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Artculo original

Rev Hematol Mex. 2016 jul;17(3):169-174.

Utilidad de la determinacin de
anticuerpos antiplaquetarios en el
diagnstico de trombocitopenia
inmunitaria primaria
Hernndez-Blas AI1,2, Rodrguez-Morales U2, Vallejo-Villalobos MF1,2, Zepeda-
Camacho L2, Cano-Jimnez O1, Ruiz-Argelles GJ1-4

Resumen
ANTECEDENTES: la trombocitopenia inmunitaria primaria se carac-
teriza por trombocitopenia aislada con cuentas plaquetarias menores
de 100x109/L en ausencia de otras causas o enfermedades que puedan
estar asociadas con la trombocitopenia. Los anticuerpos antiplaqueta-
rios constituyen el principal mecanismo en la eliminacin acelerada
de las plaquetas, debido a que estn dirigidos contra protenas diversas
que se encuentran en la superficie de las plaquetas. La demostracin
de anticuerpos antiplaquetarios es un auxiliar en el diagnstico de
trombocitopenia inmunitaria primaria y puede ser de utilidad en la
evaluacin de la respuesta al tratamiento con medicamentos inmu-
nosupresores.
OBJETIVO: evaluar la utilidad de la determinacin de anticuerpos
antiplaquetarios en el diagnstico de trombocitopenia inmunitaria
primaria.
MATERIAL Y MTODO: estudio observacional, transversal, retros-
pectivo de 10 aos, realizado en una sola institucin, en el que se
analizaron los resultados de investigar los anticuerpos antiplaquetarios
mediante el mtodo de citometra de flujo, al utilizar anticuerpos
monoclonales contra las glucoprotenas IIb y IIIa de las plaquetas
y globulina antihumana polivalente, marcada con isotiocianato de
fluorescena, en un grupo de pacientes con trombocitopenia. 1
Laboratorios Clnicos de Puebla, Puebla, Mxico.
RESULTADOS: en el periodo seleccionado se realizaron 2,549 es- 2
Universidad Popular Autnoma del Estado de Pue-
tudios para investigar los anticuerpos antiplaquetarios; de ellos, slo bla, Puebla, Mxico.
75 pruebas fueron positivas (dos en pacientes con trombocitopenia 3
Centro de Hematologa y Medicina Interna de
inmunitaria primaria y 73 en pacientes con trombocitopenia por otras Puebla, Puebla, Mxico.
causas). En los 2,474 casos en los que las pruebas fueron negativas,
4
Universidad de las Amricas Puebla, Puebla, Mxico.
hubo 62 casos de trombocitopenia inmunitaria primaria. En un grupo Recibido: noviembre 2015
de 64 pacientes con esta enfermedad, slo en 2 (3%) se reportaron an- Aceptado: febrero 2016
ticuerpos antiplaquetarios. Mediante la prueba exacta de Fisher no se
encontr asociacin estadsticamente significativa entre la existencia Correspondencia
de anticuerpos antiplaquetarios y el diagnstico de trombocitopenia Dr. Guillermo J Ruiz Argelles
inmunitaria primaria (p=0.712682). gruiz1@clinicaruiz.com
CONCLUSIONES: los hallazgos indicaron poca utilidad de la prueba
de investigacin de anticuerpos antiplaquetarios en el diagnstico de Este artculo debe citarse como
trombocitopenia inmunitaria primaria, por lo que parece ser intil Hernndez-Blas AI, Rodrguez-Morales U, Vallejo-
seguir realizndola. Villalobos MF, Zepeda-Camacho L y col. Utilidad de
la determinacin de anticuerpos antiplaquetarios en
PALABRAS CLAVE: trombocitopenia inmunitaria primaria, anticuerpos el diagnstico de trombocitopenia inmunitaria pri-
antiplaquetarios. maria. Rev Hematol Mex. 2016 julio;17(3):169-174.

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Revista de Hematologa 2016 julio;17(3)

Rev Hematol Mex. 2016 July;17(3):169-174.

