Académique Documents
Professionnel Documents
Culture Documents
VALDIVIA CHILE
2005
Dedico este trabajo de tesis a mis
padres Mario e Irma, hermanos
Rodrigo y Marlis y muy especialmente
a mi esposa Mabel por todo su apoyo
durante la realizacin de este trabajo.
AGRADECIMIENTOS
Quiero tambin agradecer a las Doctoras Ana Maria Zrraga O. y Gloria Len R.
por haber aceptado ser parte de mi comisin evaluadora, por todos los consejos
director de escuela Dr. Alejandro Reyes a los docentes y funcionarios del Instituto
este trabajo.
INDICE
Pginas
1. Resumen 1
1.1. Summary 2
2. Introduccin 3
3. Materiales y mtodos 20
3.1. Materiales 20
3.1.1. Reactivos 20
3.1.2. Equipos 21
4. Resultados 32
5. Discusin 49
6. Bibliografa 58
iii
INDICE DE FIGURAS
INDICE DE TABLAS
LISTADO DE ABREVIATURAS
Sp : Spjarub
Ab : Abild
1. RESUMEN
Una de las enfermedades virales de importancia econmica que afecta a los cultivos
En este estudio se plante como hiptesis la presencia de los serotipos Sp, Ab, VR-
cultivo del salmn del Atlntico durante el ao 2004. Por tanto la importancia del
endonucleasas de restriccin; Una vez obtenidos los perfiles de cada una de las
cepas de estudio, stas se compararon con los perfiles de las cepas de referencia.
que afectaron al cultivo de salmn del Atlntico (S. salar) durante el ao 2004
1.1. SUMMARY
farms in Chile.
On this study the proposed hypothesis was the presence of the serotypes Sp, Ab, VR
-299 on Atlantic Salmon farmed in the X and XI Region, during the year 2004, being
the objective to identified the which was the genotype of the IPNV that affected the
Atlantic Salmon that year. Therefore the importance of the present study, considering
that one of the characteristics among the serotypes is the mortality associated to the
presence of each one of them, is that knowing the more prevalent serotype, better
prophylactic and handling procedures could be done in realize to diminish the fish
For genotipification of the studied isolates, the RFLP (Restriction Fragment Length
Once the profiles were obtained of every one of the studied strains, these were
environments of the X and the XI region, one concluded that the IPNV infections that
affected the Atlantic Salmon (Salmo salar) farmed on the year 2004 corresponds to
2. INTRODUCCIN
que ha mostrado mayor dinamismo y crecimiento dentro del sector acucola nacional.
mayor exportacin fue salmn del Atlntico (S. salar), con 196.283 toneladas,
seguido de salmn coho (O. kisutch) con 75.691 toneladas y en tercer lugar, trucha
arcoiris (O. mykiss), con 81.690 toneladas, generando ingresos de 875.836, 231.860
(Mndez, 1988).
4
econmica. Entre estas enfermedades, las patologas causadas por agentes virales
En este contexto, podemos mencionar, por ejemplo, que el impacto econmico de las
casos el costo directo es ms sensible, dado que la mayora de las prdidas afectan
generalmente a animales jvenes, para los cuales los costos de produccin se ven
Entre las enfermedades virales de importancia econmica que afectan a los cultivos
IPN est diseminado por todo Chile causando cuantiosas prdidas econmicas
tanto, en cultivos de agua dulce como cultivos de mar. Esta enfermedad produce
ao 2004. Todos estos datos se calculan a partir de las mortalidades registradas por
las prdidas debidas, tanto a la reduccin del volumen de cosecha como a los costos
et al., 1999).
cultivo de agua dulce. Una vez trasladados los peces a centros de engorda la
mortalidad asociada a este virus producto del estrs propio el traslado, se estima en
comprometan a distintas empresas; sin embargo fue slo hasta noviembre de 1998
6
en que se publica y oficializa la presencia de IPNV en Chile por parte del SERNAP.
mykiss), como en salmn del Atlntico (S. salar) (Isshiki et al. 2001).
referencia VR-299 (Americano), arroj que se trataba del mismo serotipo; por otra
que los patrones de mortalidad son similares a los observados en Europa por brotes
designada como tal en el ao 1984. (Mims and White, 1984; Roberts, 1989; Fenner
et al., 1993). Todos los Birnavirus acuticos son similares, tanto en morfologa como
al., 1989).
