Extracto Acuoso de Lepidium Meyenii

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS
(Universidad del Per, Decana de Amrica)
ESCUELA DE POSGRADO
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS
UNIDAD DE POSGRADO
PRODUCCIN DE mRNA PARA CITOQUINAS

HEMATOPOYTICAS (IL-3, GM-CSF e IL-7) EN RATONES
INMUNOSUPRIMIDOS TRATADOS CON EXTRACTO ACUOSO
DE Lepidium meyenii WALPERS (MACA)
Tesis para optar al Grado Acadmico de

MAGSTER EN BIOLOGA MOLECULAR
Bachiller Evelyn Katy Alvarez Salazar
LIMA PER
2013
Mira que te mando que te esfuerces y seas valiente; no temas ni desmayes,
porque Jehov tu Dios estar contigo en dondequiera que vayas
(Josu 1: 9)
AGRADECIMIENTOS
A Dios, por acompaarme y guiarme a lo largo de mi vida, por ser mi fortaleza

en los momentos de debilidad y por brindarme una vida llena de aprendizajes,
experiencias y sobre todo felicidad.
A mis padres, Uldarico y Dionicia, por su ejemplo de lucha y honestidad,
porque creyeron en m y me dieron la oportunidad de tener una profesin.
A mis hermanas Elizabeth y Rosa, por llenar mi vida de alegras y amor
cuando ms lo he necesitado.
A mi asesora Libertad Alzamora por aceptarme en su laboratorio, por haber
compartido conmigo sus conocimientos y sobre todo su amistad.
A todas aquellas personas que de una u otra forma, colaboraron o participaron
en la realizacin de esta investigacin, hago extensivo mi ms sincero
agradecimiento.
Al Consejo Nacional de Ciencia, Tecnologa e Innovacin Tecnolgica por el
apoyo econmico para la culminacin del grado y el desarrollo de la Tesis.
CONTENIDO
PAG
RESUMEN I
ABSTRACT II
LISTA DE TABLAS III
LISTA DE FIGURAS IV
LISTA DE ABREVIATURAS V
1. INTRODUCCIN 1
2. ANTECEDENTES
2.1 Lepidium meyenii WALPERS (MACA) 3
2.2 HEMATOPOYESIS Y CITOQUINAS 6
2.3 CICLOFOSFAMIDA 9
2.4 EMPLEO DE PLANTAS COMO PROTECTORES FRENTE A DROGAS 11

CITOTXICAS
3. HIPTESIS Y OBJETIVOS 13
4. MATERIALES Y MTODOS
4.1 ELABORACIN DEL EXTRACTO ACUOSO (EAc) DE MACA E 14

IDENTIFICACIN FITOQUMICA DE SUS PRINCIPALES COMPONENTES
4.2 INMUNOSUPRESIN EXPERIMENTAL CON CICLOFOSFAMIDA 18
4.3 EVALUACIN DEL EFECTO MODULADOR DEL EAc DE MACA SOBRE 22

LA PRODUCCIN DE mRNA PARA IL-3, GM-SCF e IL-7 EN EL BAZO Y
LA MDULA SEA DE RATONES INMUNOSUPRIMIDOS
4.4 EVALUACIN DEL EFECTO MODULADOR DEL EAc DE MACA SOBRE 35

LA PROLIFERACIN CELULAR Y PRODUCCIN DE mRNA PARA IL-3,
GM-CSF E IL-7 EN CULTIVOS DE CLULAS MONONUCLEARES DE LA
MDULA SEA
4.5 EVALUACIN DE LA INFLUENCIA DEL TRATAMIENTO CON EL EAc DE 39
MACA SOBRE LA PROLIFERACIN DE LAS CLULAS
HEMATOPOYTICAS DE RATONES INMUNOSUPRIMIDOS
4.6 ANLISIS ESTADSTICO 43
5. RESULTADOS
5.1 IDENTIFICACIN DE LOS PRINCIPALES COMPONENTES PRESENTES 44

EN EL EXTRACTO ACUOSO (EAc) DE MACA
5.2 INMUNOSUPRESIN EXPERIMENTAL CON CICLOFOSFAMIDA Y 45

TRATAMIENTO CON EL EAc DE MACA EN RATONES
5.3 EFECTO DEL EAc DE MACA SOBRE LA PRODUCCIN DE mRNA PARA 48

IL-3, GM-SCF e IL-7 EN CLULAS DEL BAZO Y LA MDULA SEA DE
RATONES INMUNOSUPRIMIDOS
5.4 EFECTO MODULADOR DEL EAc SOBRE LA PROLIFERACIN 56

CELULAR Y PRODUCCIN DE mRNA PARA IL-3, GM-CSF E IL-7 EN
CULTIVOS DE CLULAS MONONUCLEARES DE LA MDULA SEA
5.5 INFLUENCIA DEL TRATAMIENTO CON EL EAc DE MACA SOBRE LA 58

PROLIFERACIN DE LAS CLULAS HEMATOPOYTICAS DE RATONES
INMUNOSUPRIMIDOS
6. DISCUSIN 67
7. CONCLUSIONES 78
8. RECOMENDACIONES 79
9. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS 80
10. ANEXOS 92
RESUMEN
Lepidium meyenni (maca) es un cultivo tradicional de los Andes Centrales

del Per. Se han demostrado sus propiedades antitumorales e
inmunomoduladoras, que lo convierten en un excelente candidato para
investigar su actividad hematopoytica.
En el presente estudio, se trataron ratones Balb/c a dosis de 200 mg/kg de

extracto acuoso (EAc) de maca amarilla por va oral durante 2 meses previo a
la inmunosupresin (IS) con ciclofosfamida (CF), y se evalu la produccin de
mRNA para las citoquinas hematopoyeticas: interleuquina 3 (IL-3), factor
estimulador de colonias de granulocitos y monocitos (GM-CSF) e interleuquina
7 (IL-7) en el bazo y la mdula sea, tanto en los ratones tratados como en
sus controles. Se realizaron cultivos de clulas mononucleares de mdula
sea y se evalu el efecto del EAc sobre la proliferacin celular y produccin
de mRNA para las 3 citoquinas hematopoyticas.
La administracin de EAc en ratones IS, increment (p<0.05) la produccin

de mRNA para las tres citoquinas en el bazo y de IL-7 en la mdula sea, dos
das despus de la IS; e IL-3 y GM-CSF en la mdula sea 5 das post-IS, al
compararlos con los grupos no tratados con el extracto. En cultivos de mdula
sea, el EAc en la dosis de 100 g/ml, estimul (p<0.05) la proliferacin celular
y la produccin de mRNA para IL-7. Adems, los ratones IS y tratados con
EAc mostraron mayor recuento de clulas de mdula sea, sangre perifrica,
unidades formadoras de colonias endgenas en el bazo (CFU-S) y respuesta
proliferativa a mitgenos de los linfocitos, cinco das despus de la IS.
El EAc de maca estimula la produccin de mRNA para las tres citoquinas

hematopoyticas. La administracin de EAc a ratones inmunocomprometidos
puede revertir los efectos supresores de la ciclofosfamida.
Palabras clave: Lepidium meyenii, maca amarilla, extracto acuoso,

inmunomodulacin, citoquinas hematopoyticas.
ABSTRACT
Lepidium meyenni (maca) is a traditional crop of the Central Andes of Peru.

