizados
genera una interaccin con las molculas de agua, aumentando la solubilidad. La
mayor parte de las protenas son solubles en agua.
De la presencia y disposicin de grupos no polares en cadenas laterales de los
aminocidos que forman la protena.
De factores externos a la protena como son: el pH, la temperatura, la presencia
de sales inorgnicas, o solventes polares.
4. Explique cuando es positiva la reaccin de Biuret, escriba la reaccin
Esta reaccin es positiva cuando la molcula contiene dos uniones peptdicas o ms,
cercanas entre s (es decir, tripptidos en adelante). Se realiza tratando la solucin a
ensayar con CuSO4 en medio alcalino de NaOH.
Se observa el color violeta indicador de la presencia de protenas en ambas muestras
Se observa el color violeta indicador de la presencia de protenas en ambas muestras
Las protenas dan color violeta, las peptonas (PM mayor 5000) color rojo-morado. El color
desarrollado se debe a la formacin de un complejo de coordinacin con el Cu++
http://blogs.unlp.edu.ar/quimicaorganica/category/proteinas/
5. Consulte otras tcnicas utilizadas para la cuantificacin de protenas.
Absorcin en el ultravioleta (280 nm)

La mayora de las protenas absorben en el UV a 280 nm. Debido bsicamente a grupos


cromforos de tirosina y triptofano. Si se considera que la cantidad de estos dos
aminocidos es siempre constante la absorbancia debe ser proporcional a la
concentracin de protena.

Lowry

Se basa en el desarrollo de un color azul debido a: 1) Reaccin de Biuret. 2) Reduccin


del reactivo de fosfomolibdeno-volframato por aminocidos como tirosima y triptfano
presentes en las protenas.

Urbidimtrico

Las protenas se pueden precipitar con cido tricloroactico, cido sulfosaliclico o


ferrocianuro de potasio en cido actico. Se produce turbidez que puede ser
estandarizada a una temperatura, concentracin y tiempo de reaccin para medirse a 600
nm. Se requiere de curva estndar. El intervalo recomendado va de 0.5 a 1.5 mg de
protena.

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Kjeldahl

Determina nitrgeno total tanto orgnico (nitrgeno amino y amido) como nitrgeno no
proteico (urea, aminocidos, etc.). El mtodo consiste en la digestin de la muestra con
H2SO4, y la formacin de NH2OH que es recibido en cido para finalmente titularlo con
lcali de una concentracin conocida.

Dumas

Mide nitrgeno total despus de la combustin de la muestra (700-900C). La medicin de


nitrgeno elemental desprendido se hace volumtricamente en un nitrmetro.

http://www.edukativos.com/apuntes/archives/1937

BIBLIOGRAFA:

PLUMER, D.T. Introduccin a la bioqumica prctica. Mxico. MaGraw- Hill


Latinoamericana, S.A.

CONN, E. y Stumpf, P.K. Bioqumica F.

LPEZ, E y ANZOLA, C. Guas de laboratorio de Bioqumica. Facultad de Ciencias.


Universidad Nacional sede Bogot.

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PRACTICA N 3
CATLISIS ENZIMTICA E INORGNICA

OBJETIVOS

Comparar la accin cataltica de la enzima catalasa, con la de un catalizador


inorgnico como el bixido de manganeso (MnO2) al descomponer en
perxido de hidrgeno (H2O2) a temperatura ambiente.
Observar el efecto de la temperatura sobre la accin cataltica de una enzima y
comparar el mismo efecto de temperatura sobre un catalizador inorgnico.
Observar la accin de un inhibidor sobre la actividad cataltica de una enzima.

TEORA RELACIONADA

Las enzimas son catalizadores biolgicos de estructura proteica y producidos por los
mismos organismos que las utilizan para realizar sus propios procesos metablicos. La
accin cataltica de una enzima est sometida a la influencia de factores fsicos como son,
el calor, las radiaciones o de factores qumicos como cambios en el pH y en la
concentracin de la enzima, sustrato y la presencia de inhibidores. En cambio los
catalizadores inorgnicos, en algunos casos, no son afectados por factores fsicos como
el calor, por tanto, pueden catalizar una determinada reaccin pese a cambios en la
temperatura.

La reaccin que se presenta en la experiencia a realizar se puede describir en la siguiente


forma:

Catalasa
H2O2 H2O + O2

MnO2
H2O2 H2O + O2

MATERIALES Y REACTIVOS
6 tubos de ensayo Pinza para tubos de ensayo
2 pipetas de 5 y 10 ml Gotero
Beaker de 400ml Agua destilada
Calentador Probeta de 100ml

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Esptula Gradilla
Mortero con mano

Perxido de Hidrgeno (H2O2) al 3% Sangre como fuente de catalasa


(extraerse)
Bixido de Manganeso (MnO2)
Hielo (traer de la casa)
Cianuro de Sodio (NaCN)
Gasa (traer)
Papas como fuente de catalasa (traer)
Cuchilla (traer de la casa)

PARTE EXPERIMENTAL
1. Rotular tres tubos de ensayo y agregar a cada uno las siguientes sustancias:
Tubo N1 1ml de sangre al 10%
Tubo N2: 1 ml de extracto de papa.
Tubo N3: Una pequea porcin de MnO2
2. Agregar a cada uno de los tubos 2ml de H2O2 al 3%. Observar la intensidad de la
reaccin por el burbujeo del oxgeno y la liberacin de calor. Compare el nivel alcanzado
por las burbujas en cada uno de los tubos y registre en orden creciente la actividad
cataltica con base en este parmetro.
3. Prepare 3 tubos de acuerdo al numeral 1 y Colquelos en un bao con agua a
ebullicin durante diez minutos, retirarlos y dejar en reposo dentro de un bao de agua a
temperatura ambiente durante 10 min. Adicionar a cada tubo 2ml de H2O2 al 3%.
Compare el nivel alcanzado por las burbujas en cada uno de los tubos y registre en orden
creciente la actividad cataltica con base a este parmetro.
4. Prepare nuevamente 3 tubos de acuerdo al numeral 1 y colquelos en un bao de
hielo durante 10 min. Adicionar a cada tubo 2 ml de H2O2 al 3%. Compare el nivel
alcanzado por las burbujas en cada uno de los tubos y registre en orden creciente la
actividad cataltica con base en este parmetro.
5. Prepare nuevamente 3 tubos de acuerdo al numeral 1, adicione a cada tubo uno 6
gotas de NaCN y dejar en reposo durante 5 min, luego adicione 2ml de H 2O2 al 3% a
cada tubo. Compare el nivel alcanzado por las burbujas en cada uno de los tubos y
registre en orden creciente la actividad cataltica con base en este parmetro.