Desde el punto de vista molecular, el genoma del virus IPNV consta de dos
segmentos de RNA de doble hebra circunscritos por una cpside icosahdrica simple
polipptido interno VP1 (94 kDa). Se presume que el virin est asociado a RNA
3100 pb) contiene 2 ORF (Ducan et al., 1987; Havarstein et al., 1990). El ORF largo
codifica una poliprotena de 106 kDa, la cual produce 3 polipptidos: pVP2, precursor
maduracin del virus. VP2 es la protena exterior de la cpside del virus, mientras
8
que VP3 es una protena interna del virin. La actividad proteasa responsable de los
cortes ha sido asociada con una protena no estructural del virin NS (Duncan et al.,
1987; Manning and Leong, 1990; Manning et al., 1990; Magyar and Dobos, 1994). El
para 4 cepas: Jasper-Dobos (JaD) (Duncan and Dobos, 1986), N1 (Havarstein et al.,
1990), Sp (Mason and Leong, 1996) y West Buxton (WB) (Yao and Vakharia, 1998).
identificarse una considerable variedad de serotipos, entre los cuales, los tres
1990; Okamoto et al., 1993), los cuales pueden diferenciarse entre si,
aislados presentan variabilidad antignica respecto del serogrupo anterior por lo que
han sido clasificados como pertenecientes a otro serogrupo (serogrupo B), todo esto
sobre la base de ttulos de neutralizacin con antisueros policlonales (Hill and Way,
et al., 1988; Christie et al., 1990). Por otra parte, virtualmente todos los birnavirus
10
encuentran en Canad, mientras otros cinco serotipos A2, A3, A4, A5 y A10
aparecen en Europa.
al., 1989).
afecta tanto a alevines como a peces de mayor tamao, presenta una amplia
(Woo, 1999)
ACTUAL
Serogrupo A
Serogrupo B
entre el primer y cuarto mes de cultivo, llevando muchas veces a una mortalidad
acumulada del 100%. Por el contrario, en cultivos mayores a seis meses o ms, la
Los tejidos de los peces afectados, tales como el pncreas y tejidos vecinos se
Externamente los peces afectados por IPNV muestran natacin errtica, con
observar tanto el hgado como el bazo con evidentes signos de anemia, el estmago
e intestino con ausencia total o parcial de alimento pero con fludo mucoide, en tanto
1992). La vescula biliar puede estar dilatada y repleta de bilis (Quaglio, 1989). El
epitelio intestinal necrtico se une con el exceso de mucus para formar un exudado
por mediacin del agua y de otros vectores, sean stos animados o inanimados, la
pueden transmitir de esta forma (Caldern, 1998). Sin embargo, el peligro radica en
1988). Adicionalmente existe evidencia de que el virus IPN tambin puede ser
enzima (ELISA) (Nicholson and Caswell, 1982; Dixon and Hill, 1983b; Hattori et al.,
(McAllister and Schill, 1986; Ramsey et al., 1986; Caswell-Reno et al., 1989; Babin et
al., 1991; Ross et al., 1991), fijacin del complemento (Finlay and Hill, 1975),
de staphylococcus (Kimura et al., 1984; Bragg and Combrick, 1987b), entre otros.
de ste en lneas celulares adecuadas, sin embargo, estos resultados deben ser
propagarlo para estudiar su ciclo infectivo. De esta forma se obtiene gran cantidad de
Entre los distintos tipos de lneas celulares implementadas para estos propsitos se
aquellas que se mantienen slo durante un cierto nmero de ciclos, las cuales
gran nmero de lneas celulares y especficamente en el caso del virus IPN, las que
mejor resultado han evidenciado son la lnea celular Salmon Chinook Embryo
fibroblstica, cuyo origen son clulas gonadales de trucha arcoiris (Fryer et al., 1965),
cada una de ellas tiene sus parmetros de crecimiento propios y requieren de una
16
cuidadosa manipulacin.
