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FACULTAD DE INGENIERA

CARRERA DE INGENIERA AMBIENTAL


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TEMA: OBSERVACIN DE BACTERIAS: TINCIN DE GRAM

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CURSO: MICROBIOLOGA

BLOQUE: FC-PREIAM05B1T

ALUMNO:
CCAHUA ZAMORA, Alexander
CHAVEZ HUERTA, Alfredo
JURADO ANAYA, Giantoni Adolfo
REYNA SILVA, Nadia Annel
SOLIS POCCO, Marino

PROFESORA: FLOREZ FLORES, Martha Virginia

2017-II
INTRODUCCIN

La vida a nivel microscpico es un tanto diferente a lo que los seres humanos


estamos acostumbrados a percibir a travs de nuestros sentidos, en este caso,
la vista. Dentro de este mundo existen muchos microorganismos que explican
muchos de los fenmenos biolgicos de nuestro da a da, es as como mediante
un estudio de este se ha logrado utilizarlos en favor de nuestro desarrollo,
creando medicamentos, ayudando en la industria alimentaria, agricultura, etc.

Uno de los ms importantes actores dentro del mundo microscpico son las
bacterias, ya que esas se encargan de procesos como la fermentacin,
desintetizacin de algunos contaminantes o sustancias peligrosas y dainas
para los seres humanos. Asimismo, como ya se mencion, su estudio ha dado
frutos como su aprovechamiento para el desarrollo de medicamentos,
preservantes, insecticidas, etc.

Para el estudio de las bacterias, es necesario poder verlas ya que estas no


reflejan ningn color, es decir, son transparentes. Para esto es necesario la
tincin de Gram, esta mezcla de sustancias nos permite teir las bacterias para
poder ver su forma, pero tambin para poder saber si son Gram positivas o Gram
negativas y esto nos permite saber con certeza qu bacteria es y as poder dar,
en el caso mdico, el tratamiento requerido.
OBJETIVOS

Aprender a desarrollar de manera adecuada la tincin Gram.


Observar y diferenciar bacterias Gram positivas y Gram negativas de un
grupo microbiano (Bacillus sp, Staphylococcus sp, Escherichia coli,
Pseudomonas sp y Salmonella sp.)
Conocer el manejo del microscopio ptico para la observacin de
bacterias (importancia del objetivo de inmersin) y estudiar las
caractersticas morfolgicas de cada una de ellas.
MARCO TERICO

Los microorganismos son demasiado pequeos para observarse a simple vista:


protozoos, algas, hongos, bacterias y virus. Estos microorganismos difieren en
caractersticas tales como forma de nutricin, estructura, tamao, composicin,
en otros aspectos; es por ello que se emplea el estudio microscpico el que
facilita notablemente la observacin; principalmente de las bacterias al tratarlas
con colorantes los cuales a la vez facilitan la observacin de ciertas estructuras
celulares.

La tincin Gram es una tincin muy utilizada para la identificacin y clasificacin


de las bacterias. La tincin Gran es una tincin diferencial que te permite
clasificar las bacterias en dos grupos Gram positivas y negativas. La tcnica de
la tincin Gram fue descubierta por Hans Christiam Gram en 1884, cuando
intent teir clulas y encontr que algunas perdan el color cuando se les
quitaba el exceso de tinte. (Forbes, 2009)

Tincin de Gram diferencia las bacterias por las propiedades qumicas y fsicas
de sus paredes celulares mediante la deteccin de peptidoglicano, qua est
presente en una capa espesa de las bacterias Gram positivas. Los resultados
Gram positivos se denotan por un color prpura/azul, mientras que las negativas
son rosas/rojo. (Forbes, 2009)

