SEPARACIN, CARACTERIZACIN Y GRADO DE PUREZA OBTENIDO EN EL

CIDO DESOXIRRIBONUCLEICO-ADN
Mnica Fernndez (201210571)
Karen Manzilla (201210632)
Natalia Vargas (201210708)
Laboratorio de Bioqumica avanzada, Escuela de Ciencias Qumicas, Facultad de
Ciencias Bsicas, Universidad Pedaggica y Tecnolgica de Colombia, Tunja.

monifernandez09@gmail.com

Resumen

En esta prctica de laboratorio se hizo la separacin, caracterizacin y determinacin del

grado de pureza del cido desoxirribonucleico (ADN) de una muestra de tejido animal
(Hgado), mediante la separacin de sus cidos nucleicos, el aislamiento del ADN, se hizo
la caracterizacin por espectroscopia UV-vis. A la muestra obtenida a pH fisiolgicos, se le
determin el espectro de absorcin entre los 240-320 nm, determinando la razn
A260/A280 y estableciendo el grado de pureza de la extraccin que fue de (1,335), la
cantidad de ADN obtenida en la prctica(1051,5g) y la concentracin de esta(210,3 g/ml).
Otra de las caractersticas a la que se someti la muestra, fue a diferentes pH, para
determinar el efecto que este tena en dicha muestra, y los test de Bial y Dische.

Palabras claves: ADN, extraccin, tejido, grado de purificacin.

Abstract

In this lab separation, characterization and determination of the degree of purity of

deoxyribonucleic acid (DNA) from a sample of animal tissue (liver), by separating its nucleic
acid was DNA isolation, characterization was made UV-vis spectroscopy. A sample obtained
physiological pH, was determined absorption spectrum 240-320 nm between determining
the ratio A260 / A280 and establishing the degree of purity of the extractant was (), the
amount of DNA obtained in practice () and the concentration of this. Another feature to which
the sample was subjected, at different pHs was to determine the effect this had on the
sample, and the test and Dische Bial.

Keywords: DNA extraction, tissues, degree of purification.

INTRODUCCIN La mayor parte de los mtodos que

existen para extraer el ADN consisten
La extraccin de ADN se realiza para en lograr primero la lisis o ruptura de
obtener las molculas aisladas con
alto grado de pureza y poderlas utilizar la clula, para luego separar las
en investigacin cientfica, en molculas de ADN del resto de los
medicina o para la ciencia forense. constituyentes de la clula.

A la hora de escoger que mtodo de
extraccin de ADN utilizar se tienen en
cuenta varios factores:
La cantidad de muestra de la que
se dispone para extraer el ADN.
El tipo de muestra o fuente de la
que se quiere obtener el ADN.
La pureza con la que se quiere
obtener el ADN extrado.
El tiempo que consume cada
mtodo, su costo y el rendimiento
esperado.
Uso que se le va a dar al ADN
extrado.
Con la diversidad de mtodos
conocidos actualmente se puede
extraer ADN de muchos sustratos
como son la sangre, la saliva, la orina
y otros fluidos corporales, tejidos
vivos, cultivos celulares, lquido
amnitico, entre otros.
El lisado de las clulas mediante un
proceso mecnico hay que tener en
cuenta la posibilidad de ruptura de las
molculas de ADN que se intentan
separar, por lo que este debe bastar
para lograr la lisis de las clulas pero
no ser muy agresivo para proteger el
ADN. Este mtodo puede ser usado
para extraer ADN de material crudo,
liofilizado o congelado, que puede
romperse con un mortero, por
congelacin-descongelacin o usando
ultrasonidos. El lisado de clulas se
puede extraer con cloroformo, alcohol
isoamlico o fenol, siendo las protenas
y otros componentes de la clula
solubles en el disolvente orgnico, por
lo que de esta forma se logra la
separacin de los cidos nucleicos.
Este mtodo se puede usar para
molculas de ADN de alto peso
molecular, obteniendo buenos
rendimientos de molculas
relativamente puras, siempre teniendo
en cuenta que hay que controlar el pH
de la fase acuosa y la concentracin
de sales, que son los factores que
aseguran una buena separacin. Las
desventajas de este mtodo son el uso
de disolventes orgnicos dainos para
la salud humana y que pueden quedar
como trazas en la muestra de ADN y
luego actuar como interferentes en
tcnicas como el PCR, que es largo,
en ocasiones puede dar rendimientos
poco reproducibles y requiere de
varios trasvases que aumentan la
posibilidad de contaminacin de la
muestra.
RESULTADOS Y DISCUSIN