desarrollaron por el mtodo de los cultivos celulares y de hecho, hoy se sigue usando
sensibilidad, ya que en teora basta una sola partcula viral para infectar las
la lisis de la clula, proceso que se conoce como efecto citoptico (ECP); pero su
contar con mtodos de diagnsticos rpidos y exactos. Por esta razn a comienzos
1986; Reno, 1988), como tambin se comienzan a realizar por esos aos los
and Thomsen, 1986; McAllister and Owens, 1986), con el propsito de estudiar la
patognesis del virus y detectarlo en posibles portadores. En los aos 90 surgen los
Con este mismo objeto, surge tambin a mediados de la dcada de los 90 el PCR
permite que una secuencia de ADN especfica y nica del microorganismo que se
desea identificar sea amplificada varios millones de veces en unas pocas horas.
reacciones mediadas por enzimas, cuyo producto final es una copia exacta del
(RFLP), se basa en cortar una secuencia genmica con enzimas de restriccin las
plantea como hiptesis que en los cultivos de salmn del Atlntico, desarrollados en
Sp, Ab y VR-299, los cuales habran afectado al cultivo del salmn del atlntico en
dicho periodo.
especficos:
Objetivo General:
Objetivos especficos:
Identificar las variantes genticas IPNV, que afectan al salmn del Atlntico,
RFLP.
20
3. MATERIALES Y MTODOS
3.1. MATERIALES
3.1.1. REACTIVOS
- Agarosa, Invitrogen.
- dNTPs, Invitrogen.
- Etanol, Merck.
- Estreptomicina, Invitrogen.
- Penicilina, Invitrogen.
- Proteinasa K, Invitrogen.
- RNasin, Promega.
- Trizol, Invitrogen.
- Tris, Merck.
3.1.2. EQUIPOS
Para el aislamiento de las diferentes cepas aisladas de virus IPN utilizadas en este
Para realizar este trabajo se utilizaron 15 cepas de virus IPNV, las que fueron
Se aisl el virus IPN, mediante la tcnica de cultivo celular, utilizando la lnea celular
viral de 15 C. La lnea celular CHSE-214 crece en una monocapa celular con medio
de cultivo MEM (Minimum Esencial Medium (Invitrogen)), el cual esta constituido por
bloquearon los sitios inespecficos del papel con una solucin de leche descremada
incub por un perodo de 1 hora, una vez finalizada la segunda incubacin se agreg
(BiosChileR), este es un kit comercial para la deteccin del virus IPN, en este ensayo
etapa, ya que las enzimas transcriptasa reversa y Taq DNA polimerasa estn
Como control se utilizaron tres cepas previamente serotipificadas del virus IPN,
los cDNAs del genoma del segmento A de las cepas de Birnavirus acutico Ja y N1.
Estos primers corresponden a los publicados por Blake et al., (1995) y son los
siguientes:
Estos partidores amplifican una regin de aproximadamente 1180 bp del gen que
El RNA fue extrado desde sobrenadante de cultivo celular Infectado con IPNV, para
lo cual se extrajeron 100 l de la suspensin viral los que fueron incubados con 400
l de tampn de lisis (Tris HCl 30 mM, pH 7.4 (Merck), SDS 1% (Merck), NaCl 100
a 37C por 30 min. El RNA fue extrado con TRIzol (Invitrogen), segn instrucciones
del fabricante.
26
Las muestras de RNA fueron calentadas por 5 min. a 95C, y luego colocadas sobre
mezcla fue incubada por 1 h a 42C y luego calentada por 5 min. a 95C para
denaturar la enzima .
El PCR descrito por (Blake et al., 1995) fue utilizado para amplificar los fragmentos
35 ciclos (denaturacin inicial por 5 min a 95C, denaturacin por 45 seg a 94C,
apareamiento por 45 seg a 60C y extensin por 1.5 min a 72C y una extensin final
A 95 l de cDNA se le adicion 205 l de agua estril a los que se les agreg 300 l
precipit con 2 volmenes de etanol absoluto (600 l), (Merck) y 0,1 volumen de
toda la noche y luego el ADN se recupero por centrifugacin a 13.000 rpm por 15
etanol al 70% (Merck), luego se centrifug nuevamente a 13.000 rpm por 5 min. a
endonucleasas de restriccin Eco RI, Pvu II, Hae III, Mbo I y Bam HI (Invitrogen).
