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RASTOGI N. 1994.

Sensibilit extra-cellulaire et intracellulaire des mycobactries aux antibiotiques (Chapitre 38; In


"Manuel de Bactriologie Clinique", volume 2, 2me dition, J. Freney, F. Renaud, W. Hansen & C. Bollet (eds.),
Collection Option Bio, Elsevier, Paris, pp 947-975.
38
SENSI BI LITE EXRA.CELLULAI RE
ET|NTRA-CELLUL|RE
DES MYCOBACTERIES AUX ANTIBIOTIQUES
N Rastogi

Parmi les principaux micro-organismes responsables d'infections chez I'homme, deux


appartiennent au genre Mycobacterium'. M tuberculosis, responsable de la tuberculose
humaine er. M Leprae agent de la lpre. Toutes les mycobactries pathognes,
l'exception de M ulcerans, sont des pathognes intra-cellulaires. La lpre et la
tuberculose sont des infections chroniques de I'homme.
Selon I'OMS environ I I millions de personnes dans le monde souffrent de la lpre
ef 1,4 milliard sont exposes au risque de contracter cette maladie. En ce qui concerne
la tuberculose, l0 millions de nouveaux cas sont signals chaque anne avec une
mortalit de I'ordre de 3 millions. Les bactries appartenant au complexe M avium sont
des agents d'infections opportunistes retrouves de faon lective dans la pandmie de
SIDA. L'mergence du SIDA est responsable de profonds changements dans les aspects
pidmiologiques des maladies bactriennes : elle est en effet responsable d'un risque
accru de tuberculose et d'infections Mycobacterium avwn chez les sujets HIV
positifs. La tuberculose pulmonaire est un des marqueurs retenus pour le stade 3 du
SIDA, les mycobactrioses atypiques et la tuberculose extra-pulmonaire sont des
critres de passage au stade 4.
Si les mycobactries atypiques sont retrouves dans I'environnement (par exemple
I'eau et le sol), l'homme constitue le principal rservoir du bacille de la tuberculose. La
tuberculose progresse chaque anne. On estime qu'environ le tiers de la population du
globe est infect par le bacille tuberculeux ; la majorit des individus infects ne
dvelopperont pas la maladie tuberculeuse au cours de leur vie. Il y a chaque anne l0
millions de nouveaux cas de tuberculose dans le monde, chacun de ces patients devenant
susceptible de transmettre la maladie. Comme il est impossible I'heure actuelle la
fois d'arrter cette transmission aux sujets non infects et d'liminer les bacilles chez les
porteurs sains, il est vident que l'radication de la tuberculose est illusoire. Seule une
antibiothrapie efficace des sujets infects permet d'enrayer la dissmination de la
tuberculose.
La plupart des tests proposs pour la dtermination de la sensibilit aux antibiotiques
concerne les bactries extracellulaires et permet d'tablir CMI, CMB, et paramtres
pharmacocintiques de la molcule.
On value habituellement I'activit in vitro d'un antibiotique par son taux srique
aprs administration d'une dose unique, par sa demie-vie plasmatique, par son degr de
fixation aux protines, et par ses concentrations tissulaires.
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Figure l. Ultrastructure des mycobactries


A: coloration au rouge de ruthnium de M etvium montrant la couche externe (oL).
B: Coloration au rouge de ruthnium de M at,ium puis traitement la m-fluorophnylalanine.
La flche simple montre un dtachement de la couche. Les barres reprsentent l0 nm (74).

seulement les anisme, mais galement


son interactio e modifier la cioissance

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Constitution de la paroi des mycobactries

La plupart des substa pathognicit et la


virulence des mycob e plus, des tudes
rcentes ont montr acries atypiques
multirsistantes pouv s ayant un"'action
Sensibilit extra-cellulaire et intra-cellulaire des mycobactries aux antibiotiques 949

destructrice sur la paroi (87), et que la diffusion de l'antibiotique travers celle-ci


pouvait tre facilite par des transporteurs lipophiles (81,9l). Ces travaux ont montr
que le phnomne d'exclusion pouvait constituer un mcanisme important de rsistance
chez les mycobactries (25, 52, 80). Le dveloppement de chimiothrapies mieux
adaptes au traitement des infections mycobactriennes dpend donc d'une meilleure
comprhension de la structure molculaire et topologique de leur paroi.
La paroi des mycobactries est constitue de trois feuillets contenant une grande
quantit de lipides (environ 30 40 7o du poids total), une partie d'entre eux tant
faiblement lis, c'est--dire facilement extractibles par les solvants organiques, par
opposition aux lipides fortement lis qui ne peuvent tre extraits qu'aprs
saponification. La plupart des lipides biologiquement actifs est prsente dans la fraction
faiblement lie. La fraction fortement lie contient essentiellement des rsidus d'acides
mycoliques relis par des liaisons esters des molcules d'arabinose pour former une
structure appele arabinogalactane (4,5), qui consttue le squelette de la paroi
(mucopeptide arabinogalactane) (54). L'analyse chimique de la paroi aprs
saponification et limination des composants lipidiques montre qu'elle contient de
l'arabinose, du galactose, de I'acide muramique, de la glucosamine, de I'alanine, de
l'acide diaminopimlique et de I'acide glutamique (71).
La disposition des lipides faiblement lis sur le squelette tait mal connue avant les
travaux de Rastogi et al (19,80). A I'aide de colorations cytochimiques au rouge de
ruthnium, ces auteurs ont montr la prsence d'une couche externe de 10 12 nm
d'paisseur (figure lA) chez les 18 espces de mycobactries tudies. Il a t ensuite
dmontr que bien que la couche externe prsente une structure monocouche, elle se
comporte comme une double couche, en rejetant des substrats ou des antibiotiques (25,
80). L'inhibition spcifique de certains composs de surface amphiphiles composant
cette couche (par exemple, il est possible d'inhiber les glycopeptides lipidiques de
surface (mycosides C) de M avium par le m-fluorophnylalanine (26,81)) permet le
relargage de la couche externe dans le milieu environnant et sa rorganisation sous la

Figure Z. tude par cryodcapage/cryofracture de M avium.