Microorganismos Gram Positivos


Las eubacterias Gram positivas son clulas con una gruesa pared celular de
peptidoglicano. Ests clulas poseen una membrana citoplasmtica con
fosfolpidos y protenas. Por fuera de membrana citoplasmtica se encuentra la
pared celular que est compuesta por una ancha capa de peptidoglicano. A su
vez, estas cadenas se encuentran unidas entre s mediante pptidos, que son
pequeas cadenas de aminocidos que se entrecruzan. Estos puentes ppticos
son caractersticas de las distintas bacterias y presentan mayor rigidez cuanto
ms completo sea el entrecruzamiento. (Cavallini, 2005)
Microrganismos Gram negativos
Las eubacterias Gram. Negativas son clulas con una delgada capa de
peptidoglicano y una segunda envoltura denominada membrana externa. Las
clulas se encuentran envueltas por una membrana citoplasmtica formada por
una bicapa fosfolipdica y protenas. Por encima de esta membrana se encuentra
una fina capa de peptidoglicano que se halla unida a unas lipoprotenas de
anclaje que fijan la membrana externa. (Cavallini, 2005)
EQUIPOS, MATERIALES, REACTIVOS E INSUMOS

EQUIPOS
Microscopio Compuesto de Luz
Soporte para tincin
(5x, 10x, 40x y 100x)

Mechero Bunsen

MATERIALES
Pinzas
Asa o aguja de Kolle

Lminas porta y cubre objetos Goteros


REACTIVOS
Aceite de inmersin Cristal violeta

Safranina Lugol

Alcohol acetona Agua destilada

INSUMOS
Bacillus sp Escherichia coli
Pseudomonas sp Staphylococcus sp

Salmonella sp.
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Fijacin de muestras

1. se coloc una gota pequea de suero fisiolgico sobre una lmina porta objeto
completamente limpia. Con ayuda del asa de Klle coloque sobre la gota una
pequea porcin de la muestra a fijar. Si la muestra que contiene al
microorganismo es lquida, puede aplicarse directamente sin la gota de suero
fisiolgico.

2. Se distribuy la gota cargada con la muestra en la lmina hasta formar una


pelcula delgada.

3. Se sec la lmina a una razonable distancia sobre la llama del mechero.

4. Cuando la pelcula est seca, se pas la lmina a travs de la llama del


mechero unas tres veces, cuidando que la pelcula est hacia arriba y que la
lmina no se recaliente.

Tincin de Gram

1. Preparamos una lmina fija de cada uno de los cultivos microbianos


proporcionados.

2. Colocamos cada preparacin a teir sobre el soporte para tincin.

3. Agregamos cristal violeta y deje que acte por 1 minuto.

4. Enjuagamos con agua

5. Cubrimos la pelcula teida con lugol y dejamos que acte por 1 minuto.

6. Enjuagamos con agua.

7. Decoloramos con alcohol-acetona. Para una pelcula delgada, la exposicin al


decolorante por 10-20 segundos es suficiente.

8. Enjuagamos con agua.

9. Aplicamos el colorante de contraste safranina por 30 segundos.


10. Enjuagamos con agua y secamos la lmina al aire o dentro de papel toalla
sin frotar.

11. Aplicamos una gota de aceite de inmersin a la muestra coloreada.

12. Observamos cada muestra bajo el objetivo de inmersin.

13. Finalmente se elabor los anlisis correspondientes.

RESULTADOS

Figura 1: Staphylococcus ssp Gram Figura 2: Escherichia coli Gram


positiva negativo

Figura 3: Bacillus sp Gram positivo. Figura 4: Salmonella sp Gram


negativo.
DISCUSIONES

En la (figura 1) se puede apreciar Staphylococcus ssp Gram positivos que se


encuentran en racimos, pares y e cadenas cortas con forma redonda (coco). Esta
bacteria se observa de color violeta ya que en el proceso de tincin donde se le
agrego los diferentes colorantes como cristal violeta y safranina, quedaron
teidas; aun cuando se les retir el exceso de colorante con agua destilada,
tomando este color caracterstico que se le denomina a las bacterias que lo
presentan Gram positivas.