Esta digestin se llev a cabo a 37C por 1 hora, de acuerdo a las condiciones
computacional BioCap 1.
mM) (Invitrogen) a 100 mA durante 1 hora. Los geles fueron teidos con bromuro de
etidio (0.5 g/ml) (Sambrook et al., 1989), posteriormente fueron puestos sobre un
las cepas de referencia (Sp, Ab y VR-299) con las que cuenta el laboratorio
Aquagestion-Fundacin Chile
30
presentaron signos clnicos, en lneas celulares CHSE-214 segn lo descrito por OIE
undcima regin.
32
4. RESULTADOS
(2004), obtenindose efecto citoptico (EPC) promedio entre los 4 y 7 das. La tabla
cada cepa aislada, la especie de donde fue aislado, etapa de cultivo de los peces y
utilizando las tcnicas Dot-Blot (Sambrook, et al. 1989), PCR ELISA (Caswell-Reno,
La tabla 4 resume los resultados obtenidos en cada una de las cepas, aqu se
cultivos celulares y con cada una de las tcnicas utilizadas para la confirmacin del
virus IPN de los diferentes cepas aisladas, provenientes de salmn del Atlntico.
33
ESTADO DE AMBIENTE
CULTIVO
Reloncavi
destruccin total de la lnea celular. Este efecto citoptico fue observado en las 15
cepas utilizadas en este trabajo. La figura 1B, muestra la lnea celular CHSE-214, en
mediante Dot-Blot, para realizar esta confirmacin se tom la cepa 4 y 8 (tabla 2),
citoptico de una de las cepas utilizadas como referencia. Todos las cepas aisladas
mediante esta tcnica la reaccin positiva se observa mediante una coloracin caf.
36
A B
1 2 3 4
Cepa 4; 4: Cepa 8.
37
Posterior a la confirmacin del efecto citoptico de todas las cepas en estudio Dot-
confirmaramos que todas las cepas aisladas para realizar este trabajo
tomaron 4 cepas, 4, 8, 10 y 11, esta fotografa fue puesta en negativo para resaltar
viral se realiz en una sola etapa, cabe hacer mencin que los partidores que utiliza
este kit son distintos a los utilizados en este trabajo. Esto permite sintetizar el cDNA
Una vez observado el resultado del gel de agarosa procedimos a realizar un ELISA
con el producto de PCR obtenido para cada una de las muestras seleccionadas. La
tabla N 5 muestra la absorbancia obtenida por cada una de las cepas (4, 8,10 y 11)
a una longitud de onda de 405 nm. Para realizar este ensayo, se utiliz como control
de la cepa Sp de referencia.
38
1 2 3 4 5 6 7
pb
2072
600
455
400
200
Figura 3: Gel de agarosa 1.5% teido con bromuro de etidio obtenido mediante
de onda de 405 nm, de las cepas 4, 8, 10 y 11, adems de sus respectivos controles.
N CEPA ABSORBANCIA
4 2.082
8 1.806
10 1.107
11 1.456
39
Adicionalmente junto con observar el efecto citoptico y realizar todas las pruebas
verde. En el recuadro se indica como se ve una muestra sin efecto citoptico debido
La figura nos muestra la reaccin obtenida para la cepa N 4, esta fotografa fue
En base a la metodologa descrita de RFLP (Lee et. al., 1996), se procedi a realizar
el RT- PCR de las tres cepas utilizados como referencia (Sp, Ab, VR-299),
(1180 pb), esta fotografa fue puesta en negativo para resaltar las bandas. Una vez
obtenido este producto se procedi a digerir con enzimas de restriccin. Para esto
utilizamos las 5 enzimas de restriccin seleccionadas en este trabajo (Eco RI, Bam
HI, Mbo I, Xho I y Pvu II). En la figura 6 podemos observar el resultado obtenido por
cada una de las enzimas en cada una de las cepas utilizadas como referencia en
este estudio. El panel A muestra el perfil de la cepa Sp, el panel B muestra el perfil
resume los distintos tamaos de peso molecular obtenidos al cortar con enzimas de
restriccin cada una de las cepas control, estos tamaos fueron obtenidos utilizando
pb 1 2 3 4 5 6
2072
1500
1180
600
400
200
se cargaron 10 l del producto PCR sobre un gel de agarosa al 1.5 % teido con
bromuro de etidio, Carril 1: Estndar de tamao molecular, Carril 2: Cepa Sp, Carril
3: Cepa Ab, Carril 4: Cepa VR-299; Carril 5: Control positivo; Carril 6: Control
negativo.