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PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS
1. Explique por qu el captopril y el enalopril son ejemplos de inhibidores competitivos
de la enzima conversora de la angiotensina.
2. Las granadas son fabricadas por la industria militar con un dispositivo especial de
seguridad para que no exploten en el sitio donde son fabricadas, si no durante el
combate, Qu tipo de enzimas son fabricadas por ciertos rganos que tienen un
comportamiento similar al de las granadas? De ejemplos.
3. Por qu carece de importancia la lipasa gstrica en los procesos digestivos del
estmago de los adultos y en cambio es importante en el estmago infantil?
4. Cul es la importancia mdica de las enzimas? De por lo menos un ejemplo concreto.
5. Defina que son: Zimgenos, Isozimas, Inhibidores acompetitivos.
6. Qu diferencias hay entre inhibidores orgnicos e inorgnicos?
7. Qu funcin cumplen las vitaminas hidrosolubles en las reacciones catalizadas por
enzimas?.
8. Explique como se da el proceso de regulacin de la actividad enzimtica en el
organismo?.

BIBLIOGRAFA:
PLUMER, D.T. Introduccin a la bioqumica prctica. Mexico. MaGraw- Hill
Latinoamericana, S.A.
CONN, E y Stumpf, P.K. Bioqumica F.
LOPEZ, E y ANZOLA, C. Guas de laboratorio de Bioqumica. Facultad de ciencias.
Universidad Nacional de Colombia sede Bogota.

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PRACTICA N 4
PRUEBAS CUALITATIVAS PARA CARBOHIDRATOS

OBJETIVOS.
Reconocer la presencia de carbohidratos en una muestra problema mediante la
prueba de molish.
Diferenciar carbohidratos reductores de no reductores por su comportamiento
frente al reactivo de Benedict.
Realizar ensayos cualitativos para el reconocimiento de carbohidratos especficos.

TEORA RELACIONADA

PRUEBA DE MOLISH: El cido sulfrico concentrado hidroliza los enlaces glicosdicos


para dar monosacridos que pueden ser luego deshidratados dando furfural y sus
derivados. Estos productos se combinan con -naftol sulfonato, originando un complejo
prpura. Esta reaccin es general para los carbohidratos pero algunos otros compuestos
orgnicos dan tambin furfural con cido sulfrico concentrado.
PRUEBA DE BENEDICT: Es una modificacin de la prueba de felhing, introducida por
Benedict. En ella se usa nicamente una solucin, lo cual lo hace mucho ms simple con
la ventaja adicional de que el reactivo es ms estable que el de felhing. Esta prueba solo
la dan los azucares reductores.
PRUEBA DE BARFOED: reactivo de Barfoed es dbilmente cido y solamente puede ser
reducido por monosacridos. Si se deja hervir por largo tiempo existe la posibilidad de
hidrolizar los disacridos dando as reacciones falsamente positivas. El precipitado de
oxido cuproso es menos denso que en los mtodos previos y se recomienda dejar el tubo
en reposo hasta que el precipitado sedimente.
PRUEBA BIAL PARA PENTOSAS. Cuando se calientan las pentosas en cido
clorhdrico concentrado se forma furfural que se condensa con orcinol en presencia de
iones frricos para dar un color verde azuloso.
PRUEBA DE SELLIWANOFF. Las cetosas deshidratan ms rpidamente que las
aldosas dando derivados del furfural que se condensan con resorcinol para formar un
complejo rosado; por lo tanto debe evitarse un calentamiento prolongado de la muestra
que se est estudiando.

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PRUEBA PARA SACAROSA. La sacarosa es el nico disacrido comn no reductor y


por lo tanto no reduce las soluciones alcalinas de cobre. Esta es hidrolizada en solucin
cida y luego se ensayan la glucosa y la fructosa resultante.
PRUEBA PARA POLISACRIDOS. Los polisacridos contienen slo un grupo reductor
por varios cientos o ms residuos, as que en la prctica, no son reductores. La hidrlisis
cida libera los monosacridos constituyentes que luego son ensayados.

MATERIALES Y REACTIVOS

Estufa o calentador Pinza para tubos de ensayo

Pipetas de 5 y de 10ml Gradilla

Beakers de 100 y 400ml Gotero

10 tubos de ensayo Papel tornasol

Soluciones de: glucosa, galactosa, ribosa, arabinosa, sacarosa, lactosa, fructosa, almidn,
leche (traer de la casa)

Solucin de yodo. Reactivo de Bial

Reactivo de Molish Reactivo de Selliwanoff

Acido sulfrico concentrado Alcohol Amilico

Reactivo de Benedict Acido clorhdrico concentrado

Reactivo de Barfoed Hidrxido de sodio 1M

PROCEDIMIENTO

Prueba de Molish: Agregue 5 gotas del reactivo de Molish a 1 ml de una muestra que
contenga carbohidratos (Leche). Aada cuidadosamente por las paredes del tubo 1ml de
cido sulfrico concentrado, hasta que se formen dos capas. Observe cualquier cambio
de color en la interfase de los dos lquidos.
Prueba de Benedict: Tome 3 tubos de ensayo; agregue al primero 0.5 ml de solucin de
lactosa, al segundo 0.5 ml de solucin de glucosa y al tercero 0.5 ml de solucin de
sacarosa. Adicione 0.5 ml del reactivo de Benedict a cada tubo y colquelos en un bao
de agua hirviendo por 3 min. La formacin de un precipitado de color rojo ladrillo indica la
presencia de azcar reductor.

