GSK3beta hace de mediador en la respuesta renal a la

vasopresina, al modular la actividad de la Adenylato

Cyclasa

Abstract

Glycogeno sintasa quinasa 3beta, una serina/threonina protena quinasa, es un objetivo

clave en el descubrimiento de frmacos en varias enfermedades, incluyendo diabetes y
alzheimer. Debido a que el litio, un potente inhibidor de GSK3b, causa diabetes inspida
nefrognica, el gen GSK3b podra jugar un rol crucial en la regulacin de la homeostasis del
agua. Nosotros desarrollamos ratones knockout en los que se inhibi el ducto especfico
de colectores renales GSK3b, para determinar si la eliminacin de GSK3b afecta la
reabsorcin de agua renal arginina-vasopresina dependiente. Aunque solo ligeramente
poliricos bajo condiciones normales, los ratones knockout exhibieron un deterioro de la
capacidad de concentracin urinaria en respuesta a la privacin de agua o tratamiento con
un anlogo de vasopresina. Los ratones knockout mostraron reducidos niveles de mRNA,
protena, y localizacin de la membrana del conducto de agua sensible a vasopresina,
aquaporina 2, comparados con ratones normales. Los ratones knockout tambin
expresaron niveles inferiores de pS256-AQP2, una forma fosforilada crucial para el trfico
de la membrana. Los niveles de cAMP, uno de los principales reguladores de la expresin y
el trfico de Aquaporina 2, tambin se vieron disminudos en los ratones knockout. Tanto
la eliminacin del gen GSK3b como la inhibicin farmacolgica del mismo gen, redujeron la
actividad de adenilato ciclasa. En resmen, la desactivacin o eliminacin del gen GSK3b
reduce la expresin de aquaporina 2, al modular la actividad adenilato ciclasa y la
generacin de cAMP, de este modo, deteriorando las respuestas a la vasopresina en el
conducto colector renal.
GSK3 (Glycogen synthase kinase 3) es una familia de quinasas de protena serina
omnipresentes(?) que consisten de 2 isoformas, GSK3alfa (GSK3a) y GSK3beta (GSK3b),
con la segunda teniendo una variante de empalme. Las isoformas de GSK3 son similares
estructuralmente, excepto por un dominio N-terminal rico en glicina adicional en la
isoforma alfa. Tambin, ambas isoformas tienen un 98% de similaridad en su identidad de
secuencia, excluyendo el extremo C-terminal. La actividad de GSK3b ha sido involucrada
en Diabetes, cncer, diferenciacin celular y funcin epitelial normal. Estudios recientes en
los que se utilizaron ratones con eliminacin de GSK3a y ratones con eliminacin de GSK3b
especfica de msculo esqueltico han demostrado una mejora en la tolerancia a la
glucosa, almacenamiento elevado de glicgeno heptico y sensibilidad a la insulina. Bajo la
premisa de estos y muchos otros estudios preclnicos usando inhibidores, GSK3 es,
actualmente, considerado un objetivo clave en el descubrimiento farmacolgico para
diabetes y alzheimer. Sin embargo, estudios recientes en los que se elimin
especficamente una de las dos isoformas del gen, demostraron que el GSK3b es un
regulador crucial de la proliferacin y diferenciacin de cardiomiocitos embrionarios. Del
mismo modo, en los riones, se ha sugerido la inhibicin de GSK3b para causar defectos
en la concentracin urinaria. Esta hiptesis toma forma por la observacin de que el litio,
que es comnmente utilizado en el tratamiento de desorden bipolar, inhibe GSK3b en el
rango clnico teraputico, y puede causar toxicidad renal. Pacientes bajo tratamientos
prolongados de Litio, comnmente desarrollan una reduccin irreversible y clnicamente
importante de la capacidad mxima de concentracin urinaria, lo cual podra conducir a
diabetes inspida nefrognica (NDI), y un deterioro en la capacidad de concentracin renal
ha sido detectado en, aproximadamente, el 50% de los pacientes. debido a que el Li+ es un
inhibidor no competitivo de GSK3, la prdida de actividad de GSK3b podra ser un factor
crucial en el deterioro de la capacidad de concentracin urinaria luego de un tratamiento
de LiCl. Nuestros estudios previos demostraron que en ratones, la inhibicin de GSK3b
podra jugar un papel crucial en la Diabetes inspida nefrognica (NDI) inducida por LiCl.
Del mismo modo, los anlisis protemicos de los conductos colectores renales de ratas
tratadas con LiCl, han sugerido que la desactivacin de GSK3b podra ser importante en el
desarrollo de diabetes inspida nefrognica inducida por Li+. Estos descubrimientos han
indicado que GSK3b podra ser crucial para la concentracin urinal en los riones.

