FUNDAMENTOS DE LA

ELECTROFORESIS
INTRODUCCIN

La electroforesis en gel es una tcnica molecular muy utilizada con la cual se

puede observar la concentracin e integridad del ADN (extrado o producto de
PCR), protenas y otras biomolculas. La electroforesis va a permitir la separacin
de molculas como protenas y cidos nucleicos a travs una matriz tamponada
de pH 8, la cual va a funcionar como un filtro o matriz molecular permitiendo
separar molculas en un campo elctrico, de acuerdo al tamao o peso molecular,
la carga neta y la estructura tridimensional que poseen. Por lo cual, molculas de
ADN de tamao diferente van a emigrar de forma distinta en un gel de
electroforesis; siendo la distancia recorrida por cada fragmento de ADN
inversamente proporcional al logaritmo de su peso molecular. Los materiales
usados como soporte son los polmeros como la agarosa o la poliacrilamida, papel
(celulosa), almidn y acetato de celulosa.

MARCO TERICO

Los cidos nucleicos (ADN, ARN) estn cargados negativamente debido a los
grupos fosfatos, por lo cual cuando se aplica una corriente elctrica a una matriz
de gel que contiene las muestras de cidos nucleicos que se encuentra en una
solucin a pH neutro o bsico, entonces los fragmentos de cidos nucleicos
migrarn hacia el polo positivo, nodo.

La separacin de los fragmentos de ADN por electroforesis se regula a travs de

la concentracin de agarosa (o poliacrilamida) en el gel y el voltaje aplicado
durante la corrida electrofortica; por lo tanto, los fragmentos de menor tamao
migran ms rpido hacia el nodo que aquellos de mayor tamao y el incremento
del voltaje aumenta proporcionalmente la velocidad de migracin de los
fragmentos en el gel.

La poliacrilamida es un soporte muy usado cuando se realiza una electroforesis de

muestras de cidos nucleicos debido a que es transparente, elstico, tienen una
porosidad controlable y permiten una buena visualizacin de las bandas durante
un tiempo prolongado. Los geles de poliacrilamida se forman por polimerizacin de
la acrilamida con la bisacrilamida. Estos geles suelen emplearse cuando los
fragmentos de ADN que van a ser visualizados son de bajo peso molecular
(menos de 1000 pares de base), mientras que para fragmentos de mayor peso
molecular se emplea los geles de agarosa.

El tamao del poro formado por el gel depende de la concentracin de los

acrilamida: a mayor concentracin, menor tamao del poro y se dificulta el
movimiento de los fragmentos a lo largo del gel permitiendo de esta manera
obtener una mayor resolucin en los fragmentos pequeo. Una desventaja que
posee la acrilamida sobre la agarosa es que es un compuesto txico pero su
poder de resolucin es mayor. Todas las molculas de ADN al tener carga
negativa van a migrar hacia el polo positivo pero al entrar en los polos del gel, las
molculas ms grandes van a tener un movimiento ms lento debido a su
dificultad para pasar entre los poros, mientras las molculas ms pequeas lo
hacen ms rpidamente y llegan antes al polo positivo.

Una electroforesis tpica consiste en preparar un gel de agarosa a una

determinada concentracin, mezclar las muestras que se van a analizar con un
colorante adecuado que va permitir el frente de corrida de la electroforesis, colocar
las muestras en el gel, realizar la corrida electrofortica y por ltimo, visualizar los
cidos nucleicos para lo cual se emplea un determinado colorante, puede ser Sybr
Green, Red gel y Bromuro de etidio.

La electroforesis en cidos nucleicos en geles de agarosa permite determinar el

peso molecular de los cidos nucleicos, para lo cual es necesario utilizar
marcadores de tamao molecular conocido y de esta manera de acuerdo a la
posicin del fragmento del ADN en el gel de agarosa poder calcular los pesos
moleculares de las muestras de ADN analizadas. Tambin permite analizar los
fragmentos de ADN cortados con enzimas de restriccin, aislar y recuperar
fragmentos de ADN purificados.