Studies demonstrated their antitumor and immunomodulatory properties, which
makes it an excellent candidate to investigate its hematopoietic activity.
In the present study, Balb/c mice were orally treated with aqueous extract
(EAc) of maca at the doses of 200 mg/kg for two months prior to
immunosuppression (IS) with a single doses of cyclophosphamide (CF) (130
mg/kg) to evaluate the mRNA production of hematopoietic cytokines:
interleukin 3 (IL-3), granulocyte-monocyte colony stimulating factor (GM-CSF)
and interleukin-7 (IL-7) in spleen and bone marrow, both in treated and controls
mice. Murine bone marrow cells were isolated and co-incubated with aqueous
extract (EAc) of yellow maca to evaluate its effects on the cells proliferation
and mRNA production of the three hematopoietic cytokines.
The administration of EAc in immunosuppressed mice, increased mRNA

production for the three cytokines by spleen and IL-7 mRNA by bone marrow
on day 2 after immunosuppression, and IL-3 and GM-CSF mRNA production
by bone marrow on days 5 after IS, compared with the untreated group. EAc of
maca at 100 g/ml stimulated the proliferation of mononuclear cells and IL-7
mRNA production of cultured bone marrow cells. The extract also induced in
EAc-treated mice and IS, an increase in bone marrow and peripheral blood cell
counts, endogenous colony forming units-spleen (CFU-S) and the proliferative
response of lymphocytes on days 5 after IS.
The aqueous extract of maca stimulates the mRNA production for three
hematopoietic cytokines. The administration of EAc to immunocompromised
mice can reverse the suppressive effects of cyclophosphamide.
Keywords: Lepidium meyenii, yellow maca, aqueous extract,

immunomodulation, hematopoietic cytokines.
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Protocolo empleado para el tratamiento con el extracto acuoso de

maca en ratones hembras balb/c.
Tabla 2. Secuencias de los primers empleados para el RT-PCR en tiempo
real.
Tabla 3. Resultados del tamizaje fitoqumico del extracto acuoso de Lepidium
meyenii (maca).
Tabla 4. Efecto del extracto acuoso de maca sobre los niveles sricos de la
enzima transaminasa glutmico pirvica en los ratones inmunosuprimidos con
ciclofosfamida.
Tabla 5. Efecto del extracto acuoso de maca sobre la expresin de mRNA de
IL-3, GM-SCF e IL-7 en los cultivos de clulas mononucleares de la mdula
sea.
Tabla 6. Efecto del extracto acuoso de maca sobre el recuento diferencial de
sangre circulante en ratones inmunosuprimidos con ciclofosfamida.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Hipoctilos del Lepidium meyenii Walpers (maca), ecotipo amarillo.

Figura 2. Elaboracin del EAc de maca.
Figura 3. Administracin del extracto acuoso de maca a los ratones.
Figura 4. Electroforesis de los RNA totales de las muestras analizadas.
Figura 5. Resultado del anlisis de los primers para IL-3 mediante el Software
Primer-Blast.
Figura 6. Amplificacin por PCR convencional con los primers especficos
para los genes evaluados.
Figura 7. Programa de anlisis de imagen TotalLab Quant.
Figura 8. Curva de disociacin correspondiente a los fragmentos amplificados
del transcrito del gen IL-7, se observa un solo pico con un Tm aproximado de
75,6C en todas las muestras analizadas para IL-7.
Figura 9. Grfico de la segunda derivada de la fluorescencia emitido por cada
reaccin, mediante el anlisis del Mtodo de Cuantificacin Comparativa del
software Rotor Gene (versin 1.7).
Figura 10. Grfico de la segunda derivada generado por el software Rotor
Gene, para los fragmentos amplificados del transcrito del gen IL-7.
Figura 11. Obtencin de la mdula sea de los fmures de los ratones.
Figura 12. Ensayo del MTT. El formazn formado es disuelto con
solubilizantes (DMSO, alcohol isoproplico, etc.) y la intensidad de la
coloracin es proporcional a la cantidad de clulas vivas.
Figura 13. Colonias macroscpicas formadas en la superficie del bazo de
ratones inmunosuprimidos con ciclofosfamida.
Figura 14. Efecto de diferentes dosis de ciclofosfamida sobre el porcentaje de
clulas nucleadas de la mdula sea.
Figura 15. Efecto del extracto acuoso de maca sobre la expresin de mRNA
de IL-3 por esplenocitos de ratones inmunosuprimidos con ciclofosfamida.
de GM-CSF por esplenocitos de ratones inmunosuprimidos con ciclofosfamida.
de IL-3 en la mdula sea de ratones inmunosuprimidos con ciclofosfamida
de GM-CSF en la mdula sea de ratones inmunosuprimidos con
ciclofosfamida.
de IL-7 en la mdula sea de ratones inmunosuprimidos con ciclofosfamida.
Figura 21. Efecto del extracto acuoso de maca sobre la proliferacin de las
clulas mononucleares de la mdula sea.
Figura 22. Efecto del extracto acuoso de maca sobre el recuento de clulas
nucleadas de mdula sea en ratones inmunosuprimidos con ciclofosfamida.
nucleadas de sangre circulante en ratones inmunosuprimidos con
ciclofosfamida.
Figura 24. Macrocolonias en el bazo de ratones inmunosuprimidos con
ciclofosfamida y evaluadas 5 das despus de la inmunosupresin.
Figura 25. Efecto del extracto de maca sobre el recuento de las unidades
formadoras de colonia esplnica (CFU-S) de ratones inmunosuprimidos con
ciclofosfamida.
Figura 26. Efecto del extracto acuoso de maca sobre la respuesta proliferativa
a concanavalina A de los linfocitos del bazo de ratones inmunosuprimidos con
ciclofosfamida.
a Lipopolisacrido de los linfocitos del bazo de ratones inmunosuprimidos con
ciclofosfamida.
Figura 28. Posible mecanismo de accin del extracto acuoso de maca sobre
las clulas hematopoyticas.
LISTA DE ABREVIATURAS
EAc: Extracto acuoso

CF: Ciclofosfamida
IS: Inmunosuprimido
p.c.: Peso corporal
IL-3: Interleuquina 3
GM-CSF: Factor estimulador de colonias de granulocitos y macrfagos
CFU-S: Unidades formadoras de colonias endgenas en el bazo
CMH: Clula madre hematopoytica
CPH: Clula progenitora hematopoytica
RT-PCR: Reaccin en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa
mRNA: cido ribonucleico mensajero
1. INTRODUCCIN
La hematopoyesis es el proceso de formacin, desarrollo y maduracin de

eritrocitos, leucocitos y plaquetas a partir de un precursor celular comn e
indiferenciado conocido como clula madre que en el adulto se encuentra en
la mdula sea. Estas clulas requieren de un microambiente especfico
conocido como estroma medular y de factores de crecimiento hematopoytico
(FCH) para su normal evolucin. Los FCH son un conjunto de protenas
llamadas citoquinas que actan sobre las poblaciones inmaduras potenciando
su maduracin y proliferacin. Entre las ms importantes estn: Factor
Estimulador de Colonias Granulocito-Macrfago (GM-CSF), Factor Estimulador
de Clulas Precursoras (SCF), IL-3, IL-7 y Eritropoyetina (Epo) (Abbas, 2008;
Mayani et al., 2007).
La mdula sea es un lugar de continua proliferacin y renovacin de

clulas sanguneas, por lo tanto es el rgano ms afectado durante cualquier
terapia de inmunosupresin con frmacos citotxicos como la ciclofosfamida.
La prdida de clulas madre y la incapacidad de regeneracin de nuevas
clulas sanguneas de la mdula sea se traducirn en anemia, leucopenia y
trombocitopenia (Anderson et al., 1995; Haubitz, 2007). Actualmente, se estn
aplicando estas drogas antineoplsicas en combinacin con varios agentes
detoxificantes e inmunomoduladores con el fin de reducir o eliminar sus
efectos txicos adversos (Jena et al., 2010).
En los ltimos aos se est produciendo una tendencia de rpido