La regulacin del balance de agua en los riones es una de sus principales funciones
homeostticas, y es fuertemente controlada por Aginina Vasopresina (AVP). En respuesta
a un estmulo antidiurtico, la AVP regula ambas, la expresin y el trfico de aquaporina 2
(AQP2), dando como resultado un incremento en la reabsorcin de agua. En los CDs
(Tbulos colectores), la AVP se enlaza a receptores de AVP de tipo 2 (V2R), activando
adenilato ciclasa e incrementando los niveles intracelulares de cAMP. La activacin,
mediada por cAMP, de la protena quinasa A (PKA) o la protena de intercambio (?),
directamente activada por cAMP, incrementa la transcripcin y trfico de Aquaporina 2
hacia la membrana plasmtica apical (AQP2). Una reduccin drstica de la expresin de
aquaporina 2 ha sido asociada con NDI inducida por LiCL, en ratas. A pesar de que el LiCl
ha demostrado inhibir directamente la adenilato ciclasa, sigue siendo discutido si es que la
reduccin de AQP2 es mediada por la inhibicin de la produccin de cAMP Li+ inducida.
Nuestros estudios previos mostraron que la inhibicin de GSK3, mediante LiCl, regula de
 manera positiva la ciclooxigenasa 2 (COX2) intersticial medular renal y la prostaglandina E2
(PGE2), la cual es conocida por ser antagonista de la reabsorcin de agua mediada por AVP
en los tbulos colectores renales. A pesar de que el Li+ es un gran inhibidor de GSK3b, el
defecto en la concentracin urinaria inducida por Li+ se asocia con diversos mecanismos,
dificultando el descifrar del rol que cumple GSK3b en la reabsorcin de agua mediada por
AVP dentro de los tbulos colectores. De este modo, en este estudio desarrollamos
ratones a los que se les suprimi el GSK3b en los tbulos colectores renales, para examinar
el rol de GSK3b en la respuesta de los tbulos colectores renales ante la accin
antidiurtica del AVP. La capacidad mxima de concentracin urinaria, en respuesta a la
privacin de agua o al tratamiento con vasopresina, se vio significantemente
comprometida en los ratones knockout, comparados con los ratones comunes.
consecuente con esto, la expresin de Aquaporina 2 y la localizacin de la membrana
apical se vieron reducidas en los ratones knockout, comparados con los ratones normales,
posiblemente a causa de la menor actividad de adenilato ciclasa y menores niveles de
cAMP intracelular en presencia de 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX). Esta es la primera
demostracin de que GSK3b podra regular la actividad de adenilato ciclasa, la cual podra,
posiblemente, ser la razn de la baja abundancia de Aquaporina 2 y la reducida capacidad
de concentracin urinaria en los ratones knockout.

Resultados

Generando los ratones knockout con inhibicin especfica de GSK3b en los tbulos
colectores renales:

Para determinar el rol de GSK3b en la reabsorcin de agua renal, generamos ratones

knockout. La eliminacin de GSK3b en los tbulos colectores se confirm mediante tincin
inmunohistoqumica de las secciones del rin por GSK3b (Figura 1A). Los anlisis
Western Blot de los tbulos colectores de la mdula interna, agudamente aislados,
obtenidos de la mdula interior renal y papilas () (papillae) (Figura 1B), mostraron una
reduccin en la expresin de GSK3b en los ratones knockout, en comparacin a los ratones
normales, considerando que los niveles de GSK3a se mantuvieron constantes. (Figura 1B).
Confirmamos la recombinacin Cre-locP por medio de PCR de adn genmico, obtenido de
los tbulos colectores renales agudamente aislados (Figura 1C). Los ratones utilizados para
el estudio eran homocigticos para GSK3b flojo (no s si est bien eso, la palabra es
floxed) y portaban el gen HoxB7 Cre (Knockout). Los ratones se emprejaban por sexo con
su contraparte normal, las cuales no tenan Cre.