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Prueba de Barfoed: Tome 3 tubos de ensayo; adicione al primero 0.5 ml de solucin de


galactosa, al segundo 0.5 ml de solucin de ribosa y al tercero 0.5 ml solucin de
almidn. Adicione 1 ml del reactivo de Barfoed a cada tubo, hierva por 2 min y deje
reposar. La formacin de un precipitado de color rojo ladrillo indica la presencia de
monosacridos.
Prueba Bial : Tome 3 tubos de ensayo; adicione al primero 0.5ml de solucin de ribosa,
al segundo 0.5ml de solucin de arabinosa y al tercero 0.5ml de solucin de almidn.
Adicione 0.5 ml del reactivo de Bial a cada tubo y caliente hasta que empiece a hervir,
dejar enfriar y luego agregue 1 ml de alcohol amilico y agite, la aparicin de una
coloracin azul verdosa es prueba positiva es prueba positiva para pentosas.
Prueba de Salliwanoff: Tome 3 tubos de ensayo; adicione al primero 0.5ml de solucin
de fructosa, al segundo 0.5ml de solucin de arabinosa y al tercero 0.5ml de solucin de
glucosa. Adicione 1ml del reactivo de Selliwanoff a cada tubo. Caliente durante 1 min en
un bao de agua hirviendo, la aparicin de un color rojo o rosado es prueba positiva para
cetosas.
Prueba para sacarosa: A 2.5 ml de una solucin de sacarosa agregue 3 gotas de cido
clorhdrico concentrado, caliente durante 5 minutos en un bao de agua hirviendo, enfri y
agregue Hidrxido de Sodio 1M hasta que la solucin sea neutra o ligeramente alcalina
(prueba con papel tornasol), divida la solucin hidrolizada en dos porciones y realice por
separado las pruebas de Benedict y Selliwanoff.
1. Prueba para polisacridos: Coloque 1ml de solucin de almidn, aada 1 gotas
de solucin de yodo. Observe la produccin de un color azul. Caliente el tubo
Qu observa? Deje enfriar y observe nuevamente, Qu ocurre? Explique sus
observaciones.

PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS
1. Escriba cada una de las reacciones en las diferentes pruebas para carbohidratos.
2. Explique los resultados de cada una de las pruebas realizadas?
3. Explique estructuralmente, porque la maltosa es un azcar reductor y por que el
almidn no
4. Consulte las enfermedades producidas por el mal metabolismo de los
carbohidratos.
5. Por qu la celulosa a pesar de estar formada por molculas de glucosa es
insoluble en agua.
6. porque la sacarosa es un azcar no reductor
7. Consulte el fundamento de otras tcnicas usadas para la determinacin de la
glucosa en el laboratorio.

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BIBLIOGRAFA:

PLUMER, D.T. Introduccin a la bioqumica prctica. Mexico. MaGraw- Hill


Latinoamericana, S.A.

CONN, E y Stumpf, P.K. Bioqumica F.

LOPEZ, E y ANZOLA, C. Guas de laboratorio de Bioqumica. Facultad de ciencias.


Universidad Nacional de Colombia sede Bogot.

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LABORATORIO DE BIOQUMICA
PRACTICA N 5
ALGUNAS PROPIEDADES FSICAS Y QUMICAS DE LOS LPIDOS

OBJETIVOS:
Determinar la solubilidad de los lpidos en solventes orgnicos.
Realizar la reaccin de saponificacin y determinar algunas propiedades de los
jabones.
Comparar el grado de instauracin de algunos lpidos.

TEORA RELACIONADA

Los lpidos, cuyo nombre deriva del griego lipos: (grasa). Son molculas de estructura
variada cuya propiedad fundamental que ha permitido su aislamiento y caracterizacin es
la de ser insolubles en agua y solubles en disolventes orgnicos tales como el benceno,
cloroformo, ter, etc. Constituyen una excepcin a esta regla las esfingomielinas que no
son solubles en ter y los fosfolpidos que no son solubles en acetona. Todos los mtodos
de obtencin de lpidos utilizan en gran medida estos criterios de solubilidad. Los lpidos
ms comunes y abundantes en los alimentos de origen vegetal y animal son los aceites y
las grasas, los cuales consumidos en la dieta y conjuntamente con los sintetizados
endgenamente tienen mltiples funciones en el organismo:
Funcin energtica o de reserva: Las grasas neutras (Triacilgliceroles) se
almacenan en los adipositos y suministran caloras fcilmente utilizables en
perodos de escasez. El panculo adiposo subcutneo es as mismo un eficaz
protector contra el fro externo.
Funciones Estructurales: Todas las membranas biolgicas estn formadas por
fosfolpidos, glicolpidos y algunas veces esteroides estructurados en bicapas.
Funciones catalticas: Algunos lpidos actan en pequeas cantidades como
activadores o reguladores del metabolismo; por ejemplo, las vitaminas
liposolubles, las hormonas esteroideas o las prostaglandinas.

MATERIALES Y REACTIVOS
10 tubos de ensayo Calentador
2 gradillas Capsula de porcelana
Pipetas de 5 y 10 ml 1 vaso de 250 ml

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Pinza para tubo de ensayo Esptula


Pinza para crisol Gotero

Escamas de jabn (traer de la casa) Cloruro de magnesio (50g/L)


Aceite vegetal (traer de la casa) Acetato de Plomo (50 g/L)
Etanol al 95% Cloruro de sodio
ter etlico Solucin de yodo
Cloroformo Acido sulfrico concentrado
Acetona Hidrxido de sodio al 10%
Benceno Acido oleico
Cloruro de calcio (50g/L) Acido esterico.

PROCEDIMIENTO

1. Solubilidad
Numere 7 tubos de ensayo y coloque en cada uno 2 ml de aceite vegetal, luego agregue a
cada tubo de manera diferente, 1 ml de cada una de las siguientes sustancias:
Agua destilada, etanol, etanol caliente, benceno, cloroformo, ter etlico y acetona. Agite
cada tubo. Deje en la gradilla por 2 min y observe los resultados.
a. Cuales son los mejores disolventes para las grasas?
b. Cuales no disuelven las grasas?
c. Como explican ustedes los resultados?

2. Emulsificacin
En dos tubos de ensayo coloque 2 ml de aceite vegetal. Aada a cada uno 2 ml de agua
destilada. A una de los tubos agregue algunas escamas de jabn. Agite bien ambos
tubos. Observe lo que ocurre.
a. Cmo se denomina la mezcla formada?
b. Cmo esta constituida dicha mezcla? Deje los tubos en reposo en la gradilla y
obsrvelos varias veces durante quince minutos.
c. Cmo es la estabilidad de las mezclas en los dos tubos?
d. Explique los resultados?

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3. Saponificacin
En una capsula de porcelana coloque unos 20 ml de agua y somtalos a ebullicin
(mantenga el volumen constante). Cuando estn hirviendo aada 1 ml de cido
oleico. Agregue ahora cuidadosamente y gota a agota una solucin de NaOH al 10%,
hasta que el medio sea claro. Tenga cuidado de no aadir un exceso de lcali.
a. En que consiste la solucin formada?
b. Escriba la reaccin qumica que ocurre?