crecimiento mundial hacia la revalorizacin de los conocimientos sobre el uso
de plantas tradicionales, por sus posibles efectos medicinales y/o
nutricionales. Muchas de las plantas utilizadas en la medicina tradicional han
demostrado poseer actividades moduladoras de la mdula sea,
contrarrestando los efectos txicos de las radiaciones y drogas
antineoplsicas, adems de mejorar los mecanismos inmunolgicos
encargados de combatir las clulas malignas y proteger al organismo de las
infecciones (Bhushan y Manish, 2007).
1
Lepidium meyenii Walpers (maca) es una especie nativa adaptada a las
condiciones extremas existentes en los pisos ecolgicos ms altos de la
cordillera de los Andes Centrales del Per. Es apreciada por su alto valor
nutritivo y energtico, por lo que su importancia econmica est vinculada
principalmente a sus propiedades revitalizantes, vigorizantes y estimulantes de
la reproduccin (Obregn, 1998).
Es as como en los ltimos aos se han evaluado cientficamente muchas

de sus propiedades, confirmando las mencionadas y aportando otras (Wanga
et al., 2007; Gonzales, 2012). Se comprobaron sus propiedades antitumorales
e inmunomoduladoras, al estimular tanto la respuesta inmune humoral como
celular (Alzamora, 2003; Alzamora et al., 2004). Sobre los estudios de la maca
en la hematopoyesis se reportaron que el extracto acuoso de maca ecotipo
amarillo favoreci significativamente el incremento de glbulos blancos,
hemoglobina y recuento de clulas de mdula sea (Torres, 2008), en
animales inmunosuprimidos con 50 mg/kg de ciclofosfamida, sealando un
posible efecto estimulatorio en las clulas madre/progenitoras
hematopoyticas, que la convierte en un recurso con potencial
quimioprotector.
Dado que estas clulas inmaduras responden a una serie de citoquinas

hematopoyticas del estroma medular, importantes en la regulacin de la
proliferacin y diferenciacin a clulas maduras, el estudio de estas citoquinas
es importante para dilucidar el mecanismo de accin de la maca a nivel
hematopoytico. Por lo que en este estudio se evaluar el efecto de la maca
sobre la expresin gnica de tres citoquinas hematopoyticas (IL-3, IL-7 y GM-
CSF) en un modelo de mielosupresin murina, y de esta manera se
proporcionar el soporte bsico-molecular, indispensable para la explicacin
adecuada de sus propiedades, en este caso moduladora de la hematopoyesis.
2
2. ANTECEDENTES
2.1 Lepidium meyenii WALPERS (MACA)
Es un cultivo tradicional de los Andes Centrales Peruanos, que crece y se

desarrolla en los ecosistemas Suni y Puna de los departamentos de Junn y
Pasco, en altitudes que oscilan entre los 3700 hasta los 4450 m.s.n.m. Es una
planta que rene calidad alimenticia, alta productividad y adaptacin a
condiciones ecolgicas extremas donde otro cultivo no podra prosperar,
debido a las bajas temperaturas, heladas, granizadas y sequas; por lo que es
considerada la nica especie del gnero Lepidium domesticada en los Andes
(Obregn, 1998). La maca fue un producto valioso para los incas, no solo por
su alto valor nutricional sino por su uso medicinal, especialmente como
revitalizante, afrodisiaco y potenciador de la fertilidad, razn por la cual esta
planta era considerada en la categora de las plantas mgicas en los ritos que
los Incas y sus descendientes realizaban (Tello et al., 1992).
Los cultivares de maca que existen en la actualidad se diferencian

principalmente por el color externo del hipoctilo (ecotipos), que es la porcin
comestible y pueden ser blancos, amarillos, negros, rojos y morados, siendo
los amarillos los ms consumidos y de mayor produccin. La diversidad de
esta coloracin se debe principalmente a la presencia de antocianinas y
probablemente a xantofilas (Yllescas, 1994; Obregn, 1998). La poblacin
nativa peruana de los Andes Centrales consume los hipoctilos de la maca
despus de hacerlas secar naturalmente y en cantidades de 20 - 50 g/diario.
Los hipoctilos secos son consumidos preferentemente hervidos en agua o
leche, en forma de jugos o cocteles (Vlchez, 2001).
El nombre cientfico Lepidium meyenii Walpers fue designado por el doctor

Gerhard Walpers en 1843, en base a la observacin de un espcimen silvestre
de la planicie de Pisacoma en Puno; sin embargo en 1989 la doctora Gloria
Chacn seal que no haba correspondencia entre los caracteres botnicos
del espcimen cultivado tradicionalmente en los Andes Centrales Peruanos y
3
las caractersticas de Lepidium meyenii Walpers, razn por la cual plante la
necesidad del cambio del nombre a Lepidium peruvianum Chacn (Chacn,
1990), por lo que el nombre cientfico de la maca fue cuestionado a partir de
ese momento. Sin embargo en el 2011, el Doctor Destfano y colaboradores,
determinaron mediante el anlisis de cdigo de barras de DNA del cloroplasto,
que ambos "especmenes" cultivado y silvestre, eran prcticamente lo mismo,
por lo que sealaron que no habra necesidad de cambiar el nombre
designado por el doctor Walpers (Destfano, 2011).
Los anlisis bromatolgicos realizados a la maca comprobaron su alto valor

nutricional por su alto contenido de macro y micronutrientes, por lo que es
utilizada como suplemento alimenticio. Se concluye que su valor nutricional es
comparable al de cereales como maz, arroz y trigo, superando en contenido
calrico, protenas y carbohidratos a otros vegetales, adems presenta un
contenido proteico superior a otros hipoctilos y tubrculos, y altos valores de
calcio y hierro. Entre otros nutrientes encontrados estn los lpidos, fibras,
vitaminas y aminocidos esenciales (Fairlie et al., 1999; Canales et al., 2000,
Bianchi, 2003).
En 1961 se report por primera vez la presencia de alcaloides, glucsidos,

taninos y saponinas (Castao, 2008). Las investigaciones fitoqumicas
mencionan principalmente:
Alcaloides, hasta 4 fracciones macana 1, 2 3 y 4 (Dini et al., 1994)

actualmente identificados como: (1R,3S)-1 methyltetrahidro-b-carboline-
3-oic-acid, un derivado de la dihidropiridina (macaridina) y dos de tipo
imidazlico (lepidilina A y lepidilina B) y (Cui et al., 2003; Muhammad et
al., 2002).
Glucosinolatos: Benzylglucosinolato (Glucotropaeolin) y m-
methoxybenzylglucosinolato (Dini et al., 2002). Otros investigadores
afirman la presencia de 8 glucosinolatos (Valentov y Ulrichov, 2003).
Isotiocianatos, producto de la hidrlisis de los glucosinolatos, por accin
de la mirosinasa. Son responsables del fuerte olor y sabor picante de la
maca (Piacente et al., 2002).
4
Macaeno y Macamidas (alkamidas benziladas), son cidos grasos poli-
insaturados (Zhao et al., 2005).
Adems de esteroles (Gutirrez et al., 2009), antocianinas, flavonoides