43
A B
pb 1 2 3 4 5 6 7 pb 1 2 3 4 5 6 7
pb
pb 2072
2072
1180 1180
600
600 580
425 440
400
400
200
190
200 160
1 2 3 4 5 6 7
C pb
2072
pb
1180
630
600
550
400
200
1180 bp sin digerir; Carril 3: Digestin con Eco RI; Carril 4: Digestin con Bam HI;
Carril 5: Digestin con Mbo I; Carril 6: Digestin con Xho I; Carril 7: Digestin con
Pvu II.
44
Tabla 6: Esta tabla muestra los fragmentos obtenidos por cada una de las cepas de
ENZIMAS
710 pb 630 pb
VR-299 1180 pb 610 pb 1180 pb
470 pb 550 pb
320 pb
425 pb
Sp 1180 pb 1180 pb 290 pb 1180 pb
190 pb 190 pb
480 pb 580 pb
260 pb 440 pb
Ab 1180 pb 1180 pb 1180 pb
250 pb
160 pb
190 pb
45
En base a la metodologa descrita de RFLP (Lee et. al., 1996), se procedi a realizar
el RT- PCR y RFLP de las 15 cepas aisladas de IPNV obtenidas a partir de casos
La figura 7 muestra los perfiles de cada una de las muestras seleccionadas para
realizar este estudio, todas las figuras se presentan en negativa para resaltar mas las
bandas de cada una de ellas. En cada una de las figuras observamos los fragmentos
RFLP obtenido por cada una de las endonucleasas de restriccin utilizadas en este
estudio. Cada uno de los perfiles obtenidos fue contrastado con los perfiles obtenidos
por cada una de las cepas de referencia. En todas las figuras se observa claramente
que el perfil obtenido coincide con el perfil obtenido para la cepa de referencia Sp.
46
A B
pb 1 2 3 4 5 6 7
1 2 3 4 5 6 7 pb
2072 2072
pb
pb
2072
1180
600
600
425
400
400 425
320
200 200
190
C D
pb 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7
pb
2072
pb 2072 pb
1180
1180
600 600
425
400
400
425
320 320
200 200
E F
pb 1 2 3 4 5 6 7 pb 1 2 3 4 5 6 7
2072 pb 2072 pb
1180 1080
600 600
425 425
400
320 400
320
200
200
47
G H
pb 1 2 3 4 5 6 7 pb 1 2 3 4 5 6 7
2072 pb 2072 pb
1080 1080
600
600
425 425
400 400
320
320
200 200
I J
pb 1 2 3 4 5 6 7 pb 1 2 3 4 5 6 7
2072 pb 2072 pb
1080 1080
600
600
425
400
400 425
320
320
200 200
K L
pb 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7
pb
2072 pb 2072 pb
1180
1080
600
600 425
400
425
400
320
320
200
200
48
M N
pb 1 2 3 4 5 6 7 pb 1 2 3 4 5 6 7
2072 pb 2072 pb
1180 1180
600 600
400 425
425 400
320
320
200 200
O
1 2 3 4 5 6 7
pb
pb
2072
1080
600
400 425
320
200
K: Cepa N 11; L: Cepa N 12; M: Cepa N 13; N: Cepa N 14; O: Cepa N 15. Los
carriles en todas las figuras siguen el mismo orden, Carril 1: Estndar de Tamao
Molecular 100 bp; Carril 2: Fragmento de 1180 bp sin digerir; Carril 3: Digestin con
Eco RI; Carril 4: Digestin con Bam HI; Carril 5: Digestin con Mbo I; Carril 6:
5. Discusin
trata de enfermedades infecciosas en las cuales gran parte de los animales que
perodos de tiempo.