Numere ahora cinco tubos de ensayo y coloque en cada uno dos ml de la solucin
anterior realizando las siguientes pruebas:
Tubo#1. sature la solucin con NaCl.
Tubo#2. Agregue cinco gotas de cido sulfrico concentrado.
Tubo#3. Agregue cinco gotas de solucin de cloruro de calcio.
Tubo#4. Agregue cinco gotas de solucin de cloruro de magnesio.
Tubo#5: Agregue cinco gotas de solucin de acetato de plomo.
Observe y anote los resultados. Explique lo que ocurre en cada caso. Explique las
reacciones qumicas correspondientes.
4. Insaturacin.
Tome 3 tubos de ensayo y agregue; 1ml de aceite vegetal al primero, 1ml de acido oleico al
segundo y una pequea cantidad de acido esterico al tercero. Adicione a cada tubo 2 ml de
cloroformo y agite bien, deje 2 ml de cloroformo en otro tubo como control. Agregue solucin
de yodo gota agota a cada uno de los 4 tubos, agitando despus de cada adicin. La solucin
de yodo decolora si hay cidos grasos insaturados. Continu agregando (mximo 15 gotas),
hasta que el color del yodo sea estable.
a. Cuantas gotas de solucin de yodo se necesitaron en cada tubo para que el color
permaneciera estable?
b. Explique los resultados obtenidos?
c. Escriba la reaccin qumica general de lo ocurrido.
d. Consultar teora relacionada de lpidos.

PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS
1. Qu tipo de compuesto qumico es el jabn?
2. Qu diferencia hay entre jabones y detergentes sintticos?

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3. Que producto se prefiere generalmente en el trabajo de lavandera domestica, un


detergente sinttico o un jabn por qu?
4. Explique con sus propias palabras y por medio de un dibujo como un detergente puede
desprender las manchas de aceite y grasa de las telas?
5. Que son detergentes biodegradables y no degradables?
6. Explique estructuralmente y con sus propias palabras por que los aceites vegetales son
lquidos a temperatura ambiente y las grasas son slidas?
7. Cules son los cidos grasos presentes en la mantequilla, margarina, y aceites
vegetales?
8. Explique qu relacin hay entre los cidos grasos omega 3 y la enfermedad cardiaca?
9. Cul es el nombre del esteroide que se presenta como un detergente en el cuerpo
humano?

BIBLIOGRAFA
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LABORATORIO BIOQUMICA
PRACTICA N 6
VITAMINAS Y MINERALES

OBJETIVOS:
Separar algunos constituyentes de la leche
Identificar la presencia de vitaminas y minerales en la leche
Reconocer la vitamina A presente en la mantequilla.

TEORA RELACIONADA

Algunas enzimas requieren para su funcin la presencia de sustancias no proteicas que


colaboran en la catlisis. Estas sustancias se llaman en general cofactores. Los
cofactores de naturaleza orgnica se suelen denominar coenzimas.
Hay coenzimas que no pueden ser sintetizadas integralmente en el organismo, sino que
algunos de sus componentes o precursores debe ser incorporado a partir de la dieta.
Entre los precursores exgenos necesarios para el normal desarrollo, crecimiento y
reproduccin de una gran variedad de seres vivos se encuentra un grupo de biomolculas
orgnicas llamadas vitaminas, adems de otras sustancias de carcter inorgnico
frecuentemente conocidas como minerales.

MATERIALES Y REACTIVOS
Vaso de precipitados de 400ml Gradilla
Probeta de 50ml Embudo de vidrio
Erlenmeyer de 100ml Esptula
Pipetas de 5 y 10ml Vitamina A (traer)
Agitador de vidrio Leche (traer)
Tubos de ensayo (5)

Acido actico al 10% Oxalato de amonio al 4%


Ferrocianuro de potasio al 1% Acido molibdico (SOLUCIN)
KCL Acido 1,2,4 aminonaftolsulfonico
NaOH al 10% Cloroformo
Alcohol isobutilico

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PROCEDIMIENTO
1. PRECIPITACIN DE LA CASENA
En un vaso de precipitado de 400ml; agregar 50ml de leche y 50ml de agua destilada,
aadir con una pipeta gota a gota y con agitacin constante acido actico al 10% hasta la
formacin de un precipitado floclenlo de casena. Dejar decantar y filtrar sobre gasa;
descartar la casena que no es de inters en la presente practicay conservar el filtrado
para las posteriores pruebas cualitativas de vitamina B1( tiamina) y minerales.
2. VITAMINA B1.
Vierta 2.5ml de filtrado en un tubo de centrifuga; aada una pequea cantidad de KCl, y
0.5ml de ferrocianuro de potasio al 1% y 1ml de NaOH al 10%, mezcle y disuelva
totalmente el KCl. Agregar 2.5ml de alcohol isobutilico, agitar cuidadosamente por 2 min y
centrifugar por 5 min a 2000 rpm. La formacin de precipitado indica la presencia de
vitamina B1
3. CALCIO
A 0.5 ml de filtrado adicionar unas gotas de solucin de oxalato de amonio al 4%.
Observar el precipitado que se forma.( dejar reposar 10min)
4. FOSFATOS
A 0.5 ml de filtrado adicionar 0.5ml de acido molibdico y 0.5ml de acido 1, 2, 4,
aminonaftolsulfonico. Observe la coloracin obtenida.
5. VITAMINA A
En un tubo de ensayo; disolver una capsula de vitamina A de 100U, luego se disuelve en
1ml de cloroformo y adicionar 5 gotas del reactivo de Carr-Price. En presencia de vitamina
A, se produce un intenso color azul que desaparece al poco tiempo.

PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS
1. Cual es el fundamento qumico de los procedimientos desarrollados en la
prctica?
2. Que importancia presenta la vitamina a, la tiamina, el calcio y los fosfatos en
mamferos?