(Sandoval et al; 2002), taninos y saponinas (Yllescas, 1994).
Algunas de las propiedades atribuidas a la maca han sido comprobadas

cientficamente en base a experimentos con animales y humanos, la mayora
realizados con maca ecotipo amarillo, por ser el ms abundante en las
cosechas (Gonzales, 2012): En ratas se demostr que la maca revierte
parcialmente el efecto deletreo de acetato de plomo y de la altura sobre la
espermatognesis (Rubio et al., 2006; Gonzales et al., 2004). En humanos, se
report que la maca gelatinizada mejora el recuento, movilidad de
espermatozoides y el deseo sexual en varones adultos, pero los efectos
reproductivos son independientes de cambios hormonales, puesto que estos
no se modifican (Gonzales et al., 2003), en mujeres se report que reduce los
sntomas psicolgicos y la disfuncin sexual de la post-menopausia, pero
independiente de la actividad estrognica y andrognica (Brooks et al., 2008).
Tambin se report que la maca favorece la tasa de crecimiento y
supervivencia de peces juveniles (Lee et al., 2004) y que presenta un efecto
favorable para el tratamiento de la osteoporosis, al mejorar la densidad sea y
restaurar la red trabecular en un modelo de ratas ovariectomizadas tratadas
con extracto etanlico de maca (Zhang et al., 2006). Otros estudios
demostraron el potencial antioxidante del extracto acuoso de maca, por su
capacidad de atrapar los radicales libres y proteger a las clulas contra el
estrs oxidativo (Sandoval et al., 2002), no inducir hemlisis de eritrocitos
(Rosas y Pino, 2005), no ejercer efectos citotxicos en cultivos de hepatocitos
con dosis crecientes de maca (Valentov et al., 2006) y revertir los parmetros
lipdicos, de glucosa y el nivel de enzimas anti-oxidantes en ratas con
hipertrigliceridemia hereditaria, alimentadas con maca como suplemento
dietario (Vecera et al., 2007). Adems, que el extracto acuoso favorece la
respuesta del organismo en una situacin estresante y fsicamente extenuante
(Surez et al., 2009); y mejora el aprendizaje, memoria y defensas
5
antioxidantes del cerebro en ratas recin destetadas, proponiendo a la maca
como un adaptgeno (Or et al., 2011).
Esta planta tambin ha demostrado poseer actividades

inmunomoduladoras, estimulando tanto la respuesta inmune humoral y celular.
Se ha demostrado que la administracin oral del extracto clorofrmico de
maca ecotipo amarillo en ratones Balb/c, conduce a un incremento del ttulo de
anticuerpos y de la capacidad fagoctica, favorece la recuperacin de la
respuesta celular natural en animales inmunosuprimidos con metilprednisona y
estimula la produccin de xido ntrico en cultivos de macrfagos peritoneales.
Resultados similares se obtuvieron con el extracto acuoso (Alzamora, 2003;
Alzamora et al., 2004; 2007).
2.2 HEMATOPOYESIS Y CITOQUINAS
Es el proceso a travs del cual se generan las clulas de la sangre y ocurre

bajo condiciones muy especficas en la llamada mdula sea, donde las
clulas hematopoyticas se desarrollan en un ambiente especfico
denominado microambiente hematopoytico, que consiste en una estructura
tridimensional altamente organizada de clulas del estroma (macrfagos,
fibroblastos, adipocitos, osteoblastos, clulas endoteliales, entre otras), clulas
accesorias (linfocitos) y sus productos (matriz extracelular, citoquinas,
quimiocinas entre otras) que regulan la sobrevida, autorenovacin,
proliferacin, maduracin y migracin de las clulas hematopoyticas y resulta
en una progresin ordenada del sistema hematopoytico. Dicho
microambiente es crucial para la regulacin de la hematopoyesis y la
alteracin de algunos de sus componentes puede contribuir al desarrollo de
enfermedades hematolgicas (Mayani et al., 2007; Ruiz, 2009).
El sistema hematopoytico est formado por diferentes tipos celulares

organizados jerrquicamente, y se pueden agrupar en:
Clulas madre hematopoyticas (CMH) (0.01%), son las ms primitivas

y se distinguen por su capacidad de autorenovacin y
6
multipotencialidad. Solo una pequea parte de su poblacin se
encuentra en ciclo celular (1 al 25%) en consonancia con las
necesidades hematopoyticas del momento, el resto se encuentra en
estado de quiescencia.
Clulas progenitoras hematopoyticas (CPH) (0.5%), han perdido su
capacidad de autorenovacin pero conservan su potencial proliferativo,
pueden ser multi, bi o mono-potenciales. La mayora de ellas (55 al
75%) estn en ciclo celular, por lo tanto son las ms afectadas por las
drogas citotxicas.
Clulas precursoras (>90%) son inmaduras, tienen escasa actividad
proliferativa, pueden ser identificadas en los frotis de mdula sea
Clulas maduras, son diferenciadas, tienen una identidad y funcin
definitiva.
Las clulas progenitoras son las que proliferan a gran escala, proveyendo
billones de clulas sanguneas por da que son necesarias para mantener la
homeostasis en el individuo; pero cuando el nmero de estas clulas
disminuyen, por ejemplo a causa de una terapia mieloablativa, las clulas
madre hematopoyticas son liberadas de su inhibicin y comienzan a dividirse
y diferenciarse segn los requerimientos del organismo (Mera et al., 2007;
Welsch, 2010).
La hematopoyesis no solo puede ocurrir en la mdula sea sino tambin en

rganos fuera de ella, siempre que el lugar contenga clulas estromales donde
se puedan acomodar las CMH/CPH y una produccin local de citoquinas
hematopoyticos que mantengan e induzcan la diferenciacin de CMH/CPH, a
esto se lo conoce como hematopoyesis extramedular y en el humano puede
ocurrir en condiciones patolgicas. A diferencia del humano, la hematopoyesis
extramedular persiste en la vida adulta del ratn y el bazo constituye el
principal sitio de hematopoyesis extramedular, donde las CMH/CPH presentes
en la pulpa roja, no solo circulan sino tambin residen, aunque su nmero es
inferior a los de la mdula sea, ellas contribuyen a la hematopoyesis en
condiciones de estrs, formando colonias macroscpicas que son visibles
como discretos ndulos en la superficie del bazo, por ejemplo como una
7
reaccin compensatoria a la mielosupresin inducida por drogas citotxicas,
ya que la mdula sea se vuelve inadecuada para mantener la hematopoyesis
normal (Oziemlak, 2005; Herbert et al., 2008; Massberg y Von Adrian 2009;
Kim, 2010).
Las citoquinas son piezas claves en la regulacin de la hematopoyesis,

porque son capaces de inducir la sobrevivencia y proliferacin de clulas
progenitoras, conducindolas hacia linajes especficos; adems de ser
responsables de las acciones fisiolgicas de las clulas maduras de la sangre.
Son glicoprotenas, en general de bajo peso molecular, liberadas por las
clulas del estroma y las clulas accesorias y actan como mediadores
celulares, a travs de receptores especficos que se encuentran en la
superficie de la clula diana hematopoytica. La unin de la citoquina a su
receptor inicia una cascada de fosforilacin con la activacin de varias vas de
sealizacin como las JAK/STAT cinasa y RAS/MAP cinasa. Mientras algunas
de ellas tienen un amplio rango de accin sobre muchas progenitoras
primitivas conducindolas a un aumento de todas las lneas celulares y a su
diferenciacin; otras actan de una manera ms restringida, en lneas
celulares especficas comprometidas o diferenciadas (Soto et al., 1999; Roitt et
al., 2008; Abbas et al., 2008).
La Interleuquina 3 (IL-3) tambin conocida como factor estimulador de

colonias de multi-linajes, es producida principalmente por los linfocitos T
activados y acta sobre las clulas progenitoras muy primitivas, expandiendo y
preparando esta poblacin para la exposicin posterior al GM-CSF y otros
factores de crecimiento, estimulando su diferenciacin hacia la lnea mieloide
(Crdova, 2003). Adems, participa en la supervivencia de las clulas
hematopoyticas y regulacin de las funciones efectoras de las clulas
mieloides diferenciadas en su estado terminal. En el ratn, el gen de la IL-3
esta codificada en el cromosoma 11, tiene un tamao de 2.2 Kb y posee 5
exones. Su mRNA tiene un tamao de 849 bp, su cadena polipeptdica
contiene 166 residuos de aminocidos (Nimer y Uchida, 1995; Hara y
Miyajima, 1996; Reddy et al., 2000).
8
El Factor estimulador de colonias de granulocitos y macrfagos (GM-
CSF) induce la diferenciacin y proliferacin de las clulas progenitoras
hematopoyticas de granulocitos/macrfagos. Adems, regula la
supervivencia y funcin de varias lneas celulares maduras (granulocitos,
neutrfilos y clulas dendrticas) y funciona como un mediador inflamatorio,
actuando sobre un nmero de diferentes tipos celulares y modulando su
funcin celular como presentadora de antgeno. Un amplio rango de tipos
celulares puede producir GM-CSF, pero a menudo requieren de estmulos.
Clulas T, macrfagos, clulas endoteliales, fibroblastos y mastocitos son
ejemplos de clulas que secretan GM-CSF luego de una estimulacin. En el
ratn, el gen para GM-CSF est ubicado en el cromosoma 11, con 4 exones y
su mRNA posee un tamao de 1,033 bp. Pertenece a la misma familia de la
IL-3 (Guthridge et al., 1998; Shi et al., 2006; Hercus et al., 2009).
La Interleuquina 7 (IL-7) es una glicoprotena de 20-28 KD, producida por