A: Bactries traites pendant 5 h par 15 gg/ml de polymyxine E
B: Bactries traites par 0, 4 o/o d'alcool phnthylique pendant 5 h
C: Les couches de l'enveloppe cellulaire sont indiques par des flches. CWIF = face interne
de fracture de la paroi, C\MOF = face externe de la fracture, PF = face protoplasmique.
Remarquer en C I'organisation en couches successives de la paroi. Les barres reprsentent
100 nm (6,74).
950 N RASTO(I

forme d'une bicouche (figure lB). Par analyse en microscopie lectronique de M at,iunt
ayant subi des extractions chimiques (25), un modle d'enveloppe cellulaire a t
propos, dans lequel la couche externe est spare de f'aon nette du peptidoglycane
basa par une couche transparente aux lectrons. Analogue la rgion d'interction
lipide-lipide de la membrane cytoplasmique, cette couche constituerait une zone
d'interaction entre les acides mycoliques et les fractions lipidiques des rsidus
amphiphies f'ormant Ia couche externe (25).
Des tudes sur l'interaction entre les mycobactries et les macrophages ont dmontr
que es mycobactries intracellulaires sont entoures par une structure capsulaire de 70
100 nm d'paisseur (35, 36), qui a pour fonction de protger les mycobactries contre
les mcanismes de dfense de I'hte (73,11). Rcemmenr Rastogi et at (88) onr isol les
fiactions subcellulaires antigniques correspondant la couche externe et la structure
capsulaire de M ttviLtnt. Elles sont lies au reste de la paroi bactrienne par interaction
lipide-lipide (Figure 2A). Des tudes par cryodcapage/cryofracture conhrmenr que la
paroi des mycobactries est organise en couches successives (figures 28 et2C) .
Un modle schmatique de la paroi est reprsent dans la figure 3. Dans ce modle,
la structure capsulaire est reprsente comme une protrusion de rsidus de sucres
longues chanes amphiphiles (ex : lipoarabinomannane, lipooligosaccharides, etc...) lis
par leur extrmit acide gras la couche transparente aux lectrons. Ce modle fit suite
celui propos prcdemment par Minnikin (64), qui comprenait un arrangement
multicouche de I'enveloppe cellulaire mycobactrienne, ce qui permettait une aalogie
structurale partielle avec la double membrane des bacilles Gram ngatif. Nikaido et
Jarlier (67) ont montr rcemment que la diffraction des rayons X de parois purifies de
mycobactries produisait une rflexion 0, 42 nm correspondant bien au modle de
double couche lipidique.

Mcanismes de survie intracellulaire des mycobactries

Les fonctions antimicrobiennes, ainsi que les mcanismes de dfense de la bactrie,


varient en fo on intrace ctries phagocytes
(phagosome, roplasme) rries, qui .soni des
pathognes int lt de se d rieur des phagosomes
ou des phagol principaux survie inracllulaire
des mycobactries pathognes est leur capacit d'inhiber la fusion des phagosomes avec
les lysosomes. Ce mcanisme a pu tre observ avec M tuberculosis (3), M ay,iunt (35,
36,13,77) et M leprae (78). Dans le cas de bacilles tuberculeux, cette proprit a t
attribue aux sulfolipides bactriens (41).
Outre cette aptitude d'inhiber la fusion des phagosomes et des lysosomes dans les

illustres dans Ia figure 4.


outre les mcanismes rapports prcdemment, des pertubations d'endo- et
d'exocytose de macrophages infects par des mycobactries ont t rcemment
rapports, comme par exemple I'inhibition de fusion de pinosomes avec des
phagosomes et des phagolysosomes chez les cellules infectes par M avium (35), ou le
Sensibilit extra-cellulaire er inlra-cellulaire des mycobactries anc antibiotiques 951

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Figure 3. Vue schmatique de I'organisation gnrale
de la paroi des mycobactries.

CM: membrane cytoplasmique, IL: couche interne, OL: couche externe, CWS: squelette de la
paroi, AG: arabinogalactane, PG: peptidoglycane, ETL: couche transparente aux lectrons,
CAP: capsule, TDM: trhalose dimycolate, SL: sulfolipide, LOS: lipooligosaccharide, PGL:
phnolglycolipide, PIM: phospholipide (74 et 88).
transfert retard d'antignes bactriens des phagosomes d'autres compartiments
intracellulaires et la surface du macrophage dans le cas de M avium (30) et de M
leprae (76). Ceci peut tre d en partie aux antignes capsulaires mycobactriens non
dgradables. Les phnolglycolipides-I (PGL-I) de M leprae non seulement inhibent la
rponse lymphoprolifrative chez I'homme (34), mais inhibent galement I'aptitude des
macrophages humains tuer des souches de Staphylococcus aureus recouvertes de
PGL-I (66). Certaines mycobactries pathognes sont relativement rsistantes aux
systmes de destruction oxydative ('/1). Les tudes d'immunomodulation des
macrophages cultivs in vitro n'ont pas permis de dsigner les mdiateurs responsables
de la mort intracellulaire des mycobactries (13,77).
952 N RASTOGI