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PRACTICA N 7
IDENTIFICACIN DE CUERPOS CETNICOS EN ORINA

OBJETIVOS
Determinar la presencia de cuerpos cetnicos en orina, mediante pruebas
cualitativas para cada uno de ellos.
Familiarizarse con algunos protocolos empleados en laboratorios clnicos para el
reconocimiento de cuerpos cetnicos

TEORA RELACIONADA
Los cuerpos cetnicos son los cidos acetoactico, la acetona y el cido - hidrxibutirico.
En la cetsis, hallamos un aumento de estas sustancias en la sangre y en la orina. Bajo
buenas condiciones de salud, los cuerpos cetnicos se forman en el hgado y son
completamente metabolizados, de tal manera que solo cantidades insignificantes
aparecen en la orina. Por el contrario, en casos de diabetes, inanicin, vmitos con
deshidratacin y despus de la exposicin al fro y/o ejercicio vigoroso, los cuerpos
cetnicos pueden encontrarse en cantidades apreciables en la orina, lo cual permite su
determinacin cualitativa.
La determinacin de acetona (Mtodo de Imbert), se fundamenta en la formacin de un
ferropentacianuro con el derivado isonitrado de la acetona, la determinacin de acido
acetoactico (Mtodo de Gerhrdt), se basa en la aparicin de una coloracin rojo-vinosa
con el cloruro frrico y en el Mtodo de Hart, el acido - hidrxibutirico es transformado en
acetona, la cual se identifica mediante el reactivo de Imbert.

MATERIALES Y REACTIVOS

2 tubos de ensayo 1 capsula de porcelana


1 gradilla 1 pinza para crisol
2 pipetas 1 pinza para tubos de ensayo
1 beaker de 250ml

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Agua destilada Cloruro frrico al 10%


Orina de diabtico (traer) Perxido de hidrogeno al 10%
Acido actico glacial Nitroprusiato de sodio al 5% en
CH3COOH al 50%
Amoniaco

PROCEDIMIENTO

DETERMINACIN DE ACETONA:

A 5 ml de orina, agregue 0.5ml de nitroprusiato de sodio disuelto al 5% en acido actico al


50%, adicione 0.5ml de amoniaco por las paredes del tubo, la aparicin de un anillo rojo
violceo en l contacto de los lquidos, es indicativo de la presencia de acetona.

DETERMINACIN DE ACIDO ACETOACTICO.

A 5 ml de orina de adicionan unas gotas de cloruro frrico, en presencia de acido


acetoactico se produce una coloracin rojo-vinosa.

DETERMINACIN DE ACIDO -HIDROXIBUTRICO

En una capsula de porcelana se mezclan 10ml de agua y 10 ml de orina, se acidifica con


unas 5 gotas de acido actico y se calienta en una estufa hasta reducir el volumen a la
mitad. Con este calentamiento se eliminan la acetona y el acido acetoactico, al contenido
de la capsula se le agregan 10ml de agua y se transfiere en partes iguales a dos tubos de
ensayo, uno de estos tubos servir como control, al otro se le adiciona 1ml de peroxido de
hidrogeno al 10% y se calienta en bao de Mara por 5 min, se deja enfriar y finalmente se
practica la prueba de Imbert a ambos tubos.

PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS
1. Qu otro tipo de sustancias pueden determinarse en la orina por un metabolismo
anormal de lpidos.
2. Qu es la cetsis y la Cetonuria.

BIBLIOGRAFA

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PRACTICA N 8
PRODUCCIN DE PIRUVATO DURANTE LA FERMENTACIN

OBJETIVOS.

Determinar la presencia de piruvato mediante la fermentacin de levadura.


observar la produccin de piruvato, mediante cambios de color.

TEORA RELACIONADA
La produccin de piruvato durante la fermentacin se realiza por una serie de reacciones
enzimticas que involucran algunos intermediarios. Este proceso se conoce como
fermentacin o gluclisis.
La reaccin total podra considerarse como la transferencia de dos pares de tomos de
hidrgeno de la glucosa al nad+. Los metabolitos de piruvato y acetaldehdo se
encuentran normalmente en bajas concentraciones, por lo tanto para comprobar su
existencia es necesario impedir su transformacin.
La piruvato descarboxilasa no es activa en soluciones ligeramente alcalinas, de manera
que el piruvato se acumula y su presencia se demuestra con la 2,4- dinitrofenilhidracina.

MATERIALES Y REACTIVOS
Tubos de ensayo (4) Calentador
Tubos de centrfuga (2) Pinzas para tubo de ensayo (2)
Beaker de 400mL Termmetro
Pipetas de 5mL (3) Esptula
Balanza

Solucin de glucosa 10% 2,4-dinitrofenilhidracina saturado en HCl


2M
Fosfato de sodio dibsico 0,5 M
NaOH 10%
Fosfato de potasio monobsico 0,5 M
Levadura (TRAER)
cido tricloroactico 10%

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PROCEDIMIENTO
En dos tubos de ensayo A y B aada respectivamente 2.5 ml de solucin de glucosa al
10%. Al tubo A agregue 2.5ml de suspensin de levadura al 10% P/V en solucin de
fosfato de sodio dibsico 0,5 M; al tubo B agregue 2.5ml de suspensin de levadura al
10% P/V en solucin de fosfato de potasio monobsico 0,5M.
Coloque en bao de mara a 37C durante 1 hora, luego agregue a cada tubo 2 ml de
A.T.A al 10%P/V, mezcle vigorosamente y centrifugue durante 10 minutos a 2500 rpm.
A 1 ml del sobrenadante agregue 0.5ml de solucin saturada de 2,4- dinitrofenilhidracina
en HCl 2M. Mezcle fuertemente, tome 0,5 ml de esta mezcla y agregue 1 ml de NaOH al
10% y 0,5 ml de agua.
La formacin de un color rojo indica la presencia de piruvato. Repita esta prueba usando
una solucin de glucosa en vez del sobrenadante.

PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS
1. Cul es la funcin del cido tricloroactico?.
2. Qu conclusiones se podran sacar de los resultados de las muestras A yB?
3. Cul es la reaccin de la 2,4- dinitrofenilhidracina con el pirivato?.
4. Qu funcin cumple el NAD+ en la produccin del piruvato.
5. Consulte la va de la gluclisis y determine los pasos irreversibles de esta va.

BIBLIOGRAFA
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PRACTICA N 9

TRANSPORTE DE CARGAS EN SISTEMAS BIOLGICOS

OBJETIVOS
Obtener un extracto de succinato deshidrogenada a partir de tejido heptico.
Identificar cualitativamente la actividad del succinato deshidrogenada mediante el
uso de un aceptor electrnico.
Observar el efecto inhibitorio del malonato sobre la actividad de la enzima
succinato deshidrogenada.