las clulas estromales del timo, medula sea, y los rganos linfoides
secundarios. Es una citoquina pleitrpica pero no redundante, es decir
absolutamente necesario para el desarrollo de los linfocitos T y B en el ratn, y
T en el humano. Adems, regula la homeostasis perifrica de las clulas T
vrgenes y de memoria. El gen de la IL-7 murino consiste aproximadamente de
42 kb y est localizado en el cromosoma 3, posee 5 exones y su mRNA tiene
un tamao de 2,475 bp (Fry y Mackall, 2005; Huang y Luther, 2012; Ceredig y
Rolink, 2012).
2.3 CICLOFOSFAMIDA
La ciclofosfamida (CF) es una de las drogas alquilantes ms utilizada en

los protocolos quimioterapeticos debido a su amplio espectro antitumoral, en
la prevencin de rechazo de injertos y el tratamiento de algunas enfermedades
autoinmunes; y puede ser empleada sola o en combinacin con otros
productos. Debe ser metabolizada por las enzimas microsomales del hgado
para ejercer sus efectos citostticos, a travs de sus dos metabolitos
alquilantes: Fosforamida y Acrolena. Gran parte de sus efectos se debe a la
inhibicin de replicacin de DNA, por lo que la CF no solo est restringida a las
9
clulas cancerosas sino tambin a otras clulas con proliferacin activa como
los del sistema hematopoytico (CMH/CPH), gastrointestinal, epitelial, folculos
pilosos y las glndulas genitales. Por lo que la quimioterapia conlleva a varios
efectos txicos e implicaciones clnicamente significantes como la leucopenia,
anemia y dao intestinal, causales de la discontinuacin del tratamiento
(Anderson et al., 1995; Liberman et al., 2008; Llopis, 2009).
La supresin de las funciones de la mdula sea o mielosupresin es uno

de los efectos adversos ms frecuentes y limitantes de la administracin de
ciclofosfamida, aunque es reversible implica la interrupcin del tratamiento
hasta que los valores leucocitarios estn dentro del rango normal permitido
para la aplicacin de otra dosis. La supresin de la mdula sea se produce
debido a la constante renovacin de las clulas hematopoyticas, que las hace
muy vulnerables a los citostticos, y se refleja en anemia, leucopenia y
trombocitopenia en los recuentos de sangre perifrica, que pueden llevar a
una inadecuada funcin inmunolgica, infecciones severas e incluso la muerte
(Haubitz, 2007).
Salem et al. (2012) reportaron que la administracin de 4 mg ciclofosfamida

(aproximadamente 150 mg/kg p.c.) a ratones C57BL/6, en dosis nica, induce
una profunda leucopenia en la periferia entre los das 3 a 15, y en bazo y
mdula sea entre los das 3 a 6 (al 9no da hay un rebote, al 12avo da se
evidencia completa recuperacin). En la fase de recuperacin, el retorno a los
valores normales conlleva primero a un incremento significativo de clulas
mieloides en el bazo y mdula sea en el 9no da (efecto rebote), retornando a
los valores normales el 12avo da, los linfocitos B demoran 3 semanas en
recuperarse, de ah la efectividad de la CF en el tratamiento enfermedades
autoinmunes.
Sefc et al. (2003) en un trabajo realizado con ratones C57B1/10SnPh

inoculados con 135 mg/kg de CF, dosis nica, reportaron que la celularidad de
la mdula sea retorn a los valores normales absolutos despus de 6 a 7
das, aunque la composicin celular se mantuvo alterada hasta el da 14. El
mismo patrn se observa en el bazo, donde los eritrocitos y linfocitos son casi
10
eliminados, y el incremento de celularidad del bazo 5 das post-CF se debe
principalmente a la expansin de las clulas mieloides, que est relacionada
con el incremento significativo de las clulas progenitoras en el bazo (que
pasa del 4% al 69%), acompaado con una reduccin de ellas en la mdula.
Actualmente, se estn aplicando estas drogas antineoplsicas en

combinacin con varios agentes detoxificantes e inmunomoduladores, como
son los factores de crecimiento hematopoytico sintticos (G-CSF, GM-CSF,
eritropoyetina, etc) y los agentes citoprotectores (Amifostina) con el fin de
acelerar la recuperacin hematopoytica y/o evitar daos citotxicos, y as
permitir un tratamiento ms drstico y por ende ms eficaz (Krawczenko et al.,
2005; Meenu, 2008; Jena et al., 2010).
2.4 EMPLEO DE PLANTAS COMO PROTECTORES FRENTE A DROGAS

CITOTXICAS
Muchas de las plantas utilizadas en la medicina tradicional poseen efecto

protector demostrado frente a la toxicidad de las radiaciones y drogas,
sugiriendo sus potenciales usos como suplemento alimenticio en pacientes
cuyo sistema hematopoytico se ve alterado por la quimio/radioterapia
(Bhushan y Manish, 2007).
La administracin de los constituyentes de 4 plantas chinas (Frmula Si-

Wu-Tang) en ratones irradiados, result en un incremento del recuento
leucocitario y de todos los progenitores hematopoyticos de la mdula sea,
que son afectados por la irradiacin (Liang et al., 2006). Por otro lado, se
demostr la eficacia de Myelophil que es una mezcla de extractos de Astragali
radix y Salviae radix, en incrementar los parmetros hematolgicos, el
recuento de progenitores hematopoyticos en ensayos clonognicos y sobre-
regular la expresin de IL-3 en el bazo de ratones inmunosuprimidos con una
dosis de 0.3 g/kg de 5-Fluorouracilo (Shin et al., 2008).
Patra et al. (2012) reportaron que la administracin previa de los

componentes fenlicos de la planta oriental Cinnamomum cassia en ratones
11
inmunosuprimidos con 50 mg/kg de CF redujo la hipocelularidad inducida por
CF en el bazo, mdula sea y sangre perifrica, lo que se correlaciona con la
reduccin de clulas hiploides e incremento de los niveles de enzimas anti-
oxidantes, reduciendo el estrs oxidativo heptico y medular producto del
metabolismo de la CF. Otro estudio seal que el extracto acuoso de Polygoni
multiflori rico en polisacridos, es capaz de incrementar significativamente los
niveles de IL-2, parmetros hematolgicos, perfil anti-oxidante y promover la
hematopoyesis esplnica mediante la sobreexpresin del receptor de la
eritropoyetina y el factor de transcripcin GATA-1 en animales
inmunosuprimidos por aplicacin de 40 mg/kg/da de CF durante 5 das
consecutivos (Chen et al., 2012).
Con respecto Lepidium meyenii, se report que el extracto acuoso de maca

ecotipo amarillo en una dosis de 300 mg/kg p.c., favorece significativamente el
incremento de glbulos blancos, hemoglobina y recuento de clulas de mdula
sea) en animales inmunosuprimidos con 50 mg/kg de ciclofosfamida (Torres,
2008), los mismos resultados se observaron con el extracto metanlico de
maca ecotipo morado, sealando por primera vez un posible efecto
estimulador de la maca sobre la hematopoyesis (Alvarez, 2008).
Aunque la administracin de dosis subletales de CF conlleva a una

profunda supresin de la respuesta humoral, celular y de la mdula sea; el
tiempo y duracin de la mielosupresin depende no slo de la dosis empleada,
sino tambin del organismo (edad, estado nutricional, funcionamiento de la
mdula), una recuperacin rpida implica una menor probabilidad de contraer
infecciones severas y continuar con otro ciclo de inmunosupresin.
12
3. HIPTESIS Y OBJETIVOS
3.1 Hiptesis
El extracto acuoso de Lepidium meyenii (maca) estimula la produccin de

mRNA para tres citoquinas hematopoyticas: Interleuquina 3, Factor
estimulador de colonias de granulocitos / macrfagos e Interleuquina 7 en
3.2 Objetivo General
Determinar la produccin de mRNA para citoquinas hematopoyticas (IL-3,