Evoluolion de lo sensibilil des mycoboctries oux


ontiluberculeux

Le complexe M tuberculosis

La rsistance intrinsque observe chez M fuberculosis est le reflet de mutations


spontanes. De ce fait, la prescription d'au moins deux antituberculeux actifs est
ncessaire pour viter l'apparition des rsistances. Comme cela a t prcdemment
soulign (12), l'association d'antituberculeux ne sera elicace que si la frquence de
rsistance de chacun d'entre eux utilis seul est infrieure l7c pour la ritmpicine, la
streptomycine, l'thambutol et l'acide para-aminosalicylique et de moins de 10 7c pour
la pyrazinamide ainsi que pour les autres antituberculeux. la suite des observations de
Canetti et al (12), un seuil de 17o est habituellement appliqu lors de l'tude in t,itro de
M tubercLtlosis. Si plus de lVo des mycobactries sont rsistantes avant traitement, il
s'agira d'une rsistance primaire. Si une augmentation de la rsistance est observe
aprs le dbut du traitement, elle sera considre comme rsistance secondaire.
Avant de dterminer la sensibilit ou la rsistance aux antituberculeux de la bactrie,
tape qui ncessite environ 3 4 semaines, l'isolement de celle-ci partir des
prlvements cliniques est indispensable. La dure de I'ensemble est donc de l'ordre de
4 8 semaines lorsque I'on utilise les mthodes classiques. De nouvelles approches ont
cependant rvolutionn cet aspect ces dernires annes. Comme cela a t soulign par
Roberts et aL (98), La mycobactriologie clinique a beaucoup plus chang durant les
"
l0 dernires annes que dans toute son histoire. Un des vnements responsable de ce
regain d'intrt est le dveloppement de systmes de dtection radiomtrique des
mycobactries permettant de sparer M tuberculo.is des autres mycobactries mais
galement de dterminer leur sensibilit aux antimicrobiens (en particulier pour
M tuberculosi.s)>. ces auteurs font allusion au systme Bactec 460-T8 de Becton-
Dickinson qui utilise la capacit des mycobactries de se dvelopper en milieu de
Middlebrook 7Hl2 contenant de 'acide palmitique marqu au carbone 14. L'activit
catabolique de la bactrie permet la libration de laC-COz qui est dtect par I'automate
(l0l). Cette mthode est utilise en routine pour l'isolement des mycobactries de
prlvements cliniques (97). pour la sparation des mycobactries appartenant au
complexe M tuberculosi.r des autres mycobactries (inhibition slective par le NAP
(para-nitro-cr-actyl-amino--hydroxypropiophnone ; 59), pour I'identification
prsomptive de M tubercuLosis en utilisant des inhibiteurs spcifiques (40), ainsi que
pour I'identification de M tubercuLosis, M ctt,iuttt, M intracelLttlare, M ktnsasii et
M gordonae par sondes ADN hybridant avec des squences d'ARN ribosomal (70).
La sensibilit in t'itro de M tuberculo.i. est tudie en routine I'aide de mthodes
directes ou indirectes. Dans le cas des tests directs, les homognisats de crachats ou
d'autres prlvements biologiques sont cultivs directement sur des milieux contenant
I'antituberculeux, alors que dans le cas d'un test indirect, la bactrie provenant du
produit biologique est tout d'abord cultive et isole avanI son talement sur des milieux
contenanl l'antibiotique. Les mthodes utilises (c'est--dire mthode des proportions,
radiomtrie, concentration absolue et ratio de rsistance) sont dtailles par ailleurs (49,
62) et ne seront que brivement dcrites ici.
SensibiLit crtra-c'ellulaire et inta-cellulctire des nty'cobttc'trics aux uttibiotit1ues 953

I-a nutlrcde des proportiorts

La mthode des proportions consiste rpartir des quantits gales d'inocuum bactrien
sur des milieux contenant les antibiotiques tester, en incluant des contrles. La
proportion de bactries rsistantes une concentration donne est dtermine en
comparant le nombre de bactries viables qui se sont dveloppes celui obtenu sur les
botes de contrle. Les concentrations critiques retenues varient selon les milieux
utiliss (tableau l). Pour des raisons pratiques, les bactries isoles sur des milieux
solides sont prleves, homognises en eau distille strile (avec des billes de venes
par exemple) et la densit de la suspension bactrienne ajuste environ I mg/ml
(absorbance de 0, l5 0, 2 650 nm). Les suspensions bactriennes sont ensuite dilues
en cascade jusqu' l0-5. On ensemence 0, I ml des dilutions l0-2, 10-4 et l0--s sur des
milieux de contrle tandis que 0, I ml des dilutions l0-2 et l0-4 est rpani en parallle
sur les milieux contenant des concentrations critiques des antibiotiques tester. En
utilisant Ie critre de proportion de llo, les isolements cliniques de bacilles tuberculeux
sont considrs comme sensibles l'antibiotique si leur concentration critique permet
une rduction effective de la population bactrienne d'au moins 99 o/o par rapport au
contrle.

Tableau I. Concentrations critiques (rglml) des antibiotiques en milieux 7H10,


7H11, Lwenstein-Jensen (LJ), et Bactec 7Hl2 (d'aprs 75).

Antibiotiquea 7H1 0 7H1 1 LJ Bactec Proporlion critique

INH 0, 2 0,2 ^t 0, 1 1o
PAS 2, 0 8,0 0,5 1o/o
sl\4 0 2,0 4, 0 2,0 1o/o
RIF 1, 0 1,0 40, 0 2,0 t/o
EMB 5, 0 AE t 2,5 1o/o

ETH 5, U 100 20,0 5,0 1o/o (1 0% pour LJ)


10t
KM 5, 0 6,0 20,0 5,0 (10% pour LJ)
D-CS 20 0 300 30, 0 50, 0 1o/o (10% pour LJ)
PZA 50 0 500 100,0 100,0 1o/o(10Io pour LJ et Bactec)

a INH isoniazide, PAS = acide p-aminosalicylique, SM = streptomycine, RlF=rifampicine,


=
EMB=thambutol, ETH = thionamide, KM = kanamycine, D-CS = D-cyclosrine, PZA =
pyrazinamide.

Mtlrcde radiomtrique

Elle utilise le systme Bactec 460-TB (101). Les micro-organismes mtabolisent l'acide
palmtique marqu au carbone l4 en bouillon de Middlebrook 7H12. La croissance
bactrienne, mesure quotidiennement, est fonction de la libration du l4C-CO1 captur
par un dtecteur et exprime en indice de croissance (<< growth index >r ou GI), variant
de I 999. Un flacon contenant 4 ml de bouillon est inocul avec 0, I ml de suspension
bactrienne I mg/ml. Lorsque le GI atteint une valeur de 500, cette culture primaire est
utilise comme inoculum pour les tests de sensibilit aux anti-tuberculeux. Lorsqu'il est
possible d'obtenir une culture sur milieu solide, la culture primaire en bouillon Bactec
peut tre supprime, la prparation de la suspension bactrienne homognise est alors
ajuste au point I de l'chelle de McFarland. Pour dterminer Ia sensibilit, 0, I ml de
I'inoculum prcdent est inject directement dans les ampoules contenant les diffrents
antibiotiques. Les GI sont compars celui de I'ampoule contrle qui est inocule avec
0, 1 ml d'une dilution au l/100 de I'inoculum de dpart. Quand le GI du contrle au
954 N RASTOGI

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Figure 4. Inhibition de la fusion phagolysosomiare dans les macrophages


humains infects par M aviurn.