Usefulness of antiplatelet antibodies


determination in the diagnosis of
primary immune thrombocytopenia.
Hernndez-Blas AI1,2, Rodrguez-Morales U2, Vallejo-Villalobos MF1,2, Zepeda-
Camacho L2, Cano-Jimnez O1, Ruiz-Argelles GJ1-4

Abstract
BACKGROUND: Primary immune thrombocytopenia is charac-
terized by isolated thrombocytopenia with platelet counts below
100x109/L and the absence of other causes or diseases that may
be associated with thrombocytopenia. Antiplatelet antibodies are
the main mechanism for the accelerated destruction of platelets, as
they are directed against different proteins that are present on the
surface of platelets. The demonstration of antiplatelet antibodies
is an aid for the diagnosis of primary immune thrombocytopenia
and may be useful in assessing the response to treatment with im-
munosuppressive drugs.
OBJECTIVE: To evaluate the usefulness of the determination of anti-
platelet antibodies in the diagnosis of primary immune thrombocy-
topenia.
MATERIAL AND METHOD: An observational, cross-sectional and
retrospective study of 10-year period and in a single institution; the
results of the determination of antiplatelet antibodies were analyzed
in a group of patients with thrombocytopenia by the method of flow
cytometry using monoclonal antibodies against the IIb and IIIa glyco-
proteins of platelets and anti-human polyvalent globulin labeled with
fluorescein isothiocyanate.
RESULTS: 2,549 determinations were performed for the study of anti-
platelet antibodies; of these, only 75 tests were positive (2 in patients
with primary immune thrombocytopenia and 73 in patients with other
causes of thrombocytopenia). 2,474 determinations were negative in
which 62 cases of primary immune thrombocytopenia where shown.
In a group of 64 patients with primary immune thrombocytopenia, 1
Laboratorios Clnicos de Puebla, Puebla,
only 2 patients showed positive antiplatelet antibodies (3%). Using the
Mxico.
Fishers exact test, we did not found a significant association between 2
Universidad Popular Autnoma del Estado
the presence of antiplatelet antibodies and diagnosis of primary im- de Puebla, Puebla, Mxico.
mune thrombocytopenia (p=0.712682). 3
Centro de Hematologa y Medicina Interna
de Puebla, Puebla, Mxico.
CONCLUSIONS: Findings indicate a poor association of antiplatelet 4
Universidad de las Amricas Puebla,
antibodies and primary immune thrombocytopenia; the test conducted Puebla, Mxico.
by the described method seems to be useless in the diagnosis of primary
immune thrombocytopenia. Correspondence
KEYWORDS: primary immune thrombocytopenia; antiplatelet anti- Dr. Guillermo J Ruiz Argelles
bodies gruiz1@clinicaruiz.com

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Hernndez-Blas AI y col. Trombocitopenia inmunitaria primaria