GM-CSF e IL-7) en ratones inmunosuprimidos con ciclofosfamida y
tratados con extracto acuoso de Lepidium meyenii Walpers (maca).
3.3 Objetivos especficos
3.3.1 Elaborar el extracto acuoso de maca y realizar la identificacin

fitoqumica de sus principales componentes.
3.3.2 Determinar la dosis ptima de inmunosupresin con ciclofosfamida en
ratones.
3.3.3 Demostrar el efecto del extracto acuoso sobre la produccin de mRNA
para las tres citoquinas hematopoyticas en el bazo y la mdula sea
de ratones inmunosuprimidos.
3.3.4 Demostrar el efecto modulador del extracto acuoso sobre la
proliferacin celular y produccin de mRNA para las tres citoquinas
hematopoyticas en cultivos de clulas mononucleares de la mdula
sea.
3.3.5 Determinar la influencia del tratamiento con el extracto sobre la
proliferacin de las clulas hematopoyticas de ratones
inmunosuprimidos.
13
4. MATERIALES Y MTODOS
4.1 ELABORACIN DEL EXTRACTO ACUOSO (EAc) DE MACA E

IDENTIFICACIN FITOQUMICA DE SUS PRINCIPALES
COMPONENTES
4.1.1 Elaboracin del extracto acuoso de maca
Se trabaj con hipoctilos de maca, ecotipo amarillo, procedentes del Valle

de Junn, Departamento de Junn. Los hipoctilos de maca fueron
seleccionados segn su estado de conservacin y luego se procedi a
limpiarlos, cortarlos en pequeos trozos, secarlos a 45C por 48 horas y
pulverizarlos con la ayuda de un molino (Figura 1). La harina de maca
obtenida se mezcl con agua destilada (1:10 P/V respectivamente) y se
someti a hervido durante 15 minutos. Luego de enfriar, la mezcla se
centrifug a 2000 rpm x 10 minutos y se recolect el sobrenadante en placas
petri de plstico, en total esterilidad, que fueron puestas dentro de un
deshidratador hasta total evaporacin del agua. El residuo seco, que es el
extracto acuoso deshidratado, se recolect mediante raspado en un frasco y
se almacen a 4C (Figura 2).
Figura 1. Hipoctilos del Lepidium meyenii Walpers (maca), ecotipo

amarillo. Los hipoctilos fueron cortados en pequeos trozos empleando un
procesador de alimentos.
14
Figura 2. Elaboracin del EAc de maca.
A. Sobrenadante proveniente del hervido de la harina de maca.
B. Residuo seco de maca, despus de la evaporacin total del agua.
4.1.2 Identificacin fitoqumica de los principales componentes del EAc
Para la identificacin de algunos de los componentes del EAc de maca, se

prepar una solucin de trabajo, para ello se disolvi el extracto acuoso en
agua destilada a la dosis de 30 mg/ml, que corresponde a la dosis de 200
mg/kg de peso corporal promedio de un ratn. Se utilizaron los procedimientos
descritos en algunos libros de investigacin fitoqumica (Lock, 1994; Sharapin,
2000; Marcano y Hasegawa, 2002).
Carbohidratos. A 2ml de la solucin de trabajo se le adicion 2 gotas del

reactivo de Molish (alfa-naftol al 1% en etanol 95%), y por las paredes del tubo
se deposit cuidadosamente 2 ml de H2SO4 concentrado, la prueba es positiva
para carbohidratos totales si se forma un anillo violeta en la interface. La
identificacin de almidones, se realiz adicionando 2 gotas del reactivo de
Lugol (KI al 0,06% e I al 0,04% en H20dd) a 2 ml de la solucin, la aparicin de
color violeta indica reaccin positiva. Se procedi a determinar la
concentracin de carbohidratos totales presentes en la solucin de trabajo,
15
mediante el mtodo colorimtrico fenol/H2SO4. Para ello se diluy 10 l de la
solucin de trabajo con 990 l de H2Odd, a la dilucin se le adicion 500 l del
reactivo fenol (fenol al 5% en H20dd) y 2,5 ml de H2SO4, despus de mezclar se
dej reposar por 10 minutos en oscuridad, para luego llevar los tubos a bao
mara por 30 minutos a 30C. Cumplido el tiempo se realiz la lectura a 492
nm. La concentracin de carbohidratos en mg/ml se determin usando como
estndar una curva de glucosa.
Protenas. Se mezclaron 250 l de la solucin de trabajo con 2,5 ml del

reactivo Bradford, se dej reposar por 2 minutos y se realiz la lectura a 595
nm en espectrofotmetro. Se determin la concentracin de protenas en
mg/ml mediante una curva estndar para seroalbmina bovina.
Flavonoides. A 2ml de la solucin de trabajo se le adicion 0,5 ml de NaOH al

30%, el cambio de color de la solucin a amarillo intenso es indicativo de la
presencia de flavonoides. Luego se determin la concentracin de flavonoides
(flavonoles y antocianinas) mediante el mtodo de Lees y Francis (1972): A
0,5 gramos del extracto acuoso deshidratado, se le adicion 9,5 ml de alcohol
acidificado (HCl 1,5 N en etanol 95%, en proporcin 85:15 v/v). Se
homogeniz bien y se dej macerar en refrigeracin durante toda una noche.
Al cabo del tiempo, se filtr el macerado con papel Whatman N1 y se
complet el volumen a 100 ml. Despus de incubar la muestra en oscuridad
por 2 horas, se midi la absorbancia del filtrado a 374 nm (flavonoles) y 535
nm (antocianinas) en un espectrofotmeto. Se utilizaron las siguientes
frmulas:
Flavonoles (mg/g extracto) = (A x V) / (98,2 x W)
Antocianinas (mg/g extracto) = (A x V) / (76,5 x W)
Donde:
A = Absorbancia
V = Volumen total del extracto en ml
W = Peso de la muestra en gramos
16
Alcaloides. Se disolvieron 0,5 gramos del extracto acuoso deshidratado en 10
ml de HCl 10% y se calent la mezcla por 10 minutos a 60 C. Despus de
dejar enfriar, se filtr la mezcla con papel Whatman N1 y se procedi a lavar
el papel filtro con 10 ml de HCl 10%. El filtrado resultante se utiliz para las
pruebas de alcaloides, en donde a cada 2 ml del filtrado se aadi 3 gotas del
reactivo de Hager (cido pcrico saturado) o Mayer (MgCl2 al 1.4% y KI al 5%
en H2Odd). Se consideran como positivas, las pruebas en las que aparece una
turbidez definida (Mayer) o precipitado blanquecino (Hager y Mayer).
Triterpenos / esteroles. Se disolvieron 0,5 gramos del extracto en 3 ml de

H2SO4 y se dej macerar durante 10 minutos. Se tom 1 ml de la suspensin y
se mezcl con 1ml de anhidrido actico, se formaron 2 fases. La presencia de
un anillo guinda en la interfase es indicativo de triterpenos y de una fase
superior verdosa es indicativo de esteroles (Lpez-Casamayor, 2007).
Taninos. A 1 ml de la solucin de trabajo se le adicion 250 l de solucin