A: Macrophage priphrique u temps 0. Les lysosomes sont marqus I'aide de


phosphatase acide ou AcP (simple flche).
B: Immdiatement aprs phagocytose de M at,iunt. Les phagosomes contiennent de I 5
bacilles. Les bactries intactes sont encapsules. c'est--dire entoure d'une zone
transparente aux lectrons (montre pr une double flche) qui vite le contact entre la paro
bactrienne et a membrane du phagosome.
C: Multiplication intracellulaire de M at,ium aprs 4 jours.
D: 7 jours aprs I'infction, une ihnibition marque de la fusion phagolysosomiale persiste.
Les barres reprsentent 100 nm.
Sensibilit extra-cellulaire et intra-cellulaire des mycrbactries aux antibiotiques 955

l/100 atteint 30 ou plus, les rsultats sont interprts de la faon suivante: si la


diffrence de GI par rapport au jour prcdent (appele aGI) dans le cas des flacons
contenant les antituberculeux est infrieure au AGI du contrle dilu au l/100, les
bactries seront considres comme sensibles ; s'il est suprieur au AGI de contrle les
bactries seront considres comme rsistantes. Avec le systme Bactec, une souche
sera dite sensible si la concentration critique de I'antibiotique permet une rduction de la
croissance bactrienne de99 o/o ou plus pa-rrapport au flacon de contrle. Dans le cas de
la pyrazinamide, teste pH 6, la souche sera considre comme sensible si on obtient
une diminution de croissance de 90o/o par rapport au contrle.
Il existe une bonne corrlation entre la mthode des proportions sur milieu
Lwenstein-Jensen ou sur les milieux gloss 7H10 et 7H1l de Middlebrook et la
mthode radiomrrique Bacrec (86, 91, 101, 102).

M thode de s c o nc e ntrations abs olue s

Dans cette mthode, une anse d'inoculum bactrien contenant 2x103 Ix104 UFC est
rpartie la fois sur un contrle Lwenstein-Jensen sans antibiotique et sur un milieu
contenant des antituberculeux (12). Pour I'interprtation, un contrle d'une souche
sauvage est ralis en parallle avec des concentrations critiques prdfinies des
antibiotiques (par exemple 0, 2 tg/ml pour I'isoniazide, 5 rg/ml pour la streptomycine,
0,5 rg/ml pour l'acide p-aminosalicylique et 20 rg/ml pour l'thionamide). La
rsistance correspond une croissance de plus de 20 colonies en prsence de
I' anti tubercul eux (49, 62).

Mthode des ratios

La mthodologie suivie dans ce cas est sensiblement la mme que celle prcdemment
dcrite. La diffrence essentielle est la suivante : dans la mthode des ratios, une srie de
tubes contenant les antituberculeux est inocule avec la souche standard de
M tuberculosis H37Rv. Les rsultats sont exprims en ratios des CMI de la souche test
compars au contrle H37Rv, ce qui permet d'viter les variations tenant aux milieux
utiliss. Une souche prsentant un ratio de rsistance infrieur ou gal 2 est considre
comme sensible, tandis qu'elle sera considre comme rsistante si le ratio est suprieur
4 (49,62).

Tableau II. Caractristiques de diffrents antibiotiques: CMI et concentrations


critiques en milieu 7H11, concentrations bactricides sur macrophages (m), et
Cmax (d'aprs 75).

Ant b ot que CMI en Concenlration Concentration Concentration C max ela e/b elc e/d
7H11 (a) critque critique bactricide (e)
7H11 (b) Batec (c) m (d)

INH 0, 1 0,2 0,2 0, 05 7,0 70 35 35 140


RIF 0,5 1,0 2 5 15 30 15 7,5 .,
PZ 20 50 100 25 45 2 <1 <1 2
EMB 5 7,5 2,5 5 1 <1 2
ETH 2,5 10 5 0,5 20 8 2 4 40
SM I 2 2 30 50 6 25 25 2

a Les concentrations sont en


rglml
956 N RASTOCI

Mycobactries autres que celles appartenant au complexe M tuberculosis


(MAMT)

Les MAMT comprennent des mycobactries croissance rapide (capables de produire


des colonies visibles aprs moins de 7 jours sur milieu glos), et des mycobactries
croissance lente, ncessitant des temps d'incubation plus longs. Les principales MAMT
associes des infections chez l'homme sont M chelonei et M Jbrtuitunl (croissance
rapide) (ll3) et M aviunt, M xenopi, M marinunt, M ntaLntoense, M ulcerans, M
kansasii, M s:.ulgai et M sintiae (croissance lente).

Se nsib ilit au x a nt ibiotiq u e s

Dans le cas de M tuberculosis,l'exprience montre qu'il existe une bonne corrlation


entre les rsultats obtenus ittvitro et l'efficacit clinique. En revanche, il est bien connu
que de nombreuses mycobactries atypiques prsentent une rsistance in vitro la
plupart des antibiotiques utiliss dans le traitement de la tuberculose (l l3). Bien que
I'efficacit des traitements ne soit pas facile valuer, il est gnralement admis que la
plupart des infections causes par les MAMT ( I'exception de M kansasii) ne rpond
pas la chimiothrapie seule (2,32, 117) bien que la plupart des isolements cliniques se
soit rvle sensible in vitro un ou plusieurs des antibiotiques tests.
L'Antericatt Thorctcic Society (2) considre que dans les cas de M marinum,
M fortuitum, M chelonei ainsi que pour les mycobactries appartenant au complexe
M aviLtm, Ies tests de sensibilit aux agents antituberculeux dvelopps pour
M tubercuLosis (l I, l2) ne sont pas adapts l'tude de ces bactries et devraient tre
vits.
Les rsultats des tests de sensibilit de l3 antibiotiques pour 552 isolements
cliniques de MAMT appartenant l2 espces diffrentes ont t rcemment analyss
dans notre laboratoire, Ces rsultats ont t obtenus par la mthode des proportions sur
milieu glos 7H1l avec les concentrations critiques utilises pour M tuberculo,sis
(tableau I). La proportion de souches rsistantes est reprsente figure 5. Cette tude
montre que :

Contrairement au clofazimine et la D-cyclosrine qui prsentent un large


- d'action ( I'exception de M fortuitum
spectre eI- M chelonei qui sont rsistantes aux
deux drogues et de M s:ulgai et des bactries du complexe M terrae qui sont rsistantes
la D-cyclosrine), toutes les espces testes sont rsistantes I'isoniazide et la
pyrazinamide. Sur la base d'un ordre dcroissant de leur spectre anti-MAMT, les autres
drogues peuvent tre classes ainsi:thionamide > ansamycine (=iSutine) >
rifampicine > capromycine> kanamycine > streptomycine > thambutol.
Le spectre d'activit des fluoroquinolones comme la ciprofloxacine et
-
l'ofloxacine est essentiellement limit M xenopi, M gordonae et M fortuitum
(M kansasii et M gastri sont sensibles uniquement I'ofloxacine).
En ce qui concerne le spectre d'activit, si on prend comme seuil la sensibilit de
-

Parmi les souc es M chelonei et M fortuilrn semblent


prse.nter un int ne ( t l3). Dans ces cas, les agents
antimicrobiens qui tests ir? uilrz comprennent la cfoiitine,
Scnsibilit axtrt-caLlulait'a ct intru-ccllLtluire tlcs n.t\'(ob(K.trics eux untibiotqucs 951

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Figure 5. Sensibilit aux antibiotiques des mycobactries atypiques.