Entre las enfermedades virales de importancia econmica que afectan a los cultivos
del virus, es necesario contar con mtodos de diagnstico rpidos y sensibles. Los
mtodos altamente sensibles son necesarios para la deteccin de los virus durante la
pueden ser separados es dos grupos, aquellos que miden la presencia del virus y
1999).
51
comprometan a diferentes empresas, sin embargo fue slo hasta noviembre de 1998
cultivos
52
Entre las tcnicas utilizadas para la serotipificacin del virus IPN se encuentran la
(RFLP) (Heppel et al., 1992; Lee et al., 1996 and Cutrn et al., 2004 ).
ha sido usada para comparar cepas de referencia tipo con aislados locales de
diferentes reas (Heppel et al., 1992; Lee et al., 1996; Biering et al., 1997; y Cutrn et
al., 2004). En estos estudios, los fragmentos amplificados no todos tienen el mismo
a la regin variable NS, mientras Lee et al. (1996) y Biering et al. (1997) utilizaron
anlisis de RFLP a una regin mas larga de la protena VP2. Sobre esta base Heppel
et al. (1993) amplifico cepas de los serotipos del serogrupo A y no encontraron una
regin completa de la protena VP2 los resultados muestran una correlacin entre
Lee et al (1996) ellos no emplean cepas de referencia para todos los serotipos
existentes.
53
En este estudio se utiliz como blanco gentico una regin genmica de 1180 bp,
Esta regin genmica fue escogida por varias razones. Primero investigar una regin
genmica utilizada en estudios previos codifica para las protenas NS y VP2. Segn
Los productos PCR de las tres cepas de referencia y cada uno de los aislados
utilizados en este estudio, fueron digeridos con 5 enzimas de restriccin, cada uno de
bibliografa publicada se seleccionaron las enzimas Eco RI, Bam HI, Pvu II, Mbo I y
Xho I debido a que estas presentaban mayor variabilidad en los perfiles de cada una
en cada una de las cepas de referencia utilizadas en este estudio (Sp, Ab y VR-299).
Para la cepa de referencia Sp y Ab, las enzimas Eco RI y Bam HI no produce ningn
corte, mientras que para la cepa de referencia VR-299 la enzima Eco RI nos genera
enzima nos esta diferenciando entre la cepa VR-299 y las cepas Sp y Ab. Por otro
lado la enzima Bam HI no produce ningn corte en ninguna de las tres cepas de
referencia, la enzima Mbo I produce distintos fragmentos en cada una de las cepas
610 bp aproximadamente, las bandas que faltan son de pequeo tamao molecular
producidos por esta enzima son de 320 , 290 y 190 pb respectivamente, los
visualizados por el gel de agorasa, para la cepa Ab los fragmentos obtenidos son de
480, 260, 250 y 190, para esta cepa se puede observar el perfil completo obtenido
por la enzima Mbo I, la enzima Xho I no genera ningn corte en ninguna de la tres
cepas utilizadas como control, mientras que la enzima Pvu II nos genera un perfil en
las tres cepas de referencia, para la cepa VR-299 el perfil obtenido es de 630 y 550
respectivamente.
55
debieran haber producido cortes sin embargo esto se puede explicar debido a la
(Heppel et al., 1992 and Lee et al., 1996). Debido a que los tres serotipos utilizados
es que causo las perdidas econmicas por concepto de mortalidad de peces a causa
Los paneles de la figura 7 muestran los perfiles de las 15 cepas aisladas utilizadas
en este estudio, estos perfiles fueron comprados con los obtenidos por las cepas de
Como podemos ver en los resultados de la figura 7 panel A al O todos los aislados
de IPNV que fueron sometidos a anlisis de RFLP, muestran el mismo perfil, el que
presenta un 100 % de similitud con el perfil obtenido para cepa de referencia Sp. A
partir de estos resultados es posible concluir que en base a las muestras analizadas
2004. De esta forma podemos concluimos que todos los aislados de IPNV sometidos
afirmar esto en falta realizar en un estudio posterior una relacin filogenetica de las
y martimo para los centros de engorda, ocupados para el cultivo de salmonidos, los
En base a los resultados de este estudio se concluye que las infecciones de IPN en
coincide con el perfil obtenido mediante RFLP para la cepa de referencia Sp..
