TRABAJO PRACTICO N1

Gentica Molecular y Biologa del Desarrollo

Mazzei, Mauro
TU MAIL!
Petrigliano, Micaela
Petrigliano.micaela@hotmail.com
OBJETIVOS
El objetivo en este trabajo fue subclonar el gen que codifica para la protena verde fluorescente
(GFP) en el vector de expresin pGEX, diseado para obtener una protena de fusin a GST, dando
como resultado GST-GFP. Y luego utilizar ese vector para transformar clulas E. coli DH5
competentes.
MATERIALES Y MTODOS
1) Digestin:

Se recibi un plsmido recombinante que portaba el gen gfp ntegro en su sitio de clonado mltiple
(MCS) y el plsmido de expresin procariota pGEX. Luego se procedi a la digestin (Tabla 1) con
las enzimas de restriccin EcoRI y BamHI. Las mismas fueron seleccionadas con los siguientes
criterios: 1) obtener el fragmento de DNA que contenga el gen de inters integro, 2) presencia de
los mismos sitios de corte en ambos plsmidos, y 3) que el marco de lectura se mantenga en el
vector de destino. Se seleccion el vector pGEX-2T porque al ser vector de clonado, puede
aumentar el nmero de copias a partir del ori y nos permite seleccionarlo por la resistencia a
ampicilina.

Digestin de Digestin de pGEX

pBluescript-GFP

Agua MQ 4 ul 4 ul
Buffer 3 (10X) 2 ul 2 ul
BSA (10X) 2 ul 2 ul
pBluescript-GFP (100 ug/ul) 10 ul -

pGEX (50 mg/ul) - 10 ul

EcoRI (10U/ul) 1 ul 1 ul
BamHI (10U/ul) 1 ul 1 ul
Tabla 1. Componentes y cantidades para la digestin de los plsmidos.

La mezcla se incub a 37C por 2 horas. Se corri una alcuota de los productos de digestin en el
gel de agarosa para verificar que la misma haya sido desarrollada correctamente. Luego de este
tiempo se guardaron los tubos a 20C hasta la segunda parte del trabajo prctico.
2) Tratamiento con CIP:

Se procedi a realizar la desfosforilacin del DNA para evitar la auto-ligacin del vector pGEX. La
religacin del vector puede ocurrir intermolecularmente entre extremos protruyentes compatibles o
extremos romos; para evitar esto se emplea la enzima CIP (Calf Intestinal Alkaline Phosphatase)
que cataliza la remocin de los grupos fosfatos 5 del DNA. Se agreg al tubo donde se realiz la
reaccin de digestin del plsmido pGEX, 1U de CIP por pmol de terminales de DNA. Se incub a
37C durante una hora, y se congel hasta el siguiente prctico.
Se realiz el siguiente clculo para determinar las unidades de CIP que debe haber en solucin
independientemente del volumen:
 = . 2 = 0,6
0,6 . 1
= 1
= 0,6

3) Electroforesis preparativa y purificacin del ADN:

La purificacin del vector y de la banda de agarosa correspondiente al inserto se bas en la

propiedad que tiene el DNA de adherirse a la slica en presencia de alta concentracin de
sales caotrpicas y tiene como fin la eliminacin de la agarosa proveniente del gel. Se
utiliz la resina comercial Qiaex II.
El volumen de buffer QX1 agregado correspondi a 150 ul para el vector y 300 ul para el
inserto (solucin de NaI que rompe los puentes hidrgenos del polmero de agarosa). Luego
se agreg la resina y se incub 5 minutos a 50C para solubilizar el gel de agarosa. Se
centrifug obteniendo en el pellet el DNA ms la slica. Se realizaron dos lavados para
eliminar restos de agarosa, protenas unidas al DNA y sales (un lavado con QX1 y otro con
buffer PE). Luego se procedi a la elusin por generacin de condiciones opuestas a las
anteriores. Se agreg H2O, se centrfugo y el DNA se obtuvo en el sobrenadante. Se tomo
2l del vector y 2l del inserto y se los coloco en distintos eppendorfs con 2l de loading
buffer (10x) con 16l de H O.
2

4) Cuantificacin del ADN por gel de agarosa:

Posteriormente se cuantific el rendimiento en un gel de agarosa con Bromuro de etidio, y

comparando contra un marcador de ADN de fago lambda digerido con la enzima HindIII, se
determin qu banda del marcador tena una intensidad similar a la banda que contena el DNA de
nuestro inters.

5) Ligacin de fragmentos de ADN

Despus se lig el gen gfp purificado con el vector pGEX. La cantidad de inserto para ligar se
estim en X considerando que se utiliz una relacin molar I:V 3:1 y que la masa de vector
utilizado fue 25ng (ecuacin 1):

= : = ( )

Para la ligacin se realiz un control con el vector solo y la ligasa, (control de digestin y de
desfosfataseo). ste es importante para constatar si las reacciones funcionaron correctamente. A
continuacin se detallan los componentes necesarios para realizar la ligacin con sus respectivos
controles (Tabla 2):

Control 1
Componentes Concentracin Ligacin (Digestin + MIX (2X)
Final (3I:1V) Desfosfataseo)

Agua 4,5ul 4,5 ul 9 ul total

Buffer (10X) 1X 1 ul 1 ul 2 ul total

Vector (25 ng/ul) 50ng(5ng/l) 1,5 ul 1,5 ul 3 ul total

20ng(2ng/l)
Inserto (15 ng/ul) 2 ul - -

Ligasa (40 ng/ul) 40U(4U/l) 1 ul 1 ul 2 ul total

Tabla 2. Componentes para la reaccin de ligacin y los controles

Luego de incubar overnight a 16C se guard a -20C hasta el momento de la transformacin

bacteriana.