Pout'centage de souches rsistantes parmi les I 2 espces de mycobactries atypiques (n=552)


testes en utiisant la mthode de proportion : I Vc et concentrations critiques de M
tuberculosis. INH = isoniazide, RIF = rifirmpicine, EMB = thambutol, ETH = thionamide,
PZA = pyrztnamide, ANS = ansamycine ou rifbutine, SM = stleptomycine, D-CS=D-
cyclosrine, CLOFA = clofzimine, CIPRO = ciprofloxacine, OFLO = ofloxacine, KANA =
kanamycine, CAPREO = capromycine.
958 N RASTOGI

la tobramycine, la doxycy-cline, la minocycline, l'rythromycine, le sulfamthoxazole, la


capromycine, la ciprofloxacine et l'floxacine (+s). Comme cela a t rapport
prcdemment, du fait du large spectre de rsistance de ces micro-organism aux
antituberculeux de premire et deuxime intention ( I'exception de I'amiacine et de la
kanamycine ; lll), ils n_e- devraient pa_s tre tests. On peut utiliser les techniques de
dilution e.n aga{, la.mthode de diffusion utilisant des disques imprgns' ou la
microdilution en bouillon (49).
Comme quelques souches ou biovars peuvent tre producteurs de -lactamases (65),
il.- peuts'avrer intressant d'valuer les associations contenant une -lactamine et un
inhibiteur de -lactamase co^mme I'augmentin (amoxicilline + acide clavulanique) et des
antibioliques rsistant aux -lactamass comme I'imipenem. L'action des -lactamines
contre les mvcobactries aviaires extra- et,intra-cill,]lin,:i
:i:.r:ffil:itrr;

Autres mthodes des dtermination de la sensibilit et critres d'interprtatiott

Evoluotion ntro-celluloire de lo sensbrt oux ontbioliques

Rappels

La concentration des antibiotiques dans le srum peut tre un critre intressant. Mais,
lorsqu'elles sont disponibles, les concentrations dns les tissus et dans les
-uctopt'ug"i
sensibilit extra-cellulaire et intra-cellulaire des mycobactres aux ctntibiotiques 959

clarithromycine chez les patients infects par M aviunt (19), puisque l'antibiotique est
plus actif in vitro ( pH 7,a) qu' pH acide (46).

antimycobactrienne des antibiotiques, ainsi que I'activit immunomodulatrice de


certains de ces antibiotiques par eux mmes (par exemple la clofazimine, ll2) ont t
jusqu' prsent ngliges.

Etude des mocrophoges in vitro

L'efficacit intra-cellulaire des antibiotiques antimycobactriens a t tudie sur


modle animal (souris, 31,31 ,50), sur lignes cellulaires maintenues in vitro (89,93,
120) ou sur macrophages cultivs (15, 16, 17,90). Les donnes des tudes chez l'animal
960 N RASTOGI

permettant la dtermination des CMI intra-cellulaires (16, l7), soit des concenrrations
quivalentes au niveau cmax connu chez I'homme (89, 90, 92, 93). Dans e premier cas
Tn9-.comparaison des CMI intra-cellulaires et extra-cellulaires permef d'vauer
I'efficacit intra-cellulaire de I'antibiotique. Dans le second cas, l'efficacit intra-
cellulaire note en termes de survivants la Cmax est compare soit I'efficacit extra-
cellulaire du mme antibiotique, soit en la comparan[ ses cMI et CMB intra-
cellulaires.

Corrlation entre activit intra-cellulaire et extra-cellulaire des antibiotiques.

La dtermination de I'efficacit intra-cellulaire et extra-cellulaire d'un antibiotique en


comparant les donnes exprimentales reste un problme en mycobactriologie de
routine, surtout si ces donnes ont t obtsnues par diffrentes apprches
exprimentales. Une faon de rsoudre ce problme est mntre en figure 6. Cite figure
montre les activits extra-cellulaires et intra-cellulaires des niveaux Cmax d la
clarithromycine, de l'thambutol, de la rifampicine utiliss seuls ou en association
contre la souche-type de M av'ium (89). Dans ce cas les activits extra-cellulaires ont t
mesures en utilisant soit le bouillonlHg, s s
7H12, alors que I'activit intra-cellulaire a e
inoculum (1X10s UFC) a r ajour au d a
t suivie durant 5 jours aprs addition de s
par dnombrement des bactries viables et exprims en chelle logarithmique en
assignant I'inoculum initial la valeur l. Le contrle montr sur la parlie gauch de la
figure 6 montre la croissance aprs 5 jours d'incubation 37"C, alori que ls barres sur
le cot droit montrent les effets bactricides relatifs aux antibiotiques tudis. partir
des rsultats montrs en figure 6, on peut conclure que :
la fois la croissarice bactrinne et l'action bactricide des antibiotiques ont t
plus- prononces sur bouillon 7H9 que sur bouilon 7Hl2 (mthode radiomtrique) et
que sur les cellules J-774.
. ^- ll clarithromycine utilise sa CMI de 2 t"glml est aussi bactricide que la
rifampicine utilise sa Cmax de l5 pg/ml.
L'ajout d'thambutol aux antibiotiques augmente leur activit bactricide.
-
L'association thambutol + rifampicine + clarithromycine est la plus efficace.
Les observations ci-dessus montrent qu'une activit bactriCide plus importante des
antibiotiques, en dehors de leur activit bactricide propre, p e
une croissance plus forte des micro-organismes. De plus,-l la
fois le transport des acides mycoliques (107) et la synthse ns
I'env,eloppe de la cellule mycobactrienne (105) avec dsorganisation complte de la
couche externe (87) est capable de rompre la permabilit e la barrire situe dans
I'enveloppe cellulaire de M avium. Les activits intra-cellulaires de la sparfloxacine en
association avec d'autres antibiotiques (dont l'thambutol) contre 4 souches de M avium
c.ultives sur macrophages humains ou murins sont montres respectivemenI en
figure 7a et 7b (90).
Sensibilit extra-cellulaire et intra-cellulaire des mvcobactries aux antibiotiques 961

Tableau III. Taux de mutationa et frquence des mutantsb chez Mycobacterium


tuberculo sis (d'aprs 20).