Chile.
6. Bibliografa
Ahne, W. (1979). Isolation of infectious pancreatic necrosis virus from pike (Esox
biological standardization. Leetown, W. Va, USA 1981. S. Karger. Basel. 49. 3-28).
pancreatic necrosis virus via eyed eggs and sexual products of salmonid fish. In: Ellis,
and antibodies in Rainbow trout IPNV carrier (Salmo gairdneri). Journal Veterinarian
Veterinarias.
Babin, M., Hernndez, M., Sanchez, C. and Dominguez, J. (1991). Inmunodot assay
Biering, E., Melby, H. P. and Mortensen, S. H. (1997). Sero and genotyping of some
marine aquatic birnavirus isolates from Norway. Diseases of Aquatic Organisms. 28:
169-174.
Blake, S. L., Ma, J. Y., Caporale, D. A., Jairath, S. and Nicholson, B. L. (2001).
pancreatic necrosis (IPN) virus in South Africa. Bulletin of the European Association
Bustos, P., Midtlyng, P. and Maira, C. 1999. IPN: Un enorme desafo para la
Christie, K., Havarstein, L., Djupvik, H., Ness, S. and Endressen, C. (1988).
celulares. p: 93-111.
61
Cutrn, J. M., Barja, J. L., Nicholson, B. L., Bandn, I., Blake, S. and Dopazo, C. P.
approach for genotyping infectious pancreatic necrosis virus reference strains and
De Kinkelin, P., Michel. Ch. and Ghittino, P. (1991). Tratado de las enfermedades de
Dixon, P. and Hill, B. (1983b). Rapid detection of infectious pancreatic necrosis virus
Diagnostic Manual for Aquatic Animal Diseases. (O.I.E. 2003). Office International
Dobos, P. (1976). Size and structure of the genome of infectous pancreatic necrosis
Dobos, P., Hill, B. J., Hallet, R., Kells, D. T. C., Becht, H. and Teninges, D. (1979).
Dopazo, C., Hetrick, F. and Samal, S. (1994). Use of cloned cDNA probes for
diagnosis of infectious pancreatic necrosis virus. Journal of Fish Diseases. 17: 1-16.
Duncan, R., Nagy, E., Krell, P. J. and Dobos, P. (1987). Synthesis of the infectious
3655-3664.
necrosis virus (IPNV) dsRNA A segment reveals one large ORF encoding a precursor
Duncan, P., Mason, C., Nagy, E., Leong, J. and Dobos, P. (1991). Sequence analysis
of infectious pancreatic necrosis virus genome segment B and its encoded VP1
protein: a putative RNA dependent RNA Polymerase lacking the gly-asp-asp motif.
Virology. 181:541-552.
Espinoza, E., Farias, G., Soler, M. and Kuznar, J. (1985). Identy between infectious
pancreatic necrosis virus VR-299 and a Chilean isolate. Intervirology. 24: 58-60.
63
Fenner, F., Gibbs, E. P., Murphy, F., Rott, R., Studdert, M. and White, D. (1993).
Finlay, J. and Hill, B. J. (1975). The use of the complement fixation test for rapid
Fryer, J., Yusha, A. and Pilcher, K. (1965). The in vitro cultivation of tissue and cells
of pacific salmon and steelhead trout. Annual N.Y. Academic Science. 126: 566-586.
Hattori, M., Kokama, H., Ishiguro, S., Honda, A., Mikami, T. and Izawa, H. (1984). In
vitro and in vivo detection of infectious pancreatic necrosis virus in fish by enzyme-
1879.
64
necrosis virus: a comparison with other Birnaviridae. Journal of General Virology. 71:
299-308.