En general, los ratones knockout adultos eran saludables, frtiles y similares a sus parejas
normales en peso y tamao. No detectamos diferencias significativas en el peso y la
morfologa de los riones, como se detect con tincin con hematoxilina y eosina. Bajo
condiciones normales, los ratones knockout un modesto incremente del 56% en la
produccin de orina en un lapso de 24 horas, comparado con los ratones normales.
(Ratones knockout: 0,080 +- 0,02 ml/g body wt por da. Ratones normales: 0,051 +-
0,015 ml/g body wt por da, P<0,01, n=6 en cada grupo). Consecuente con esta leve
poliuria, el consumo de agua e los ratones knockout fue levemente mayor, comparado con
los ratones normales (Ratones Knockout: 0,25 +- 0,1 ml/g body wt por da. Ratones
normales: 0,2 +- 0,07 ml/g body wt por da, P<0,05, n=6 en cada grupo). La osmolalidad
urinaria fue numricamente menor, pero no estadsticamente significante en los ratones
knockout, comparada con los ratones normales (ratones Knockout: 1662 +-285 mOsm/kg
H2O. Ratones normales: 2354 +- 324 mOSM/kg H2O, n=6 en cada grupo). Los niveles de
sodio en la orina fueron comparables (Ratones Knockout: ,178 +- 0,05 mmol/(orina en 24
horas). Ratones normales: 0,16 +- 0,03 mmol/(orina en 24 horas), n=6 en cada grupo).

Los ratones knockout tienen una capacidad reducida para concentrar orina, luego de una
privacin de agua:

Para determinar si la eliminacin especfica de GSK3b, en los tbulos colectores, afect o

no la capacidad mxima de concentracin urinaria, reunimos muestras de orina puntuales
al principio y pasadas 18 horas de privacin de agua (Con libre acceso a alimento, pero no
a agua). Cuando se les priv de agua, ambos tipos de ratones (Knockout y normales),
comenzaron una respuesta antidiurtica. Sin embargo, la osmolalidad urinaria de los
ratones knockout, luego de 18 horas, fue un 32% ms baja que la de los ratones normales.

Los ratones Knockout han reducido su AQP2 mRNA y sus niveles de protenas, en
respuesta a la privacin de agua:

Para examinar si es que la reducida capacidad para concentrar orina de los ratones
knockout fue o no a causa de la reducida expresin de AQP2, hicimos mediciones de AQP2
mRNA renal y de los niveles de protenas en los ratones knockout y normales. Bajo
condiciones normales, los ratones knockout parecan tener niveles mayores de AQP2
mRNA, comparados con los ratones normales, segn lo mostrado por RT-PCR cuantitativo,
sin embargo, esta diferencia no alcanz suficiente significancia estadstica (Figura 3A). De
forma similar, el inmunoblotting cuantitativo mostr niveles de AQP2 un 20% superior,
tanto en la papila renal como en la medula interna, de los ratones knockout, comparados
con los ratones normales al comienzo (tiempo 0). Sin embargo, la privacin de agua
increment 6,6 veces la AQP2 mRNA, para los ratones normales; a su vez, en los ratones
knockout, la AQP2 mRNA aument menos de 2 veces (Figura 3A). Siguiendo estos
resultados, despus de la privacin del agua, la abundancia total de los niveles de protena
AQP2, fue significativamente inferior en los ratones knockout que en los normales (Figura
3B). La cuantificacin de las bandas de AQP2 indic que los niveles de protenas
glicosiladas y no glicosiladas fueron inferiores en 55% y 58% en los ratones knockout,
comparados con los normales, indicando que un incremento despuntado de la expresin
de AQP2 podra ser una de las causas principales de los bajos niveles de osmolalidad en la
orina de los ratones knockout privados de agua.