TEORA RELACIONADA.
Las clulas de la gran mayoras de los organismos vivos llevan a cabo un conjunto de
reacciones de oxido reduccin mediante la cual la gran cantidad de energa liberada a
travs de la degradacin de molculas orgnicas es almacenada en molculas de alto
nivel energtico (ATP). La succinato deshidrogenada una enzima clasificada dentro del
grupo de las oxidorreductasas cataliza una reaccin muy importante en el metabolismo
oxidativo de la clula: la conversin del succinato en fumarato.
La succinato deshidrogenada remueve 2H+ y 2 electrones del succinato para formar
fumarato y la coenzima reducida (FADH2). La enzima esta sujeta a una poderosa
inhibicin competitiva por parte de reactivos como el malonato lo cual constituye una
manera de inhibir la actividad de la enzima a nivel de laboratorio. Para estudiar el
transporte de cargas en la reaccin se empleara un aceptor artificial de electrones (azul
de metileno), cuya decoloracin permite diferenciar la actividad enzimatica en los ensayos
a realizar en la presente prctica.

MATERIALES Y REACTIVOS.
Vasos de precipitado de 25y 400 ml Pipetas de 5 ml (2)
Tubos de centrifuga Pipeta de 1 ml (1)
Mortero con maso Gradilla para tubos de ensayo
Termmetro Tubos de ensayo (3)

Buffer fosfato 0.1M pH 7.4 Malonato de sodio 0.1M


Succinato de sodio 0.1M Azul de metileno 0.1%

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Aceite vegetal (traer) Hgado y Hielo (traer de la casa)

PROCEDIMIENTO
1. OBTENCIN DEL EXTRACTO ENZIMTICO
Tomar una muestra de aproximadamente 5g de hgado heptico libre de sangre y
colocarlos en un mortero con arena lavada, macere cuidadosamente hasta formar una
mezcla suave adicionando poco a poco tres porciones (cada una de 5ml) de buffer
fosfato0.1M Y pH 7.4. Transfiera la mezcla a un vaso de 25ml y mantngalo en un bao
con hielo durante 15min, mezclando ocasionalme. Pase la mezcla a tubos de centrifuga y
centrifugue a 1600rpm durante 10min. Transfiera el sobranadante a un vaso de 25ml y
marquelo como extracto enzimtico, mantngalo en bao de hielo hasta su posterior uso.
2. SEGUIMIENTO DE LA REACCIN

Preparar una serie de 3 tubos de ensayo debidamente rotulados, adicionar a cada tubo
(1,2 y 3) 0.5ml de azul de metileno al 0.1%, luego a los tubos 2 y 3 agregar 1 ml de
succinato de sodio 0.1M y solo al tubo 3 agrguele 1ml de malonato de sodio 0.1M. Dejar
los tubos en incubacin a 37C durante 10 min. (Manteniendo la temperatura constante).
Sin retirarlos del bao, agregar 1.5ml de extracto enzimtico a cada uno de los tubos (1,2y
3), agite bien adicione 2ml de aceite vegetal a cada uno de los tubos.

Al cabo de 40 min observe el color de cada tubo, tenga en cuenta que el tubo 1 es el
control.

PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS

1. Escriba la reaccin mediante la cual el succinato se transforma en fumarato.


2. Que papel desempea el aceite vegetal en el experimento.
3. Que efecto tendra un exceso de succinato sobre la reaccin.
4. Que sustancias pueden inhibir la conversin de succinato en fumarato, en adicin
al malonato.
5. En que rutas esta metablicas esta involucrado el succinato.

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PRACTICA N 10
FORMACIN DE CIDO LCTICO EN LA GLUCLISIS

OBJETIVOS
Producir cido lctico a partir del msculo de rata.
Comprobar la formacin de dicho cido mediante pruebas caractersticas.

TEORA RELACIONADA (CONSULTAR).

PROCEDIMIENTO
Sacrifique una rata o curiel y extraiga los msculos de las patas. Desmenuce rpidamente
con ayuda de una tijera y macere en un mortero limpio y seco manteniendo a baja
temperatura. Pese dos porciones de 1 g del macerado y virtalas en dos tubos de ensayo.
Uno de los tubos de ensayo se utilizar como control, agrguele inmediatamente 1 ml de
A.T.A al 20%. En ambos tubos de ensayo agregue (5 ml de solucin de glucosa al 0,5 %
en bicarbonato de sodio 0,5 M ).agregue 5 gotas de vaselina o aceite vegetal.
Seguidamente coloque los tubos en un bao de Mara a 37 C durante 2 horas.
Despus de la incubacin en el tubo de ensayo experimental se vierte 0.5 ml de la
solucin de A.T.A al 20%, se agita, y los contenidos de ambos tubos se filtran aparte.
Para precipitar los carbohidratos se toman de cada uno de los tubos 2.5 ml del filtrado, se
les agrega 2 ml de solucin de sulfato de cobre al 20 % y 0.5g de hidrxido de calcio. Las
muestras se agitan cuidadosamente y despus durante un periodo de 15 minutos, se
repite la operacin alternndola con intervalos de reposo. Seguidamente se filtran.
Con cuidado se toman 1 ml del filtrado y se vierten al otro tubo de ensayo, el cual se
coloca en un bao de hielo y se le agrega 15 gotas de cido sulfrico. Las muestras se
colocan seguidamente en un bao de agua hirviendo por 4 minutos. E inmediatamente se
colocan en un bao de hielo. Una vez que se ha enfriado se agrega a cada tubo 8 gotas
de una solucin alcohlica de hidroquinona al 0,2 % y se agitan. Observar ambos tubos.

MATERIALES Y REACTIVOS
Bistur Bao Serolgico
Mortero con mano Pipetas de 5 y 10 mL
4 tubos de ensayo Balanza

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30 MANUAL PRCTICAS BIOQUMICA

Beaker 400 mL, 200mL Embudo


Tabla de diseccin

Papel filtro Hidrxido de Calcio


A.T.A 20% Hidroquinona 0,2 %
Solucin de glucosa al 0,5% en cido sulfrico concentrado
bicarbonato de Sodio al 0,5 M
Sulfato de cobre al 20%
Vaselina

ACTIVIDAD COMPLEMENTARIA.