Antibiolique (pg/ml) Taux de mutation Frquence des mutants

rNH (0.2) 1 84 x 10-8 3 50 x 1


g-6
(1, 0) 1 70 x 10-8 3 10 x 1
g-6
sM (2,0) 2 90 x 10-8 3 80 x 1
g-6
RrF (1, 0) 2,20 x 10-10 1 20 x 1
g-8
EMB (5,0) 1 00 x 10-7 3 10 X 1
g-s

a Probablt de mutation/bactrie/gnrarion.
b Proportion de mutants observe ans Ia population.

Il est intressant de noter que des essais i? vitro en utilisant un calcul radiomtrique
des quotients x/y (8 1, 87,89,90) ont montr la capacit de l'thambutol augmenter
f 'activit contre M aviunt des autres antibiotiques. Dans cette mthode des
concentrations sublthales de deux antibiotiques sont testes seules ou en combinaison
contre une souche, x reprsente I'index de croissance Bactec obtenu avec I'association
des antibiotiques, Y reprsente I'index de croissance minimum obtenu avec les
antibiotiques utiliss seuls. Un quotient x/y infrieur 0,5 indique une action renforce,
un quotient x/y de I montre une absence d'interaction entre les deux, un quotient x/y
suprieur 2 montre un antagonisme. Cette mthode d'vauation in vitro des

des rsultats obtenus itt vitro avec l'efficacit in yivo chez I'homme est encore mal
VIABLE couNts
r02 to' to-2

Figure 6. Corrlation entre les activits intra-cellulaire et intra-cellulaires contre


M avium de la clarithromycine (CLA), de l'thambutol (EMB) et de la rifampicine
(RIF) seuls et en association.
Les antibiotiques sont utiliss leur Cmax (2 tglml pour CLA, 6 rg/ml pour EMB et l5
pg/ml pour RIF). En clair : bouillon 7H9 ; en pointills : bouillon 7Hl2;Bactec, en hachur
macrophages J-774. (Inoculum : I x l0s UFC/ml) (d'aprs 89).
962 N RASTOCI

connue. Dans le cas de M tuberculo.lis, qui rpond bien la chimiothrapie, les


antibiotiques bactricides ont par rapport aux autres antituberculeux de premire
intention, des CMI plus basses, des concentrations critiques et des concentrations
bactricides intra-cellulair lorsque ces mpares leur
niveau Cmax. Il faut rapp I'exception ide qui agit de
manire synergique avec s de dfense ptus traui. Le
tableau II montre les CMI tilisant le mi et la mthode
Bactec, les concentrations critiques en utilisant le milieu 7H1 I solide par la mthode des
proportions, la concentration bactricide chez les macrophages infects
exprimentalement, ainsi que les niveaux Cmax rapports chez I'homme.

Mconismes d'oction des ontibiotiques onlituberculeux et


mconismes de rsistonce chez M tubercurosrb

La transmission de bacill
essais de chimiothrapie
but d'en vauer les effets
t trs tt organiss dans
Unis et en France. Dans ces deux pays le risque annuel de tuberculose due des bacilles
tuberculeux rsistants est rest bas (la figure 8 montre les chiffres concernant la France),
mais il est vident que des incidences plus leves peuvent tre observes dans des

Considrations prliminaires.

On considre habituellement que les cibles des agents antituberculeux sont atteintes et
inhibes pour des concentrations en antituberculeux correspondant aux posologies
utilises en clinique. Dans les laboratoires cliniques, les antituberculeux sont iests es
concentrations prdtermines montres dans le tableau I. Cependant les antituberculeux

La rsistance aux antituberculeux rsulte apparemment exclusivement de mutations


spontanes. Les mutants spontans tirent un avantage slectif de leur mutation. Les
VIABLE COUNrS C
couNts
@ 2 vtAa LE

)
d
a)

s
^i

al

s
t t


E arcc ts79
f
D fcc 1s7e N r.or.r.90-12s3
N ,so,r. s-12s3 Lrf= t.or!t. eo-12s7
El,so,r r. eo-r257 t.ot!t.9o-1205
Nt,so,,e go-129s o

Figure 7. Activit bactricide de la sparfloxacine utilise seule et en association contre M avium


se dveloppant dans les macrophages d'origine humaine et murine.
Sparfloxacine (SPAR), clarithlomycine (CLA), amikacine (AMIK), rifampicine (RIF), thambutol (EMB). A : macrophages murins,
B : macrophages humains. Les antibiotiques sont utiliss leur Cmax : (1,5 gg/ml pour SPAR, 2 tglml poul CLA, 20 llml pour
AMIK, l5 rglml pour RIF, 6 rg/ml pour EMB. Inoculum :2 x l}s 1 x 106 UFC/ml (d'aprs 90). o\
(J)
964 N RASTOGI

mutations et I'augmentation de frquence de ces mutations par slection ont t tudies


en utilisant les techniques d'analyse de population, la fois dans les conditions de
laboratoire et dans des tudes cliniques. En raison de son temps de division long (de l6
24 h), la slection de mutants rsistants chez les baciles iuberculeux est lente. par
exemple la slection d'une population complte de mutants rsistants I'INH (slection
d'une population compose de 100 o/c de baciles rsistants) requiert au moins 24 mois
de traitement ( l0).
Bien que le degr de slection des mutants puisse varier suivant les conditions

Antibiotiques les plus connus

Izoniazide (INH)

Comme I'INH peut ragir avec les porphyrines lies au fer dans les conditions
Sensibilit extra-cellulaire et intra-cellulaire des mycobactries aux antibiotiques 965

Tableau IV. Modes d'action de certains antibiotiques moins tudis (d'aprs 27).

Antibiotique (a) sne d'aclion Aulres slles Especes commentaires


principal documentes
ETH lnhtbttton de la Perte de I'acrdo- M tuberculosts Mal connu
synthse des acides alcoolo-
mycoliques rsistance, ne
ncessite pas le
systme
catalase-
proxydase,
interfrence avec
le mtabolisme
des sucres
PA lnconnu Bactencrde en M tuberculosts Actrvailon
milieu acide intra-cellulaire ?