En la (figura 2) se puede apreciar Escherichia Coli, Gram negativa por que la


coloracin que presenta es un color medio rosado que lo caracteriza. Esta
bacteria tiene este color, debido a que los colorantes que se le agreg no
pudieron teir porque el cristal violeta y el lugol no reaccionan con el cido
teicocio, debido a que las bacterias Gram negativas en su pared celular no lo
tienen.

En la (figura 3) se puede ver a la bacteria Bacillus sp que pertenece a los Gram


positivo debido al color que presenta despus de agregar los colorantes. Este
color se debe a que la capa de la envoltura celular de las bacterias Gram-
positivos cubren la membrana citoplasmtica y tienen una pared celular
compuesta por una gruesa capa de peptidoglicano. El cristal violeta penetr, en
esta clula, el lugol hizo que el cristal violeta se fijara intensamente en la pared
bacteria de la clula y se formara un complejo entre los dos. En la (figura 4) se
puede ver la Salmonella sp que es una bacteria Gram negativo por su coloracin.

En esta prctica pudimos observar con la tincin de Gram que la bacteria


staphylococcus ssp es una bacteria gran positiva. Esto se debe a que esta
bacteria posee una gruesa capa de peptidoglucano adems pose cidos
teicoicos. El alcohol acetona nos sirvi para realizar la decoloracin, pero como
esta es una bacteria positiva esta no se descolor. En cambio, los enterobacter
que se pudo observar que es una bacteria Gram negativa, en este procedimiento
con el alcohol acetona estas se decoloran y por eso se la usa la safranina que
es un colorante de contraste y podemos observar su color medio rosado. Esta
clase de bacteria pose una capa de peptidoglucano delgada.
La diferencia que se observ en la resistencia a la decoloracin se debe a que
la membrana externa de las Gram negativas es soluble en solventes orgnicos,
como por ejemplo la mezcla de alcohol/acetona. La capa de peptidoglucano que
posee es demasiado delgada como para poder retener el complejo de cristal
violeta que se form previamente, y por lo tanto este complejo se escapa,
perdindose la coloracin azul-violcea. Pero, por el contrario, las Gram
positivas, al poseer una pared celular ms resistente y con mayor proporcin de
peptidoglicanos, no son susceptibles a la accin del solvente orgnico, sino que
este acta deshidratando los poros cerrndolos, lo que impide que pueda
escaparse el complejo cristal violeta/yodo, y manteniendo la coloracin azul-
violcea (Clavell, L.; Pedrique de Aulacio, M. (1992)).
CONCLUSIONES

En conclusin, en el laboratorio a travs de la tcnica de tincin diferencial de


Gram se determin la existencia de dos grupos principales de bacterias las
cuales son de Gram positivo y de Gram negativo.

Se observ bacterias de Gram negativo y Gram positivo que con la coloracin


quedaron teidas de color rosado y violeta respectivamente los cuales nos dieron
como resultado de Gram negativo Escherichia coli y Salmonella sp y de Gram
positivo Bacillus sp y Staphylococcus sp.
CUESTIONARIO

1.Por qu razn, la pared de una bacteria Gram positiva retiene el


colorante primario? qu papel cumple el lugol en la tincin de Gram?

Una bacteria Gram positiva retiene el colorante primario por la deshidratacin,


mayor contenido de peptidoglucano y la reduccin del tamao de los poros de la
pared resultante del proceso de lavado con solvente. En contraste en las Gram
negativas la fina (y probablemente discontinua) capa de peptidoglicano no
impide la extraccin por el solvente del complejo. El colorante es fijado a nivel
del protoplasto, y que la pared celular de las bacterias Gram positivas es la que
impide la extraccin del colorante. El lugol, funciona como fijador de la
preparacin, y tambin acta sobre la pared de las bacterias Gram(+) de tal
manera que al agregar el decolorante (alcohol-cetona) no se destian las
bacterias que ya se tieron. El yodo entra en las clulas y forma un complejo
insoluble en solucin acuosa con el cristal violeta. El lugol es un compuesto
formado por yodo en equilibrio con yoduro de potasio, el cual est presente para
solubilizar el yodo, y acta de mordiente, haciendo que el cristal violeta se fije
con mayor intensidad a la pared de la clula bacteriana