Havarstein, L. Endresen, C., Hjeltnes, B., Christie, K. and Glette, J. (1990). Specific
immunoglobulins in serum from Atlantic salmon (salmo salar), immunized with Vibrio
13(2): 101-111.
Heppell, J., Berthiaume, F., Corbin, F., Tarrab, E., Lecomte, J. and Arella, M. (1993).
Comparison of amino acid sequenced deduses from a cDNA fragment obtained form
195: 840-844.
Heppel, J., Berthiaume, L., Tarrab, E., Lecomte, J. and Arella, M. (1992). Evidence of
Hill, B. J. (1976). Procedures for the Isolation and Identification of IPN, VHS, IHN and
SVC Viruses from Diseased Fish. Fisheries Research Technical Report, N 27,
birnaviruses. In: Proceedings of the First Annual Meeting of the European Association
necrosis (IPN) virus: a comparison with other birnaviruses. Annual Review of Fish
Diseases. 5: 55-77.
necrosis (IPN) virus and other aquatic birnaviruses. Annual Review of Fish Diseases.
5: 55-77.
rainbow trout (Salmo gairdneri) in Denmark. Nordic Veterinarian Medicine. 21: 142-
148.
66
Kimura, T., Yoshimizu, M. and Yasuda, H. (1984). Rapid, simple serological diagnosis
Kuznar, J., Kirsinger, M. I., Cifuentes, F. and Everitt, E. (1999). Detection Infectious
Leong, J. C., Brown, D., Dobos, P., Kibenge, F. S. B., Ludert, J. E., Muller, H., Mundt,
Lee, M. K., Blake, S. L., Singer, J. T. and Nicholson, B. L. (1996). Genomic variation
McAllister, P. and Owens W. (1986). Infectious pancreatic necrosis virus: Protocol for
Magyar G. and Dobos P. (1994). Evidence for the detection of the infectious
pancreatic necrosis virus polyprotein and the 17 kDa polypeptide in infected cells and
the processing of infectious pancreatic necrosis virus polyprotein. Virology. 179: 9-15.
Mortensen, S., Hjeltnes, B., Rodseth, O., Krogsrud, J. and Christie, K. (1990).
Infectious pancreatic necrosis virus, serotype N1, isolated from Norwegian Halibut
Nagy, E., Duncan, R., Krell, P. J. and Dobos, P. (1987). Mapping of the large RNA
Atlantic salmon cell cultures infected with infectious pancreatic necrosis virus. Journal
16: 469-472.
Okamoto. N., Tayama, T., Kawanobe, M., Fujiki, N., Yasuda, Y. and Sano, T. (1993).
117: 71-76.
Post, G. (1983). Textbook of fish health. Ed. TFH Publications. Cap. VI, pgna. 94-100.
179.
necrosis (IPN) carrier state. PhD dissertation, University of Guelph, Guelph, Ontario.
(IPN) carrier state in salmonids and other species. Coastal and Estuarine Studies. 25:
331-343.
Roberts, R. (1989). Fish Pathology. Ed. Baillier Tindall, London, Inglaterra. Cap. 6,
infection in farmed halibut in the United Kingdom. Veterinary Record. 140: 401-402.
Rosenlund, B. (1977). Infectious pancreatic necrosis virus at the Willow Beach NFH,
Nevada, and in Rainbow trout stocked into adjacent lake mohove. Fish Health News.
6: 10-13.
Ross, K., Thomson, A., Melvin, W, and Munro, A. (1991). Sensitive confirmation of
Sano, T. (1995). Viruses and viral diseases of salmonids. Aquaculture. 132: 43-52.
Sanz, F. and Coll, J. (1992). Techniques for diagnosing viral diseases of Salmonid
Schlotfeldt, J. and Alderman, D. (1991). A practical guide for the fresh water fish
Pathologists. p. 11-12.
Swanson, R. (1981). Use of the indirect fluorescent antibody test to study the
virus from Tellina tenuis to infectious pancreatic necrosis virus. Journal of General
Wolf, K. (1988). Fish viruses and fish viral diseases. Cornell University Press. U.S.A.
pp: 115-157.
Woo, P. T. K. and Bruno, D. W. (1999). Fis Diseases and Disorders. CABI Publishing,