ANTECEDENTES Metodologa de la determinacin de


anticuerpos antiplaquetarios
La trombocitopenia inmunitaria primaria es un
trastorno autoinmunitario adquirido, que se ca- Los pacientes con trombocitopenia inmunitaria
racteriza por trombocitopenia aislada, definida primaria, sea primaria o secundaria a enferme-
como cuenta plaquetaria en la sangre perifrica dades autoinmunitarias multiorgnicas, cursan
menor a 100x109/L, sin tener causa aparente.1 con destruccin perifrica de las plaquetas como
Se estima que la incidencia anual de la trombo- resultado de su sensibilizacin con anticuerpos.
citopenia inmunitaria primaria en adultos es de En un porcentaje de estos pacientes es posible
2 a 4 casos por cada 100,000 personas.2 demostrar la existencia de inmunoglobulinas
(principalmente del isotipo IgG) unidas a la
Datos epidemiolgicos recientes sugieren que la membrana plaquetaria; y en otros, adems, es
incidencia en adultos es prcticamente igual en posible demostrar la existencia de anticuerpos
uno y otro sexo, excepto entre los 30 y 60 aos libres en el suero, que son capaces de unirse a
de edad, cuando es ms prevalente en mujeres.3 las plaquetas provenientes de donadores sanos.
En Mxico existen pocos datos epidemiolgicos La demostracin de unos y otros es un auxiliar
acerca de esta enfermedad, lo que afecta a la en el diagnstico de prpura de origen inmuno-
prctica del hematlogo en los diversos mbitos lgico y puede ser de utilidad en la evaluacin
de la especialidad. de la respuesta al tratamiento con medicamentos
inmunosupresores.
Con frecuencia, las recomendaciones de las
guas extranjeras no pueden aplicarse en Mxi- Los aparatos usados en este estudio fueron Ga-
co debido a que se carece de recursos y por las llios de Beckman-Coulter y un instrumento de
diferencias culturales, tanto de mdicos como lisis y fijacin Coulter TQ-Prep.
de pacientes, costumbres arraigadas, diferencias
en el acceso a la informacin y en las condi- Muestreo y muestra
ciones de alimentacin y vivienda, entre otros.
En ocasiones pueden hacerse modificaciones a Sangre anticoagulada (heparina) del paciente y
los esquemas recomendados, que reducen los de un sujeto sano y suero del paciente. Las mues-
gastos, pero sin perder la eficacia teraputica.4 tras deben analizarse en las 72 horas siguientes
a su obtencin. Una vez teidas y fijadas, las
MATERIAL Y MTODO muestras pueden analizarse en las siguientes 24
horas. Las muestras no podrn ser procesadas en
Estudio observacional, transversal, retrospec- caso de que su fecha de obtencin supere las 72
tivo, 5-7 realizado en 10 aos y en una sola horas y las clulas viables son escasas y si tienen
institucin, en el que se analizaron los resultados signos importantes de deterioro, como hemlisis,
de investigar los anticuerpos antiplaquetarios existencia de cogulos o viscosidad.
mediante el mtodo de citometra de flujo,
empleando anticuerpos monoclonales contra Sistema analtico
glucoprotenas IIb y IIIa de las plaquetas y glo-
bulina antihumana polivalente, marcada con Anticuerpos contra las glucoprotenas IIb y IIIa de
isotiocianato de fluorescena, en un grupo de las plaquetas y globulina antihumana polivalente
pacientes con trombocitopenia. marcada con isotiocianato de fluorescena.

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Revista de Hematologa 2016 julio;17(3)

Uso del sistema analtico ventana electrnica de manera ptima, analizar


el tubo b, que deber contener menos de 2% de
Disponer de cuatro tubos de polipropileno, de eventos positivos, y se utilizar como control iso-
12x75 mm, marcados como: a) control positivo, tpico para colocar la posicin del cursor lineal.
b) control negativo, c) plaquetas autlogas y d) En los tubos c y d se cuantificar el porcentaje de
plaquetas alognicas. Despus, colocar 50 L plaquetas positivas que reflejan la existencia de
de sangre control1 en los tubos a, b y d; colo- anticuerpos autlogos y heterlogos, respectiva-
car 50 L de sangre del paciente en el tubo c; mente. Se considera que el resultado es positivo
agregar 20 L de suero del paciente a los tubos cuando exista ms de 25% de eventos positivos
c y d; agregar el anticuerpo monoclonal CD41 (por arriba del tubo b).
acoplado a ficoeritrina a todos los tubos; aadir
el anticuerpo monoclonal CD61 acoplado a Mediante la revisin del expediente clnico se
isotiocianato de fluorescena al tubo a; agregar 5 obtuvieron 64 pacientes con trombocitopenia in-
L de globulina antihumana polivalente marcada munitaria primaria, de los que 17 eran hombres,
con isotiocianato de fluorescena a los tubos estudiados y tratados por uno de nosotros (GJRA).
b, c y d. Incubar como mnimo 30 minutos a
temperatura ambiente; lisar y fijar de manera El criterio de inclusin fue: pacientes con deter-
automtica mediante el reactivo TQ-prep; pasar minacin de anticuerpos antiplaquetarios con
las muestras en el citmetro de flujo, programado diagnstico establecido de trombocitopenia inmu-
para la deteccin de dispersin frontal y disper- nitaria primaria; los criterios de exclusin fueron:
sin lateral, log de fluorescencia a 525 nm y log pacientes con determinacin de anticuerpos anti-
de fluorescencia a 575 nm. plaquetarios sin trombocitopenia, pacientes con
determinacin de anticuerpos antiplaquetarios con
Procesamiento de datos diagnstico de trombocitopenia no inmunitaria y
pacientes con determinacin de anticuerpos anti-
Mediante la construccin de un histograma bipa- plaquetarios con diagnstico de trombocitopenia
ramtrico de log FL2 y dispersin lateral hay que inmunitaria primaria junto con otra enfermedad.
definir una ventana electrnica que circunscriba
el anlisis de fluorescencia a las plaquetas. Anlisis estadstico