FeCl3 (FeCl3 al 5% en HCl 0,5N), el viraje de color a azul-negruzco o pardo-
verdoso es indicativo de la presencia de taninos.
Saponinas. Se tomaron 10 ml de la solucin de trabajo, se agit

vigorosamente por 5 minutos. La prueba se considera positiva si aparece
espuma en la superficie del lquido de ms de 2 mm de altura y persiste por
ms de 2 minutos.
Todas las lecturas de absorbancia se hicieron empleando el espectrofotmetro

UNICO 1100.
17
4.2 INMUNOSUPRESIN EXPERIMENTAL CON CICLOFOSFAMIDA
4.2.1 Animales de experimentacin
Se utilizaron ratones hembras Balb/c, de 4 semanas de edad, con pesos

promedios de 25 gramos, procedentes del Instituto Nacional de Salud y se
observaron durante una semana para confirmar su buen estado de salud.
Todos los ratones fueron mantenidos en condiciones estndar de temperatura,
humedad y luz y recibieron ad libitum agua y alimento balanceado para
roedores (UNALM). El manejo de los animales se hizo en base al cdigo de
tica sobre experimentacin animal y en los principios ticos internacionales
que guan la investigacin biomdica con animales.
4.2.2 Determinacin de la dosis ptima de inmunosupresin con

ciclofosfamida
El inmunosupresor empleado fue la ciclofosfamida en polvo estril

(NEOPHOS 200). Se trata de una droga antineoplsica sinttica, del tipo de
las mostazas nitrogenadas; se presenta como un polvo blanco cristalino,
soluble en agua, solucin fisiolgica y etanol. Su nombre qumico es 2-[bis (2-
cloroetil) amino] tetrahidro-2H-13,2-oxazafosforina 2-oxido monohidrato; su
frmula molecular es C7H5C12N2O2PH2O y su peso molecular es 279,1. Este
profrmaco requiere su bioactivacin en los microsomas hepticos para
ejercer su mecanismo de accin, que se basa en la alquilacin de las bases
nitrogenadas del DNA. La alquilacin provoca la prdida de la configuracin
espacial de las cadenas de DNA e imposibilita su sntesis durante la mitosis y
de esta forma ocasiona la muerte celular.
Con la finalidad de escoger la dosis adecuada para inducir supresin de la

funcin de la mdula sea sin poner en riesgo la vida del animal, y evaluar los
resultados en la fase inicial de recuperacin post-inmunosupresin con
ciclofosfamida (post-IS), se realiz un estudio piloto con tres ratones cada
grupo, probando tres dosis diferentes de ciclofosfamida: 65, 130 y 200 mg/kg
de peso corporal (pc), en un volumen de 0,2 ml y por va intraperitoneal. La
18
evaluacin se realiz a los 2, 5 y 7 das despus de la inmunosupresin, se
obtuvieron suspensiones celulares de la mdula sea de los fmures de cada
ratn y se realiz el recuento al microscopio, utilizando una cmara de
Neubauer de las suspensiones medulares diluidas en solucin de TURK, que
hemolisa a los eritrocitos. Se eligi la dosis de 130 mg/ kg pc de ciclofosfamida
y realizar la evaluacin a los 2 y 5 das despus de la inmunosupresin.
4.2.3 Tratamiento con el extracto acuoso de maca
Se formaron 6 grupos de 12 ratones cada uno, de acuerdo a la siguiente

relacin:
Grupo IS2d EAc : Inmunosuprimidos, evaluados 2 das

despus de la inmunosupresin, recibieron tratamiento con EAc de maca
Grupo IS2d Sin EAc : Inmunosuprimidos, evaluados 2 das
despus de la inmunosupresin, no recibieron tratamiento con EAc de
maca
Grupo IS5d EAc : Inmunosuprimidos, evaluados 5 das
despus de la inmunosupresin, recibieron tratamiento con EAc de maca
Grupo IS5d Sin EAc : Inmunosuprimidos, evaluados 5 das
despus de la inmunosupresin, no recibieron tratamiento con EAc de
maca
Grupo EAc : No inmunosuprimidos, recibieron
tratamiento con EAc de maca
Grupo Sin EAc : No inmunosuprimidos, no recibieron
tratamiento con EAc de maca
Se prepar una dilucin del extracto acuoso (EAc) deshidratado, en agua

bidestilada estril a una dosis de 200 mg/kg de peso corporal (p.c). La dosis
de EAc contenida en un volumen de 0,2 ml, se aplic diariamente por va oral,
en una solo dosis, a los ratones de los grupos IS2d-EAc, IS5d-EAc y EAc
durante todo el experimento, que tuvo una duracin de 2 meses (Figura 3).
Los otros 3 grupos (IS2d-Sin EAc, IS5d-Sin EAc, Sin EAc) slo recibieron
agua. La inmunosupresin se realiz en la ltima semana del experimento; los
19
grupos IS2d-EAc, IS2d-Sin EAc, IS5d-EAc e IS5d-Sin EAc recibieron una
dosis de 130 mg/kg de peso corporal de ciclofosfamida (NEOPHOS 200)
contenida en 0,2 ml, por va intraperitoneal. Los ratones de los grupos IS2d-
EAc e IS2d-Sin EAc fueron sacrificados por dislocacin cervical, 2 das
despus de la inmunosupresin. A diferencia de los ratones de los grupos
IS5d-EAc e IS5d-Sin EAc, que fueron sacrificados 5 das despus de la
inmunosupresin. El protocolo de tratamiento con el extracto acuoso para los
ratones inmunosuprimidos y no inmunosuprimidos se presenta en la Tabla 1.
Figura 3. Administracin del extracto acuoso de maca a los ratones.
20
Dosis Extracto
MES SEMANA
(200 mg/kg p.c.)
1 Si
2 Si
1
3 Si
4 Si
5 Si
6 Si
7 Si
1 Si
Si / Inmunosupresin con CF
2
(130 mg/kg pc)
2
3 Si
Si / Evaluacin de grupos
8 DA 4
IS2d EAc e IS2d Sin EAc
5 Si
6 Si
Si / Evaluacin de grupos
7
IS5d EAc e IS5d Sin EAc
Tabla 1. Protocolo empleado para el tratamiento con el extracto acuoso de

maca en ratones hembras balb/c. La inmunosupresin con CF se realiz en la
ltima semana del experimento.
4.2.4 Determinacin del dao hepatocelular producido por CF en los

animales de experimentacin
Puesto que el hgado es un lugar primario de biotransformacin de

compuestos extraos, tambin es particularmente vulnerable a ellos. Con el
objetivo de comprobar que el consumo del extracto acuoso de maca
preparado en este experimento no result txico para los ratones y evaluar si
tiene algn efecto protector frente al dao heptico producido por la
ciclofosfamida, se midieron los niveles sricos de la transaminasa glutmico
pirvica (TGP).
21
Las transaminasas son enzimas que catalizan la transferencia reversible de
un grupo amino entre un aminocido y un cetocido. La transaminasa
glutmico pirvica (TGP) es una enzima citoslica que se encuentra en altas
concentraciones en el hgado. La lesin hepatocelular desencadena la
liberacin de esta enzima en la circulacin, por lo que constituye un excelente
marcador de la lesin hepatocelular (Alvarez, 2005).
Al finalizar el experimento, se tomaron muestras de sangre por puncin

cardiaca en tubos sin anticoagulante de cada animal. Los tubos se
centrifugaron a 3500 rpm por 10 minutos para la obtencin del suero. Los
niveles sricos de la TGP se determinaron segn el procedimiento sealado
en el inserto del Kit diagnstico Transaminasas color (Valtek diagnostic). El
fundamento del mtodo es el siguiente: Las transaminasas del suero
reaccionan con el substrato, formando el producto piruvato que reacciona con
2,4 dinitrofenilhidrazina, generando en medio alcalino una hidrazona coloreada
que se lee a 505 nm. La cantidad de transaminasas en el suero se determin
por interpolacin de las absorbancias en la curva de calibracin del reactivo
estndar. Se descartaron las muestras con hemolisis visible, ya que se pueden
obtener valores falsamente elevados.
4.3 EVALUACIN DEL EFECTO MODULADOR DEL EAc DE MACA SOBRE