2.Cules son las estructuras celulares o moleculares responsables de las


tinciones realizadas en la prctica? De ejemplos de otros colorantes que
podran utilizarse?

Los principios de la tincin de Gram estn basados en las caractersticas de la


pared celular de las bacterias, la cual le confiere propiedades determinantes a
cada microorganismo. La pared celular de las bacterias Gram negativas est
constituida por una capa fina de peptidoglicano y una membrana celular externa,
mientras que las bacterias Gram positivas poseen una pared celular gruesa
constituida por peptidoglicano, pero no

cuentan con membrana celular externa; as pues, la composicin qumica y el


contenido de peptidoglicano en la pared celular de las bacterias Gram negativas
y Gram positivas explica y determina las caractersticas tintoriales

Otros colorantes:
Azul brillante de Coomassie
Azul de metileno
Azul Nilo
Bismarck brown
Bromuro de etidio
Carmn
Cristal violeta
DAPI
Eosina
Fucsina cida
Hematoxilina
Hoechst
Lugol
Naranja de acridina
Plata
Rodamina
Rojo neutro
Rojo Nilo
Safranina
Sudan
Tetrxido de osmio
Verde de metilo
Verde malaquita

3.Mencione cuales son las precauciones que se debe de tener a la hora de


realizar una coloracin

Elegir bien los reactivos y ser muy cuidadosos al ejecutar la tcnica.


Evitar las impurezas en los reactivos de Tincin.
Usar la concentracin adecuada de los reactivos de tincin.
Usa el pH adecuado.
El colorante se fija a la clula por mecanismos fsico-qumicos, que se
alteran si el pH no es el apropiado.
Los colorantes pueden ser cidos, bsicos o neutros.
Estar atentos al tiempo de Tincin
Usar la temperatura correcta

4.Mencione otros tipos de coloraciones utilizadas para observar


estructuras celulares como cpsula, flagelos, esporas, etc.

Coloracin Giemsa
Coloracin de Grocott
Coloracin de Fite-faraco
Coloracin PAS (periodic acid-schiff)
Coloracin de Ziehl-Neelsen

5.Mencione bacterias que no es til la coloracin gram y explique Por qu

Las siguientes bacterias de naturaleza gram positiva se tien como gram


negativas:

Mycobacterias porque estn encapsuladas


Mycoplasmas porque no tienen pared
Formas L por su prdida ocasional de la pared
Protoplastos y esferoplastos por la eliminacin total y parcial de la pared,
respectivamente
BIBLIOGRAFA

Clavell, L.; Pedrique de Aulacio, M. (1992). Microbiologa. Manual de Mtodos


Generales (segunda edicin). Facultad de Farmacia. Universidad Central de
Venezuela.
Cavallini, E. (2005). Bacteriologa General: Principios y Prcticas de Laboratorio.
Costa Rica: Universidad de Costa Rica. Recuperado de:
https://es.slideshare.net/tato762/tincin-de-gram-25801593
Decr D, Barbut F, Petit JC. Role of the microbiology laboratory in the diagnosis of
nosocomial diarrhea. Pathol Biol (Pars). 2000; 48: 733-744.

Madison BM. Application of stains in clinical microbiology. Biotech Histochem. 2001;


76: 119-125.
Forbes, B. (2009). Diagnstico Microbiolgico. Mxico: Medicina Panamericana.
Keller PJ. Imaging morphogenesis: technological advances and biological insights.
Science. 2013; 340: 123-168.