Mediante la construccin de un histograma uni- En el anlisis estadstico se utiliz el programa


paramtrico de log fluorescencia 525 nm, debe Minitab 17, usando los siguientes datos: deter-
cuantificarse el porcentaje de clulas que tienen minacin de anticuerpos antiplaquetarios: 2,549
en su membrana isotiocianato de fluorescena. en total; de stos, 75 fueron positivos (slo dos
En el tubo a, ms de 90% de las clulas deben ser con trombocitopenia inmunitaria primaria y 62
positivas, pues estn teidas con el anticuerpo con otro diagnstico).
monoclonal CD61, que se expresa en todas las
plaquetas. Si el porcentaje de clulas positivas es En los 2,474 casos en que las pruebas fueron
menor a 90%, debe corregirse la posicin de la negativas, hubo 62 casos de trombocitopenia
inmunitaria primaria y el resto (2,412) sin esta
1
Sangre control: muestra con parmetros hematol- afeccin (Cuadro 1).
gicos normales.
Nota: la concentracin de globulina antihumana
polivalente marcada con isotiocianato de fluoresce- Las dos variables que se consideraron son ca-
na vara, segn el fabricante. tegricas para probar la hiptesis de si existe

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Hernndez-Blas AI y col. Trombocitopenia inmunitaria primaria

Cuadro 1. Pruebas de casos con y sin trombocitopenia Cuadro 3. Prueba exacta de Fisher
inmunitaria primaria
Anticuerpos Anticuerpos Total
Anticuerpos antiplaquetarios antiplaquetarios
antiplaquetarios positivos negativos
Positivos Negativos 1 2 62 64
Con trombocitopenia S 2 62 64 2 73 2,412 2,485
inmunitaria primaria No 73 2,412 2,485 Total 75 2,474 2,549
Total 75 2,474 2,549
Valor de p=0.712682.

asociacin entre los anticuerpos antiplaquetarios antiplaquetarios y la trombocitopenia inmuni-


y la trombocitopenia inmunitaria primaria; se taria primaria.
us en primera instancia la prueba de c2 para
independencia de variables. Se escogi un nivel RESULTADOS
de significacin (a=0.05) [Cuadro 2]. En este
caso, como una de las frecuencias esperadas Se obtuvieron 2,549 determinaciones para in-
en la prueba de c2 era menor de cinco se us la vestigar anticuerpos antiplaquetarios en 1,650
prueba exacta de Fisher (Cuadro 3). mujeres y 899 hombres. De ellos, slo 75
pruebas fueron positivas (dos en pacientes con
Se contrastan dos hiptesis: la nula (Ho: no hay trombocitopenia inmunitaria primaria y 73 en
asociacin entre los anticuerpos antiplaqueta- pacientes con trombocitopenia por otras causas).
rios y la trombocitopenia inmunitaria primaria) En un grupo de 64 pacientes con tromboci-
contra la alternativa (H1: s hay asociacin entre topenia inmunitaria primaria, los anticuerpos
los anticuerpos antiplaquetarios y la tromboci- antiplaquetarios se reportaron slo en 2 (3%).
topenia inmunitaria primaria).
DISCUSIN
Como el valor de p obtenido en la prueba exacta
de Fisher (0.712682) es mayor que el valor de La aplicacin de la citometra de flujo en el
a, entonces se acepta la hiptesis nula, que estudio de las plaquetas ofrece grandes venta-
plantea la no asociacin entre los anticuerpos jas sobre otros mtodos de anlisis, porque es
el nico hasta el momento que puede medir la
Cuadro 2. Prueba de c2 para asociacin entre anticuerpos extensin de la activacin de plaquetas indivi-
antiplaquetarios y trombocitopenia inmunitaria duales y detectar subpoblaciones de plaquetas.8
Las plaquetas pueden analizarse en su medio
Anticuerpos Anticuerpos Total fisiolgico, incluyendo eritrocitos y leucocitos,
antiplaquetarios antiplaquetarios
positivos negativos
mismos que afectan la activacin plaquetaria.9,10
La manipulacin mnima de las muestras evita
1 2 62 64
interferencias por activacin in vitro y reduce
1.84 62.16
las posibles prdidas de subpoblaciones de
2 73 2,474 2,547
plaquetas.11,12
73.16 2,473.84
Total 75 2,536 2,611 Adems, es posible determinar el estado de
Valor de p= 0.903. Nota: celdas con valores esperados
activacin de las plaquetas circulantes y las
menores de 5. modificaciones especficas que ocurren en la