1. CONCENTRACIN DE ADN:

Factor de dilucin= Vf/Vi

Factor de dilucin= 6ml/1ml
Factor de dilucin= 6

/ = (260)( )(50/ 1. 260)

/ = (0,701)(6)(50/ 1. 260)

/ = 210,3 /

2. CANTIDAD DE ADN OBTENIDO:

= ( ) ()

= 210,3/ 5 ()

= 1051,5

3. PUREZA DEL ADN:

A260nm: 0,701
A280nm: 0,525
0,701
260/280 =
0,525

260/280 = 1,335

Una vez realizada la extraccin de ADN es muy importante comprobar su pureza y

su cuantificacin. Para comprobar su pureza, se midi espectrofotomtricamente la
absorbancia a 260nm (A260) y a 280nm (A280), ya que los cidos nucleicos tienen su
mximo de absorcin a 260nm mientras que las protenas lo tienen a 280nm.
Por lo tanto, viendo la relacin entre ambas absorbancias (A260/280) se sabe si ADN
genmico extrado esta puro o contaminado con restos de protenas; lo ideal es que
1,8 A260/280 2,0, pero lo obtenido en la prctica fue 1,33.

4. EFECTO DEL pH:

En esta prueba la muestra de ADN obtenido en la experiencia fue sometida a
diferentes pH:
pH de la solucin Absorbancia a
de ADN 260nm
8.5 0,7
9.5 0,6
12 0,5

Condiciones extremas tales como Sin embargo, en la prueba realizada

temperaturas elevadas y pHs alcalinos
ocasionan una ruptura de los enlaces
no covalentes (puentes de hidrogeno)
entre bases nitrogenadas de dos
hebras complementarias, asi como la
desesablizacion del apilamiento de
dichas bases. Esta desnaturalizacin
de la doble hlice de ADN puede ser
evidenciada por un aumento en la
absorbancia a 260 nm; ya que las
bases nitrogenadas al estar libres
presentan mayor capacidad de
absorcin. (Por la resonancia de sus
respectivos anillos).
acerca del efecto que tiene el pH en
las muestras biolgicas de ADN se
observ un comportamiento errneo,
ya que a mayor pH se observ una
disminucin de la absorbancia por
parte de las soluciones. Esto pudo
deberse a la errnea preparacin de
las soluciones buffer, o a un mal
clculo de dilucin de la muestra de
ADN.
PRUEBAS DE CARACTERIZACIN:
Para la realizacin de las pruebas (Bial y
Dische) fue necesario hacer una hidrolisis
previa a estas, la cual consisti en tomar
1mL de la solucin original de ADN
posteriormente se le adiciono 1mL de HCl
1N y 1mL de TCA al 20%, finalmente se
puso a bao mara a ebullicin durante 15
min. La hidrlisis cida se realiza con el
Test de Bial
fin de remover todas las bases pricas
(hidrlisis de uniones N-glicosdicas entre
pentosa y las bases pricas) sin afectar
las uniones fosfodiester del esqueleto
nucleotdico, por lo tanto se obtiene como
producto cidos nucleicos sin bases
pricas. Una vez realizada la hidrolisis
acida, se realizan las pruebas
correspondiente
producto verde que demuestra la
presencia de desoxirribosa en el ADN.

Para esta prueba se tomaron 0,5 mL de la

solucin de ADN (hidrolizada) y se le
adiciono 2mL del reactivo de Bial se
homogeneizo y se puso en bao maria a
ebullicin durante 20 minutos.

En esta prueba se observ la formacin

de una coloracin verde, indicando
resultado positivo para esta. El reactivo de
Bial esta compuesto por orcinol, HCl y
FeCl3. Se basa en la deshidratacin de las
pentosas en medio acido dando como Test de Bial positivo
resultado furfural, el cual reacciona con
orcinol y FeCl3, dando productos de
condensacin los cuales se diferencian
por la presencia de color.

