AISLAMIENTO DE DNA PLASMIDICO
INTRODUCCION
El termino DNA recombinante significa la unin o
recombinacin de dos piezas de DNA de dos diferentes
especies. Esta tcnica permite purificar un gen (clona)
de una especie para insertarlo al DNA de otras
especies, donde se replica junto con el DNA del
hospedero.
Los plsmidos, tambin llamados plasmidios, son
molculas de DNA extra cromosmico circular o lineal
que se replican y transcriben independientes del DNA
cromosmico. Estn presentes normalmente en
bacterias, y en algunas ocasiones en organismos
eucariotas como las levaduras, aparecen en el
citoplasma de las bacterias. Su tamao vara desde 1 a
250pb. El nmero de plsmidos puede variar,
dependiendo de su tipo, desde una sola copia hasta
algunos cientos por clula. Determinan ciertos rasgos,
que no son vitales, pero que de alguna manera
determinan la capacidad del organismo para adaptarse.
Estas molculas de DNA portan solamente unos pocos
genes que en cierto modo estn ligados al cromosoma
bacteriano, de forma que se replican en nmeros fijos,
junto con los cromosomas. Las molculas de DNA
plasmdico, adoptan una conformacin tipo doble hlice
al igual que el DNA de los cromosomas, aunque, por
definicin, se encuentran fuera de los mismos. Se han
encontrado plsmidos en casi todas las bacterias. A
diferencia del DNA cromosomal, los plsmidos no tienen
protenas asociadas.
OBJETIVOS
Aislar DNA plasmdico bacteriano, comprobando dicho
aislamiento mediante electroforesis en gel de agarosa.
RESULTADOS
Imagen 1. Electroforesis en gel de agarosa. Separacin
de las tres formas de plsmidos, revelado con luz UV.
DISCUSIONES
Para la obtencin de DNA plasmidico, este se realiz
por medio de una clula anfitriona, de la cual se utiliz
cepas de Escherichia Coli, en esta se encuentra el
plsmido ms representativo pUC 19 que lleva un origen
de replicacin y el gen de resistencia a la ampicilina. El
cultivo de esta bacteria provino de una sola colonia, la
cual fue cultivada en medio Luria-ampicilina en fase
logartmica, que es el agente selectivo (antibitico), y se
centrifugo 1.5 mL del crecimiento bacteriano en un tubo
eppendorf a 13000 rpm durante 5 minutos, se desech
el sobrenadante.
Posteriormente se adicionaron 100 L de la solucin I
(GTE), la cual est compuesta por glucosa, EDTA y Tris.
De esta manera al ser liberado el DNA, el Tris lo
solubilizara y a su vez le dar un medio estable, la
glucosa le proporciona una densidad adecuada
(gradiente) para que precipite el DNA de tamao
molecular pequeo (en este caso DNA plasmdico), por
ltimo el EDTA protege al DNA al no permitir que lo
ataquen las nucleasas (enzimas que atacan cidos
nucleicos) que tienen como cofactor al Mg+2, ya que el
EDTA forma un complejo con el cofactor y por lo tanto
no permite que las nucleasas realicen su funcin. Se
incuba en hielo para que reducir la actividad enzimtica,
mientras el EDTA realiza la captura del Mg+2.
Despus de haber incubado unos 5 minutos
aproximadamente en hielo, se adicionaron 200 L de la
solucin II, la cual contiene NaOH 0.2 N y SDS al 1%
(pH=11), esta solucin tiene la funcin de disolver
fosfolpidos y componentes proteicos de las membranas
nucleares, ya que la cabeza de sulfato provoca que la
membrana de la bacteria se rompa y se libere DNA,
protenas y otros plsmidos.
Seguido de esto, se procedi a adicionar 200 L de la
solucin III, la cual est formada de acetato de potasio
5M (pH= 4.8), por lo tanto la solucin precipita SDS
junto con otras macromolculas del medio. De esta
forma, al encontrarse primero la solucin anterior a pH
de 11 y despus pasar a un pH de 4.8, algunas de las
macromolculas se desnaturalizan, como el DNA
cromosomal, la cual queda en el precipitado, mientras
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que el DNA plasmidico se queda en el sobrenadante estimulacin que provoca que se desacomoden y
junto con el RNA al realizarse la centrifugacin durante reacomoden, esto desprenden una energa luminosa, lo
5 minutos a 13000 rpm. De inmediato el sobrenadante cual nos permite observa al DNA.
(que contiene al plsmido) se le adiciono 500 L de la
CONCLUSIONES
solucin IV, la cual contiene isopropanol, el cual provoca
la deshidratacin del DNA, provocando su precipitacin, Se logr aislar DNA plasmdico de Escherichia Coli, lo
en seguida se centrifugo por 5 minutos a 13000 rpm, cual se comprob por electroforesis en gel de agarosa
una vez terminada la centrifugacin se sec al aire el donde se pudieron identificar las tres formas en las que
tubo eppendorf y se adiciono la solucin V, la cual se encontraba en DNA plasmidico (super, lineal y
contiene Tris-EDTA, como se mencion anteriormente el relajada), resultando la forma super la que predomin, al
Tris le da un medio estable al DNA, mientras que el observar que fue la que migro con mayor rapidez al
EDTA lo protege del ataque de las nucleasas. nodo.
Por otra parte, se pes 1 g de agarosa y se suspendi
en 100 mL de regulador TB 1X y se calent hasta
licuefaccin, enseguida se verti la agarosa en el BIBLIOGRAFA
portageles de la cmara de la electroforesis, se coloc
el peine y se esper hasta que solidificara. Se tomaron 5
L del DNA plasmdico obtenido anteriormente y se 1. E. Conn Eric, Bioqumica fundamental,
Universidad de California, Editorial Limusa,
colocaron en un pozo para realizar posteriormente la
2001, Mxico D.F.
electroforesis. El DNA plasmdico posee con una carga 2. Voet Donald, Fundamentos de Bioqumica,
negativa, por lo que migra al nodo (carga positiva). El Editorial Mdica Panamericana, 2 Edicin,
DNA plasmidico se puede encontrar en 3 formas 2007, Madrid, Espaa.
diferentes: relajada, lineal y sper. El gel de agarosa es
una matriz que cuenta con pequeos espacios en donde
las molculas pueden ir pasando a travs del gel (como
si fueran una especie de tela). Entre menor sea el
tamao de la molcula, tendr una menor dificultad
para atravesar el gel, por lo tanto va a recorrer ms
distancia. En este caso, la forma ms pequea del DNA
es la super, lo que significa que migra con mayor
rapidez que las otras dos formas. La siguiente en migrar
ms rpido es la forma lineal, tiene una mayor superficie
de contacto que la forma anterior, lo cual dificulta un
poco su paso a travs de la agarosa. Seguida de esta
forma, se encuentra la relajada, es la que tiene mayor
volumen, por lo que su migracin es muy dificultada,
aunque an as puede migrar pero con una dificultad
mayor.

El RNA al ser un compuesto de bajo peso molecular, no

tiene dificultad de migrar al nodo, por lo que se observa
una gran concentracin de l, en la parte inferior. En
cambio el DNA cromosomal, su molcula es muy grande
para atravesar el gel, por lo que se observa que no
migra casi nada. Para poder observar el corrimiento de
estas molculas, se revel con bromuro de etidio, este
se intercala entre los cidos nucleicos (bases) y sirve
como marcador, se observ con luz U.V. debido a que
as los orbitales de los electrones sufren una
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