Transformacin bacteriana

Se recibieron 200l de bacterias competentes por el mtodo de CaCl2 congeladas, las cuales fueron
descongeladas al inicio de la experiencia. Se agregaron 10l de la reaccin de ligacin en un
Eppendorf con 30l de bacterias, y 8l del control de desfosfataseo y digestin con 30l del cultivo
de bacterias en otro Eppendorf. Se incubaron en hielo por 30 minutos para favorecer la unin del
DNA a la membrana celular. Para inducir el shock trmico, se incubaron durante 30-45 segundos a
42C y luego se dejaron reposar nuevamente en hielo por 2 minutos. Se agregaron las reacciones de
transformacin a 1ml de LB en tubos distintos y se incubaron durante 1 hora a 37C en agitacin
constante con el fin de estabilizar la membrana y darle tiempo a que se expresen las protenas
relacionadas con la resistencia adquirida (recuperacin bacteriana).
Previamente se prepararon placas de petri con medio LB y ampicilina 100g/ml, en las cuales se
plaque el total del cultivo bacteriano transformado utilizando bolitas de vidrio, y se incubaron
overnight a 37C
RESULTADOS
Se realiz una electroforesis en gel de agarosa de un producto de digestin del vector pBS-GFP con
las enzimas EcoRI y BamHI para corroborar que el inserto se haya clonado correctamente, y para
separar el fragmento de inters (gen GFP) del vector de clonado para su posterior purificacin.

Imagen 1. Electroforesis de los productos de digestin obtenidos para pGEX-GFP. En la primer

calle (M) se sembr el marcador de peso molecular. En la calle 12 nuestro producto de digestin.
Slo se obtuvo una banda de alrededor de las 3600 pb, correspondiente al vector lineal.
Slo se procedi a realizar la purificacin de dos grupos que haban obtenido suficiente producto de
digestin. Se cortaron los bloques conteniendo el fragmento de inters y se purific por QIAEX.
Se calcul la cantidad de inserto obtenidos a partir de una corrida de electroforesis con tincin por
bromuro de etidio, comparando las intensidades de las bandas del inserto con las del marcador de
peso molecular cuyas cantidades son conocidas.
Imagen 2. Electroforesis en gel de agarosa del fragmento conteniendo el inserto (calles 1 y 2 para
diferentes grupos) y marcador de peso molecular (M).
La banda que presenta una intensidad similar a la de nuestro vector es la que corresponde a la banda
del 10% (aproximadamente 4300pb) en el marker, cuya cantidad de ADN es de 50 mg.
A continuacin se realiz una ligacin del inserto con el vector en presencia de la enzima T4 ADN
ligasa en proporciones 3inserto:1vector para equiparar el tamao. Y se corri un gel de agarosa para
separar los fragmentos digeridos por tamao. Se realiz un control utilizando vector digerido
desfosfataseado y ligasa, para analizar el background de desfosfataseo errneo, es decir, la cantidad
de vector que es capaz de recircularizarse sin inserto.

Imagen 3. La calle 1 corresponde al control y la 2 al vector religado. El cuadro verde

correspondiente a las calles 1d y 2d no muestra bandas.
Con el vector religado se realiz una tranformacin de bacterias. Utilizamos un vector donado ya
que nuestra reaccin de ligacin no funcion.
Plaqueamos por dispersin con bolillas. No se obtuvieron colonias.

CONCLUSIONES
Con la Imagen 1 podemos comprobar que la digestin no funcion o no fue total, ya que solo se
observa una banda correspondiente al supercoil. Esto pudo deberse a que la enzima perdi actividad
o que no quedaba enzima en el eppendorf cuando pipeteamos, ya que fuimos el ltimo grupo.
En la purificacin tampoco se obtuvo banda, ni del vector ni del inserto (not shown).
En cuanto a la ligacin, no realizamos un control con inserto ms ligasa para analizar aquellos que
hubieran sido mal purificados porque nuestro inserto es de tamao chico y queda bien separado del
vector.
Nuestros productos de ligacin correspondientes a las calles 1d y 2d de la Imagen 3 no muestran
bandas, indicando que la cantidad que se utiliz de vector e inserto no fue suficiente, ya que a todos
los grupos que utilizaron dicho vector tampoco les dio banda ni crecieron colonias. Se puede
observar la correcta ligacin en las calles 1a, 1b y 1c, y su correspondiente control en las calles 2a,
2b y 2c.
Acerca de la transformacin, era de esperarse que no hubiera colonias por el mismo motivo. La
cantidad de ADN insertada fue tan escasa que no alcanz para que tuviramos alguna colonia
recombinante.