SM Liaison la Altration de la M tuberculoss, Mal connu


sousunit 30S du structure M lriburgensis
ribosome membranaire, (= M smegmatis)
inhibition de la
synthse des
orotines
PAS lnhibition de la lnhibition de M tuberculosis, Les mycobactines
synthse des folates, l'activit M smegmatis, sonl des
inhibition de la respiratoire par M avium,BCG sidrophores,
synthse de la comptition avec certains contiennent
mycobactine les acides des composs
benzoique el salicyls
salicylique,
accumulation de
purines
OLF Se lre a la M smegmails Mal connu
guanrne
Tb1 lnconnu
KAN lnconnu lnhbe la
synthse des
orotines
VM Lraison a la sous- lnhtbe la M smegmatis Mal connu
unit 30S du synthse des
ribosome orotines
UAP lnconnlr
OFL, CIP lnconnu lnhibe la M smegmatis lnhibiteur de la
replication de DNA gyrase des
I'ADN procaryotes

(a): ETH = thionamide, PZA - pyrazinamide, SM = streptomycine, PAS = acide


p-aminosalicylique, CLF = clofazimine, Tbl = thiactazone, KAN = kanamycine, VM =
viomycin, CAP = capromycine, OFL = ofloxacine, CIP = ciprofloxacine.
physiologiques, une autre explication est une interfrence avec le systme catalase-
proxydase (57). Les tentatives d'expliquer ainsi I'action de I'INH sont nes de
I'observation que les bacilles rsistants I'INH sont souvent catalase ngatives (63) :
pratiquement toutes les souches rsistant 50 rg/ml d'INH sont catalase ngatives
(fig 9). Dans notre exprience, moins de 20 o/o des
souches INH-rsistantes ont une CMI
gale ou suprieure 50 rg/ml et sont catalase ngatives, le reste tant catalase positives
avec des CMI allant de 0,2 5 .rglml.
966 N RASTOGI

5
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o)
4
L
(tr

n
cn 3
\ oJr
t
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o) 2
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U
o
U)

o
1 978-84 1986 1987 1988 1989 1990 1991

Anne
8.
Figure e entre l97g et
1991 teur, paris.
Symboles : (O) rsistance
INH + RIF
SansibiLit e-ytra-calLuLaira ct inlrGCcllulairc tles mycobuclries aux antibbtiques 961

bactries transformes, 123) suggre que I'enzyme peut participer au relargage de


l'antibiotique ainsi que cela a t propos par ailleurs (38). C'est une hypothse
intressante car les mutations affectant le transport sont habituellement l'origine de
niveaux levs de rsistance. Il tudrait cependant pouvoir dmontrer que le clonage de
kutG chez les bacilles tuberculeux rsistants observs en clinique (0,2 5 rg/ml)
restaure leur sensibilit.
Le systme catalase-proxydase pourrait modifier I'lNH pour former un driv
biologiquement actif, qui pourrait tre reli l'accumulation d'un pigment jaune chez
les bactries exposes l'lNH (ll9). Bien que la biotransformation de I'INH et
l'accumulation du < pigment de Youatt > se produise entre I et 2 heures aprs
exposition l'lNH, ces observations dpendent du milieu utilis, et ncessitent des
concentrations leves d'INH (autour de 200 rg/ml). Les drivs connus et inconnus de
l'INH n'inhibent pas la synthse des acides mycoliques dans un systme non-cellulaire
(12), cc qui n'exclut pas qu'ils puissent inhiber d'autres objectifs dans la bactrie.

D-Cyclosrine

Cet antibiotique est trs actif mais est l'origine de psychoses endognes rendant son
utilisation en clinique pratiquement impossible. Il inhibe la fbis la D-alanine racmase
et la D-alanyl-D-alanine synthtase chez les bacilles tuberculeux, causant une
accumulation d'un prcurseur du peptidoglycane, l'UDP-glycolyl-muramyl-tripeptide
(1041. L'elfet inhibiteur de I'antibiotique est annul des concentrations
quimolculaires de D-alanine (43). Comme chez les autres bactries, (68), la
D-cyclosrine est avant tout un inhibiteur de la synthse du peptidoglycane.
L'antibiotique est transport I'intrieur des cellules par le systme des permases. Des
mutants rsistants par diminution de I'activit de ce systme ont t observs (21). Il
semble galement que la D-cyclosrine inhibe la synthse des peptidoglycolipides
contenanf de la D-alanine localiss dans la paroi, comme la cire D de M tubercuLo,sis
(24) et le mycoside C de M avium (26).

Ethaniltutol

Takayama et al (107) ont montr que l'thambutol inhibe la fois le transfert des acides
mycof iques dans la paroi de M avium (sans doute par le mycolyl-actyl-trhalose) et
entrane I'accumulation de mono et di-mycolates de trhalose. L'thambutol la
concentration de 3 rg/ml inhibe I'incorporation de D-l4c glucose dans le D-arabinose
de I'arabinogalactane chez une souche sensible de M smegntatis, alors qu'il en est
incapable chez un mutant rsistant (105). Dans un systme non cellulaire, l'thambutol
inhibe galement la synthse des oligosaccharides contenant de I'arabinose. Comme les
acides mycoliques de la paroi mycobactrienne sont fixs en position 5 distale des
rsidus D-arabinose dans I'arabinogalactane, on a pu penser que I'insufisance de leur
incorporation (cause par l'thambutol) privait les acides mycoliques de leurs sites de
transfert dans la paroi, amenant une hyperproduction des autres composs mycoliques.
Il est possible que I'effet initial de I'antibiotique actionne une cascade de changements
dans le mtabolisme lipidique des mycobactries (105), amenant la dsagrgation des
agrgats bactriens en petits groupes (55). Ceci est conf'ort des observations rcentes
montrant que l'thambutol est capable de rompre la barrire d'exclusion localise dans
la paroi de M at,iLun (48, 87), et est capable d'augmenter significativement I'activit
bactricide des autres antituberculeux, la fois l'intrieur et I'extrieur des cellules
(e0).
968 N RASTOGI

Rifatnpicittc

L'action de la rifampicine a t examine sur des extraits de M ttthercuLosis ne

Antibiotiques moins tudis.

Il y a trs peu de donnes sur le mode d'action des autres antibiotiques contre M
tubercuLosis, et les donnes disponibles sont rapportes dans un article rcent. dont est
tire la table 4.