OBJETIVOS

Aprecia la tcnica de electroforesis en gel.

Comprende los conceptos que estn involucrados en la separacin de
cidos nucleicos en una corrida electrofortica.
Observa la muestra de ADN aislada de la prctica anterior.

MATERIALES USADOS

PROCEDIMIENTO

Muestra de ADN obtenida de la prctica anterior.

5 l Marcador de peso molecular.
1 Cmara de electroforesis y accesorios (peines, soporte, tabla niveladora,
etc).
 1 Fuente de poder.
Micropipetas para volmenes de 0,5 - 20 l.
4 juegos de guantes.
4 gradillas para tubos de 1,5 mL.
50 puntas para volmenes de 0,5 - 20 l.
40 ml de agarosa al 2 %.
1 L de Buffer Tris borato EDTA 1X (TBE) pH 8-8.3.
1,5 ml de Buffer carga para ADN.
40 l Colorante Sybr green
1 Transiluminador de luz UV.

PROCEDIMIENTO

Asegurarse de usar guantes durante la manipulacin de las muestras, los

reactivos y el equipo.
Preparar 50 ml de agarosa al 2% y adicionar 20 l de colorante Sybr green,
dejar polimerizar por 10 min aproximadamente. Sumergir el sistema
conteniendo los geles polimerizados en su tanque (cmara electrofortica)
con el buffer TBE 1X para ADN. Al momento de sumergir los geles en el
tanque, asegurarse que los pocillos del gel estn totalmente saturados de
buffer.
Sobre un pedazo de lmina extensible de parafilm, preparar una mezcla de
5 l ADN con 1l de buffer carga repartida en alcuotas de acuerdo al
nmero de muestras que se colocarn en los pocillos (considerar el uso de
un marcador de peso molecular estndar de ADN).
Con el uso de puntas de 20 l proceder a cargar cuidadosamente la
muestra en los pocillos del gel de agarosa evitando la contaminacin del
pocillo contiguo.
Finalizada la colocacin de las muestras ADN en los pocillos, cubrir el
tanque con la tapa y conectar los cables de los electrodos en la fuente de
poder. Encender la fuente de poder y proceder a seleccionar el voltaje
adecuado (puede estar comprendido entre 75 a 120 voltios).
Luego de seleccionar las condiciones de voltaje, iniciar el proceso de la
electroforesis. Durante el proceso se evidenciarn dos frentes de corrida de
diferente color y distancia de migracin. Ambos colores, azul oscuro y azul
claro corresponden a los colorantes azul de bromofenol y xilenecianol, que
conforman el buffer de la muestra. El xilenecianol en geles de agarosa al 2
% migra de manera similar a un fragmento de ADN de 160 pares de base
(pb), mientras que el azul de bromofenol a esta misma concentracin de
agarosa es equivalente a un fragmento de 45 pb.
 Transcurrido el tiempo de corrida de la electroforesis, proceder al
desmontaje del equipo empezando con la desconexin de los electrodos de
la fuente de poder, removiendo el sistema que contiene el gel de agarosa.
Remover el gel del soporte, para realizar este proceso se requiere tener
mucho cuidado, pues el gel es muy frgil y puede romperse con facilidad.
Desplazar el gel hacia el transiluminador para el revelado, encender el
equipo y verificar que este a una longitud de onda de 420 nm.
Dejar hasta que empiecen a aparecer las bandas y registrar el resultado
final.
Observar los resultados obtenidos y discutir.
 UNIVERSIDAD CIENTFICA DEL SUR
Facultad: Medicina Humana

LABORATORIO DE QUMICA

Curso : Biologa Celular y Molecular

Profesora: Jess Rojas Jaimes

INFORME DE PRCTICA

Practica N: 10

Ttulo : FUNDAMENTOS DE LA ELECTROFEROSIS

Integrantes:

Betsab Prez
Alina Quispe
Ciremi Yllaconza

Horario de Prcticas
Da : mircoles
Hora : 13:10pm 15:00pm

Fecha de Entrega : 07/06/2017

Lima-Per