Tambin, a travs de inmunohistoquimica, determinamos la distribucin de AQP2 y AQP2

fosforilado en las secciones de los riones de los ratones privados de agua. En los ratones
normales, se observ una intensa tincin en los tbulos colectores medulares y corticales
para AQP2, principalmente en la membrana apical de las clulas principales (Figura 4, A y
B). En los ratones knockout, la tincin de AQP2 se vio significantemente reducida en la
membrara y en la corteza, adems de parecer ms difusa y citoplasmtica (Figura 4, C y D).
A pesar de que la AQP2 pareciera localizarse apicalmente en algunos tbulos colectores de
la corteza de los ratones knockout (como se ve en la figura 4D), esta fue significativamente
menor que en los ratones normales. Debido a que se ha visto que la fosforilacin de la cola
terminal COOH en la serina 256 de AQP2 (pS269-AQP2) es crtica para la acumulacin de
AQP2 en la membrana plasmtica apical, nosotros immunostained las secciones del
rin de los ratones privados de agua para pS269-AQP2. En los ratones normales, la
tincin de pS269-AQP2 se localiz, principalmente, en la membrana apical de los tbulos
colectores de la mdula y de la corteza (Figura 4, E y F). En los ratones knockout, se
detectaron bajos niveles de pS269-AQP2, en su mayora citoplasmtico, en la mdula
(Figura 4G). En la corteza, la tincin y la localizacin apical de pS269-AQP2 fueron
significativamente menor que en los ratones normales (Figura 4H). Los resultados
indicaron que los ratones knockout tienen reducida la expresin y localizacin apical de
AQP2, en respuesta a la privacin de agua, indicando que la eliminacin del gen GSK3b
podra afectar tanto a la expresin mediada por AVP como a la orientacin apical de AQP2.
En contraste, PCRs cuantitativos en tiempo real, realizados para receptores tipo 2 de AVP
(o receptores de AVP de tipo 2, no estoy seguro), no mostraron diferencia alguna entre los
ratones normales y los knockout sujetos a privacin de agua (No se muestran estos datos
en el paper).

Los ratones knockout exhibieron una respuesta despuntada a dDAVP:

Para examinar si es que el defecto de la concentracin urinaria en los ratones knockout

puede ser atribuido o no a la disminucin de la sensibilidad funcional a los efectos hidro-
osmticos del AVP, les administramos una sola dosis intraperitoneal de dDAVP (un
anlogo sinttico de AVP), tanto a los ratones normales como a los knockout. En los
ratones normales, el tratamiento con dDAVP increment la osmolalidad urinaria en un
63%, mientras que en los ratones knockout solo se observ un aumento de 19% (Figura
5A). La diferencia del incremento de la osmolalidad urinaria fue significativamente mayor
en los ratones normales, comparados con los knockout (Figura 5B). El inmunoblotting
cuantitativo para los niveles de pS269-AQP2 en el homogenate obtenido de la mdula
interior y la papila renal de los ratones tratados con dDAVP durante una hora, revel que
en los ratones Knockout, los niveles de pS269-AQP2 fuerona significativamente inferiores
que en los ratones normales (Figura 5C).

Los niveles de cAMP renal, en respuesta al dDAVP o Forskolin, son menores en los
ratones knockout.

Es bien sabido que un incremento agudo en los niveles de AVP puede inducir la expresin
de AQP2 por medio de un camino cAMP-dependiente. Para examinar si es que la
actividad de GSK3b es importante o no para la generacin de cAMP AVP-mediada,
analizamos los niveles de cAMP en la orina, tanto de ratones knockout como normales,
con restriccin de agua, para determinar si la expresin reducida de AQP2 es debida a los
bajos niveles de cAMP (en los ratones knocout). En los ratones knockout, los niveles de
cAMP en la orina fueron un 30% inferiores, comparados con los ratones normales
(Ratones normales: 807 +-150 pmol/(24 horas). Ratones knockout: 569 +- 139 pmol/(24
horas), P<0,05, n=8 en cada grupo) (Figura 6A).