Distribution intro-celluloire des ontibiotiques


ontmycoboctriens

rnacrophages et apparat tre lgrement augmente par incubation en milieu acide


;
Scttl;ibilitc t'.rtru-cclluluirc t inrru-talluluirt,tles ntvtilut'fria,s uux unribioituc.s 969

l'antibiotique est cependant rapidemcnl- relargu si Ics cellules sont transfres dans un
milieu srns antibiotique ( 109).
Le tout dernier macrolide, la clarithromycinc, a une activit prometteuse contre les
mycobactries atypiques, l.nais poul'des raisons inconnues, n'est pas actf sur
M tuberculr.is (19, 83, 89). ll a t rapport que I'azithromycine a une activit
prometteuse sur lc cornplexe M avnn (121, 122) et justiiierait une tude vis--vis des
autrcs espces. Les tacrolides cn gnral se concentrent I'intrieur des macrophages
plus de l0 fbis dans lc cas de l'rythromycine et dc la carithromycine (62, 109) ct des
niveaux encore plus lcvs dans le cas de la roxithromycine et de I'azithromycine (13,
39, 109). L'incubation pH acide afI'ecte inversement I'accr,rmulation des lracrolides
dans les rnacrophages, qui par ailleurs se concentrenL significativelent dans les
rnacrophages activs (39, 109. l2l). D'aLrtres antibiotiqLres comme es ansamycines et la
rifrrpicine cn particr"rlier. nc sc concentrenl que 2 3 f'ois dans es phagocytes (53),
bien que ler-rr liposolubilit puisse aboutir une activit augmente sur les
mycobactries atypiques. puisqr"re leur solubilisation dans les lipides dc la cerpsule et dc
la couche externe peLrt leul permcttre de traverser la paroi bactrienne des
rrycobactr'ics (23).
Il est cependant de plr.rs en plus clair que les tudes de la pntration des
antibiotiqLres dans les macrophages ainsi que celles des interactions entre l'activit
antimycobactrienne des anLibioticlues ne pcrmettent pas d'expliciter totalcment
l'ef'f icucit thrapeutique in t'it't.

Nouvelles strotgies el directions futures

Il csl- clair que des nouveaux antibiol.iques avec un spectre plus large doivent Lre
dvelopps. Au cours des dcrnir'es annes, seules trois classes de nouveaux
antibiotiques ont prouv leur placc potentielle en thrapeutique:les nouvelles
lluoroquinolones (49,60,82,85,90), les ril'arnycines (100), et les macrolides (19,8:1,
89, l2l, 122). La sparf oxacine et la clarithrornycine montrent une activit
intracellulaire leve contre les infctions M at'iunt, dont on sait qu'eles sont dilt-iciles
Llaiter (89,90. Sur la base des macrophages intcts exprimcntalement iz t,itro eLde
la confi rmation clinique venir, l'association clarithromycine + rifampicine +
thambutol apparat aujourdhui tre un des traitements les plus bactricides des
int'ections M cn'iunt (89, I 20).
Pour combattre la barrire de permabilit localise dans I'enveloppe cellulaire de
M aviunt, on peut envisager I'emploi d'un antibiotiquc en association avec un inhibiteLrr
de la synthse de la paroi bactrienne, ou par synthse de drivs amphipathique
d'antituberculeux existants. Rcemment, la suggestion que la solubilisation pralable
des antibiotiques lipophiles dans les lipides de a paroi de M ayium permet leur
pntration travers la couche externe (23) a L, confirme par la synthse de drivs
amphipathiques de I'izoniazide qui est normalemcnt hydrophile (81,91). Parmi les
drivs synthtiss, I'hydrazide de I'acide palmitoyl-isonicotinique est plus actif contre
M cn,ium que I'antibiotique initial (81, 9l). Dans ce contexte, l'activit
anti r-nycobactrienne plus importante de I'amikacine par rapport la kanamycine
pourrait tle relie au fait que c'est Lrn driv serni-synthtique amphipathique de la
kanamycine avec un acidc butyrique en R3.
En dehors de contourner les problr.r.res lis la barrire d'exclusion, les tudes des
porines des mycobactries peuvent galement tre intressantes car elles donnent des
informations nouvelles sur I'organisation des protines dans un environnement
970 N RASTOGI

I 00
an
a,
ah
c . 80
( o
f \4, 60
Et
o c
an
0 40
,c, g,n
bR (! 20
o
(J
0
R<0.1 R<] .0 R<10.0 R<20.0 b20.O
INH-R (pg/ml)
80
(
a,
E60
c,
E40
L
J
3zo
0
++
lntensit de l'activit catalasique
Figure 9. Relation entre I'activit catalasique et la rsistance I'INH
chez M tuberculosis-
A. Pourcentage de souches catalase-ngatives en fonction de leur rsistance I'isoniazide
(n=4882, d'aprs 57 et75).
B. Activit catalasique de souches de M tuberculosis rsistantes I'INH (n=22; d'aprs 22 et
'7s).

hautement hydrophobe, permettant le transport travers la couche externe des petits


soluts hydrophiles (52, 61 , 74), une information qui peut nous permettre de concevoir
de nouveaux antibiotiques ayant la proprit d'emprunter les porines de la paroi.
Une autre statgie dans le champ de la thrapie antimycobactrienne est le
dveloppement actuel de I'apport d'antibiotique sur le site de la multiplication
bactrienne, c'est--dire dans les macrophages. ceci peut tre obtenu grce des
liposomes, ainsi que cela a t montr pour la kanamycine (108), I'amikacine (7, 31), la
streptomycine (l l1) et la rifampicine (99).
Les dveloppements rcents de la gntique molculaire des mycobactries
devraient nous aider mieux comprendre la rsistance des bactries aux antibiotiques.
Cependant les progrs dans cette direction sont gns par Ie peu d'efforts faits pour
connatre le mode d'action primaire des principaux antituberculeux. La priorit devrait
tre donne I'tude des interactions des antibiotiques avec leurs cibles. Jusqu' ce que
ces tudes soient menes bien, il sembte que les nouvelles molcules ou les
modifications des molcules existantes continueront tre dcouvertes par hasard.
Sensibilit exlra-cellulaire et intra-celluLaire des mycobactries aux antibiotiques 911

Rfrences 14 Crowle AJ, Dahl R, Ross E, May MH.


Evidence that vesicles containing living,
virulent MycobtLctcrium tubercuLo.i. or
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