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Revista de Hematologa 2016 julio;17(3)

superficie celular como consecuencia de este 2. Keating GM.: Romiplostim: a review of its use in immune
thrombocytopenia. Drugs 2012;72:415-435.
proceso y puede detectarse incluso 1% del
3. Pizzuto J, Ambriz R. Therapeutic experience in 934 adults
total de plaquetas en la muestra de sangre;13 with idiopathic thrombocytopenic purpura: multicentric
se necesitan pequeas alcuotas de sangre trial of the Cooperative Latin American Group on hemos-
(aproximadamente 2 L) para evaluarlas.11 No tasis and thrombosis. Blood1984;64:1179-1183.
obstante, la citometra de flujo tiene limitaciones: 4. Gmez-Almaguer D, Tarn-Arzaga L, Moreno-Jaime B,
Jaime-Prez JC, et al. High response rate to low-dose ritu-
se necesita un operador especializado, porque ximab plus high-dose dexamethasone as frontline therapy
la preparacin de las muestras es complicada, in adult patients with primary immune thrombocytopenia.
aunque los nuevos sistemas automatizados y el Eur J Haematol 2013;90:494-500.
uso de programas de computacin ms sencillos 5. Arigmn-Palls JM, Jimnez-Villa J. Mtodos de investiga-
cin clnica y epidemiolgica. 3 ed. Madrid: Elsevier, 2004.
simplifican el ensayo. Pero estos equipos son
6. Leon Gordis. Epidemiologa. 3 ed. Madrid: Elsevier, 2005.
costosos, por lo que no estn disponibles en la
7. Szklo M, Nieto FJ. Epidemiologa intermedia. Conceptos y
mayor parte de los centros hospitalarios;14 ade- aplicaciones. Madrid: Daz de Santos, 2003.
ms, las muestras de sangre deben procesarse en 8. Michelson AD. Flow cytometry: a clinical test of platelet
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cin para evitar una posible activacin ex vivo.11 9. Santos MT, Valles J, Marcus AJ, Safier LB, et al. Enhan-
cement of platelet reactivity and modulation of eicosa-
noid production by intact erythocytes. A new approach
CONCLUSIONES to platelet activation and recruitment. J Clin Invest
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Los hallazgos de este estudio indicaron poca 10. La-Rosa CA, Rohner MJ, Rodino LJ, Benoit SE. Human
neuthrophil cathepsin G is a potent platelet activator. J
utilidad de la prueba de investigacin de anti- Vasc Surg 1994;19:306-318.
cuerpos antiplaquetarios, mediante el mtodo 11. Shattil SJ, Cunninham M, Hoxie JA. Detection of activated
descrito, en el diagnstico de trombocitopenia platelets in whole blood using activation-dependent
inmunitaria primaria; por ello, parece intil monoclonal antibodies and flow cytometry. Blood
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