1. Qu funcin cumple la solucin de hidroquinona?


2. Escriba la reaccin entre la hidroquinona y el cido lctico.
3. Qu condiciones hay que tener en cuenta para la produccin de cido lctico
segn reacciones de la gluclisis.
4. En qu tejidos es mayor la produccin de este cido. De que depende la
produccin de dicho cido?
5. Por qu debe el ratn o rata estar en actividad el da anterior?.

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LABORATORIO DE BIOQUMICA

PRACTICA N 11

OBTENCIN DE PREPARADOS ENZIMTICOS Y COMPROBACIN DE SU


ACTIVIDAD EN LA GLUCLISIS.

OBJETIVOS
Obtener preparados de amilasa salival y - d- fructofuranosidasa.
Comprobar la actividad de estas dos enzimas en diferentes muestras.

CONSULTAR TEORA RELACIONADA.

PROCEDIMIENTO
1. obtencin del preparado de amilasa salival y comprobacin de su actividad.
Se enjuaga la boca dos o tres veces con agua para eliminar los restos de comida.
Se mide en una probeta 30 ml de agua destilada y con ella se enjuaga la boca por
espacio de 3 a 5 min . el lquido recogido se filtra a travs de un algodn y el filtrado se
utiliza para los siguientes ensayos.
En dos tubos de ensayo se vierten 3 ml de solucin de almidn al 1%, en uno de ellos se
agrega 3ml de agua y en el otro 3ml del preparado enzimtico y se introducen en un bao
de mara a 40C por 5min. Tomando una gota de cada tubo y combinndola con una gota
de lugol en una cpsula de porcelana. Repita esta operacin a los 10, 15, 20,25 y 30 min.
Al tubo que contiene la enzima se le agregan 0.5ml de fehling A y 0.5ml de fehling B o en
su defecto 1ml de reactivo de benedict. Coloque a calentar hasta que ebulla. Observe.
2. obtencin del preparado de - d- fructofuranosidasa y comprobacin de su
actividad.
Se trituran 50 g de levadura de cerveza con 3 g de carbonato de calcio hasta formar una
pasta homognea que se coloca en un beaker de 200ml. Se aaden 13 ml de cloroformo
y se deja por 4 das a temperatura ambiente, alejado de los roedores, despus de los 4
das se filtra y al filtrado se le agrega un volumen igual de etanol, el precipitado se lava
con mnimas cantidades de alcohol y ter y se seca al vacio, una solucin al 1% de esta
sustancia se utiliza para el experimento.
Prepare una solucin de sacarosa al 1%.

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32 MANUAL PRCTICAS BIOQUMICA

En dos tubos de ensayo se vierten en cada uno 2.5 ml de la solucin de sacarosa al 1% y


2.5 ml de solucin de invertasa, en uno de ellos previamente calentado hasta ebullicin.
Ambos tubos de ensayo se colocan en un bao de mara a 30C por 5 min.
Para determinar el poder reductor se toma 0.5ml de cada tubo de ensayo y se le agregan
0.5ml de fehling A y 0.5ml de fehling B, y se calienta hasta que comience a ebullir.
Observar lo que sucede.
3. Obtencin de un preparado de peroxidasa y comprobacin de su actividad.
Se trituran 2.5 g de papa y se trasladan para una probeta y se le agrega agua hasta
completar 20 ml. Se deja en reposo durante 10 min, y se filtra.
Se toman dos tubos de ensayo, en uno se vierte 1 ml de extracto enzimtico y en el otro 1
ml de agua destilada. A cada uno se le agrega 1 ml de solucin de hidroquinonoa al 0,5%
y 1ml de solucin de perxido de hidrgeno al 3%.

MATERIALES Y REACTIVOS
Beacker de 200 y 500 mL Frasco lavador
Esptula Probeta de 50 mL
Pipetas de 5 y 10 mL Embudo
Mortero Bomba de vacio
Capsula de porcelana (2) Papel filtro

Sacarosa Etanol
Lugol Cloroformo
Hidroquinona al 0,5% Fehling A y B
Perxido de hidrgeno al 3% Levadura (debe traerla cada grupo de
prctica 4 das antes).
PREGUNTAS.

1. Por qu se utiliza lugol en la determinacin de la actividad de amilasa salival.


2. Por que a medida que pasa el tiempo la coloracin de la mezcla de amilasa salival
va cambiando.
3. Qu funcin cumple el carbonato de calcio en la actividad enzimtica de la enzima
invertasa.
4. Con que objeto se utiliza el cloroformo en la levadura para la determinacin de la
actividad de la enzima - d- fructofuranosidasa.
5. Cul es la reaccin que permite la formacin del color en la determinacin de la
actividad de la peroxidasa.

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BIBLIOGRAFA
PLUMER, D.T. Introduccin a la bioqumica prctica. Mxico. MaGraw- Hill
Latinoamericana, S.A.
CONN, E. y Stumpf, P.K. Bioqumica F.
LPEZ, E y ANZOLA, C. Guas de laboratorio de Bioqumica. Facultad de Ciencias.
Universidad Nacional sede Bogot.

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PRACTICA N 12

DETERMINACIN DE GLUCGENO EN HGADO Y CORAZN

OBJETIVOS

Determinar la presencia de glucgeno en diferentes tejidos.


Calcular la cantidad de glucgeno presente en un tejido animal.

TEORA RELACIONADA (CONSULTAR)

PROCEDIMIENTO
Pese 20 g de hgado o corazn y triture suavemente, pselo a un vaso de precipitado y
agrguele KOH al 10% hasta cubrir y caliente en un bao de agua hirviendo durante 20
minutos, agite de vez en cuando durante el calentamiento; enfre en un bao de hielo,
retire los cuerpos slidos y agregue 2 ml de sulfato de sodio saturado y mezcle
fuertemente, aada 4 ml de etanol y deje en bao de hielo por 10 minutos. Observe y
centrifugue por 3 minutos, descarte el sobrenadante, seque y pese.
Una pequea cantidad agregue agua y caliente suavemente hasta disolver, agrguele 1
ml de HCl (1,2M), caliente durante 20 minutos y realice la prueba de Felhing.

MATERIALES Y REACTIVOS
Tubos de centrfuga (2) Pipetas de 5 y 10mL
Balanza Agitador
Beaker de 400 y 200 mL Beaker de 300 y 100Ml
Vidrio de reloj Cuchillo

KOH al 10 % Etanol al 96%

Reactivo de felhing A y B HCl 1,2M

Sulfato de sodio saturado

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ACTIVIDAD COMPLEMENTARIA
1. Cul es el porcentaje de glucgeno en Hgado y corazn terico, comprelo con el
calculado experimentalmente.
2. Cul es la funcin del Hidrxido de Potasio, etanol y cido Clorhdrico en la
determinacin de glucgeno.
3. Cul es el porcentaje de error de la cantidad de glucgeno obtenida.