La pentosa del ADN puede evidenciarse

por la reaccin con orcinol. El cido,
hidroliza las uniones fosfodiester y N-
glicosdicas, liberando desoxirriribosa,
bases pricas, pirimidnicas y cido
fosfrico. La pentosa en medio cido se Test de Dische.
deshidrata originando furfural que
reacciona con el orcinol dando un Esta prueba consisti en tomar 1mL de la
solucin de ADN a la cual se le agrego
2mL del reactivo de Dische. Se
homogenizo y se coloc la muestra en
bao mara a ebullicin durante 10
minutos.

Esta prueba se usa para la estimacin de

desoxirribosa. Esta, se puede observar
mediante la formacin de color azul al
calentar la muestra en presencia del
reactivo de Dische en solucin acida
En esta prueba, las desoxirribosas,
debido a la hidrlisis cida sufren
deshidratacin dando aldehdos -
hidroxi-levulnicos. Estos reaccionan con
difenilamina (componente del reactivo de
Dische) dando un producto de color azul.
Este test arrojo resultado negativo,
aunque era de esperarse que el resultado
fuera positivo debido a la presencia de
desoxirribosa en la estructura del ADN. El
resultado negativo probablemente se dio
por problemas con el reactivo de Dische.
ACCIN DE LOS DISTINTOS
DISOLVENTES:
La sacarosa rompi la
membrana plasmtica pero no
CONCLUSIONES
La presencia de pentosa en el
ADN se puede determinar
mediante el test de bial, el cual es
caracterstico para la
determinacin de estas, mediante
la deshidratacin de las pentosas
en medio cido y la formacin de
productos de condensacin los
cuales se diferencian por la
presencia de color verde.
La prueba de Dische es especfica
para la determinacin de
desoxirribosa, por lo cual se
esperaba que la prueba fuera
positiva debido a la presencia de
los organelos, con el CaCl2
como amortiguador.
EDTA y NaCl es inhibieron de
nucleasas y un buen tampn
para la conservacin del ADN,
es un buen agente quelante,
inhiben la accin de ADNasas,
adems ayud a la
precicpitcin de ADN ya que el
Na+ neutraliza los iones
negativos, permitiendo la
precipitacin.
El SDS es un detergente inico
que desnaturaliz las protenas
pero adems inhibi las PCR.
El perclorato de sodio, provoc
la degradacin del ADN lineal
Cloroformo: Alcohol isomlico
permitieron la separacin de 2
fases; el ADN queda en la fase
acuosa y en la fase orgnica
quedan las protenas y otros
contaminantes.
Etanol precipit al ADN.
desoxirribosa en el ADN, pero
debido a problemas con el
reactivo, la prueba arrojo resultado
negativo.
La concetracion de la muestra de
ADN obtenida en el laboratorio fue
de 210,3 g/ml, con una cantidad
neta de ADN del 1051,5 g.
El grado de pureza obtenido en la
practica de 1,3, debido a posibles
errores en el aislamiento de los
acidos nucleicos, o en la
caracterizacin de la muestra en el
momento de las dilusiones.
Las Condiciones extremas a las
cuales la muestra fue sometida
 (pHs alcalinos) ocasiono una
ruptura de los enlaces no
covalentes (puentes de hidrogeno)
entre bases nitrogenadas de dos
hebras complementarias, asi
como la desesablizacion del
apilamiento de dichas bases, pero
el resultado no se pudo observar
en la caracterizacin por
espectroscopia, se observ un
comportamiento errneo, ya que a
mayor pH se observ una
disminucin de la absorbancia por
parte de las soluciones. Esto pudo
deberse a la errnea preparacin
de las soluciones buffer, o a un
mal clculo de dilucin de la
muestra de ADN.
Aunque las absorbancias a 260
y 280nm, estuvieron entre el
rango de 0,5 1, la pureza de
la muestra no fue la esperada
ocasionada quizs por un mal
manejo de tiempos de
centrifugacin o las cantidades
errneas de los distintos
disolventes adicionadas para la
extraccin

BIBLIOGRAFIA

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