BIBLIOGRAFA:
PLUMER, D.T. Introduccin a la bioqumica prctica. Mxico. MaGraw- Hill
Latinoamericana, S.A.
CONN, E. y Stumpf, P.K. Bioqumica F.

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PRACTICA N 13
CUANTIFICACIN DE LA RESPIRACIN POR EL MTODO
COLORIMTRICO.

OBJETIVOS
Determinar la cantidad de CO2 producido por las semillas mediante la cantidad de
NaOH consumida.
Observar el fenmeno respiratorio de las semillas

TEORA RELACIONADA
La fase de hidratacin de las semillas viene acompaada por la dispersin de los coloides
celulares e iniciacin de procesos enzimticos a velocidades crecientes, siendo una de las
primeras consecuencias observables el incremento de los fenmenos respiratorios. El
ATP necesario para llevar a cavo la activacin deriva, de manera preferente, del
transporte electrnico respiratorio, provocado por la combustin mitocondrial de sustratos
oxidables. Tales sustratos existen en el endospermo bajo forma exclusiva de
polisacridos de alto peso molecular (almidn) y lpidos complejos (triglicridos).

MATERIALES Y REACTIVOS
2 frascos boca ancha con tapa 2 pipetas de 5 y 10 ml
2 beaker de 50ml Algodn
1 probeta de 50 ml Semillas (50g)

Cloruro de Bario 1M HCl 0,2 N


NaOH 0,2 N Fenolftaleina al 1% en etanol

PROCEDIMIENTO
Cada grupo coloca 25 ml de NaOH 0,2 N, en dos frascos de mayonesa de 250 ml y tapa
inmediatamente, pese 5g de semilla, la cual ha estado sumergida durante una hora o ms
y las coloca en saco de gasa, el cual est unido a la tapa por un cordel, de modo que la
semilla no est en contacto con el NaOH, un frasco debe quedar sin semilla.

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A las 36 horas extraiga las semillas y tape rpido, tome de cada frasco 5 ml y le agrega
2.5 ml de BaCl2 1 M, adicione tres gotas de fenolftaleina y titule con HCL 0,2 N, hasta que
desaparezca el color y anote los volmenes gastados. A los ml de titulacin del blanco
reste los ml gastados en la titulacin de las semillas y multiplique por 5; obtendr as la
cantidad de HCl equivalentes al CO2 desprendido por las semillas

BIBLIOGRAFA:
PLUMER, D.T. Introduccin a la bioqumica prctica. Mxico. MaGraw- Hill
Latinoamericana, S.A.
CONN, E. y Stumpf, P.K. Bioqumica F.

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PRACTICA N 14

EXTRACCIN Y RECONOCIMIENTO DE COLESTEROL DE LA YEMA DE


HUEVO

OBJETIVOS
Extraer colesterol de la yema del huevo, utilizando acetona como disolvente.
Determinar cualitativamente la presencia de colesterol en la yema de huevo
mediante un mtodo calorimtrico.

TEORA RELACIONADA
Los lpidos presentes en la yema son de naturaleza variada, destacando los
triacilglicridos, el colesterol y los fosfolpidos. Mediante una extraccin fraccionada se
pueden separar los menos polares, solubles en acetona (triacilglicridos y colesterol) de
los ms polares (fosfolpidos), que seran solubles en disolventes como la mezcla
cloroformo/metanol.
Los mtodos analticos para la determinacin del colesterol se dividen en colorimtricos y
enzimticos. De los primeros, el ms popular es el de Liebermann-Burchard, en el que la
reaccin tiene lugar en un medio cido fuerte (cido sulfrico). La etapa inicial del proceso
consiste en la protonacin del grupo hidroxilo del colesterol, seguido de su deshidratacin
para formar un in carbonio 3,5-colestadieno. La oxidacin secuencial de este in
carbonio allico por el sulfrico produce un compuesto cromforo, el colestahexano-c.
sulfnico, que absorbe energa en la zona de la luz visible, a 410 nm.

MATERIALES Y MATERIALES
Vaso de precipitado 100 mL Agitador de vidrio
Vaso de precipitado 50 mL Tubos de ensayo (2)
Pipeta de 5 mL

PROCEDIMIENTO
1. Extraccin de colesterol de la yema de huevo.
Cascar un huevo de gallina con precaucin y separar la clara de la yema, teniendo
cuidado de no romper sta. Decantar la clara y tomar 1 g de la yema, en un vaso de 50
ml. Aadir sobre la yema 5 ml de acetona fra y agitar con la varilla de vidrio, hasta

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obtener una suspensin homognea. Verter el contenido en un tubo de centrfuga y


centrifugar a 2000 RPM durante 10 minutos.
Concluida la centrifugacin, retirar el sobrenadante con pipeta. Guardar el sobrenadante,
al que llamaremos extracto acetnico A1, y reextraer el sedimento con otros 5 ml de
acetona, agitando con la varilla y repitiendo la centrifugacin. El nuevo extracto obtenido
se llama extracto acetnico A2.

2. Reconocimiento de colesterol mediante la prueba de Liebermann-Burchard


Agregar a cada tubo una cantidad adecuada del reactivo de Liebermann-Burchard.
Observar los resultados. Que tubo presenta una coloracin mas intensa?

PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS
1. Dnde ha encontrado usted ms colesterol, en la fraccin A1 o en la A2? Por qu?
2. Consultar sobre los mtodos enzimticos para la determinacin de colesterol.
3. Cules son los valores de referencia para el contenido de colesterol en sangre
humana.
4. Qu relacin existe entre el contenido de colesterol y el riesgo de contraer
enfermedad vascular arteriosclertica.
Enfermedad Vascular Arteriosclertica
BIBLIOGRAFA
PLUMER, D.T. Introduccin a la bioqumica prctica. Mxico. MaGraw- Hill
Latinoamericana, S.A.
CONN, E. y Stumpf, P.K. Bioqumica F.
LPEZ, E y ANZOLA, C. Guas de laboratorio de Bioqumica. Facultad de Ciencias.
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