LA PRODUCCIN DE mRNA PARA IL-3, GM-SCF e IL-7 EN EL BAZO Y
LA MDULA SEA DE RATONES INMUNOSUPRIMIDOS
4.3.1 Anlisis semicuantitativo de la expresin de mRNA de las

citoquinas IL-3, GM-SCF e IL-7 del bazo
Las suspensiones del bazo fueron obtenidos por presin del rgano con
ayuda de un mbolo para disgregar el tejido y liberar las clulas, dentro de una
placa petri con 5 ml de medio RPMI. Se juntaron las suspensiones celulares
de 3 ratones por grupo (se tomaron 500 l de suspensin del bazo de cada
ratn), para proceder a extraer el RNA con Trizol, determinar su integridad por
22
electroforesis, su pureza y concentracin por espectrofotometra y realizar la
transcripcin reversa para la sntesis de DNA complementario.
4.3.1.1 Extraccin de RNA
La extraccin de RNA se realiz mediante el mtodo de fenol-cloroformo

usando el reactivo Trizol (InvitrogenTM, Life Technologies) segn el protocolo
establecido por Invitrogen. Todos los materiales de plstico utilizado en la
extraccin, eran libres de RNasas, tratados con NaOH 0,5 M y autoclavados,
para evitar la degradacin del RNA. Las centrifugaciones se realizaron a 4C
en un microcentrfuga refrigerada.
Al finalizar el experimento, se obtuvieron suspensiones celulares del bazo

que fueron recolectadas en crioviales estriles que se centrifugaron a 1500
rpm por 3 minutos. Despus se elimin el sobrenadante y se adicion 500 l
de Trizol, luego de 5 minutos de incubacin se aadi 100 l de cloroformo y
se centrifugaron los crioviales por 15 minutos a 15000 rpm, obtenindose tres
fases. La fase superior acuosa que contiene el RNA se retir a otro criovial,
sobre el cual se adicion 250 l de alcohol isoproplico para precipitar el RNA,
formndose un pellet. El RNA precipitado se lav dos veces con etanol al 70%,
y se dej secar por 10 minutos, luego de resupenderlo en 50 l de agua para
PCR, se separaron en alicuotas y almacenaron a -20C.
4.3.1.2 Determinacin de la integridad, pureza y concentracin del RNA

extrado
La integridad de las muestras del RNA extrado fue verificada a travs de

electroforesis en gel de agarosa al 1,5 %. Se mezclaron 6 l de RNA con 4 l
de formamida y 2 l de buffer de carga (0,25 % de azul de bromofenol, 50% de
glicerol, EDTA 1 mM) dentro de crioviales, que se incubaron en bao mara a
60C por 3 minutos y se pas rpidamente al hielo. Se tom 10 l de cada
mezcla para cargar los pocillos del gel de agarosa en buffer TAE 1X (40 mM
tris, 20 mM cido actico, 1 mM EDTA, ph 7,7). La electroforesis se llev a
cabo a 100 voltios por 60 minutos, al finalizar los geles fueron teidos con
23
bromuro de etidio (0,5 g/ml) por 5 minutos. El RNA se observ en un
transiluminador con radiacin UV (Biometra TI 1). Debido a que el mRNA
comprende el 1-3% del RNA total, es difcil detectarlo incluso con los mtodos
ms sensible; por otra parte, el RNA ribosomal comprende ms del 80% y la
mayora son las subunidades 18s y 28s, con un peso molecular aproximado de
2 kb y 5 kb respectivamente. La presencia de dos bandas definidas (18s y 28s
de los RNA ribosomales) es indicativa de la integridad del RNA (Figura 4).
Figura 4. Electroforesis de los RNA totales de las muestras analizadas.

Las fechas sealan la presencia de dos bandas de RNA ribosomales, en
los carriles 3, 4, 6 y 7. El primer carril corresponde al marcador de 1kb 10
kb.
La pureza y concentracin del RNA extrado fue determinado mediante

espectrofotometra UV (UNICO modelo 2100 UV). Se prepar una dilucin
1:200 en buffer TE (10 mM tris, 1 mM EDTA, ph 7,5) estril y se midi la
absorbancia en el espectrofotmetro a 260 nm y 280 nm. Con los valores de
absorbancia se calcularon la pureza y concentracin de RNA, a partir de las
siguientes ecuaciones:
24
Pureza de RNA = A260 / A280
Valores entre 1,8 - 2 considera que el RNA extrado est libre de
contaminantes (protena, sales)
Concentracin RNA (g/l) = (A260 x 40 x Factor de dilucin) / 1000

Dado que 1 unidad de Absorbancia (A) a 260 nm corresponde a 40 g/ml
de RNA
Se consideraron las muestras de RNA que alcanzaron buenos estndares

de integridad, calidad y cantidad (Rapley y Manning, 1998).
4.3.1.3 Sntesis de DNA complementario (cDNA)
El RNA extrado fue sometido a una transcripcin reversa para la sntesis

de cDNA, para lo cual se emple el Kit High capacity RNA-to-cDNA (Applied
Biosystems), siguiendo las instrucciones del protocolo. Este Kit permite la
sntesis de DNA en solo dos pasos, ya que entre sus componentes se tiene al
Buffer mix RT 2X (contiene los dNTPs, random primers) y la Enzima mix RT
20X (contiene la enzima transcriptasa reversa MultiscribeMuLV, protena
inhibidora de RNAsas). Brevemente, a 40 l de la mezcla RT (25 l de Buffer
mix RT 2X, 2,5 ul Enzima mix RT 20X y 12,5 l de H20) se le aadi 10 l de
RNA (0,2 g/l) de manera que la concentracin final de RNA sea 0,04 g/l.
Esta mezcla se someti a un ciclo de sntesis de cDNA a 37C por 60 minutos
y a un ciclo final de desnaturalizacin de la enzima a 95C por 5 minutos en el
termociclador (Bioer). Una vez que terminaron los ciclos, el cDNA se almacen
a - 20C.
4.3.1.4 Eleccin de los Primers
Despus de hacer una seleccin exhaustiva considerando el tipo de tejido

analizado y la metodologa empleada, se escogieron aquellos primers que se
ajusten a los parmetros sugeridos para el diseo de primers (Apndice IV del
protocolo Power SYBR Green Cells-to-CT Kit). Se realiz un bsqueda
bibliogrfica de secuencias de primers utilizados para cada uno de los
25
transcritos de los genes murinos de IL-3, IL-7, GM-CSF y Gliceraldehdo 3
fosfato deshidrogenasa (GAPDH), donde el ltimo fue considerado como
control de expresin constitutiva (housekeeping) para normalizar los
resultados del PCR en tiempo real (Ullmannovi y Haakovec, 2003; Willems et
al., 2006).
Las eficiencias de los primers se probaron virtualmente mediante Primer

BLAST disponible en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast., el cual
emplea el software Primer 3 para disear los oligonocletidos y despus los
analiza en BLAST para evitar la formacin de dmeros as como hibridaciones
inespecficas (Figura 5) (Ye et al., 2012). Alternativamente, los primers fueron
analizados mediante la herramienta bioinformtica Oligoanalyzer 3,1 para
verificar el contenido de G-C, formacin de hetero - y homo - dmeros,
formacin de horquillas y la determinacin de su Tm, con el fin de obtener
unos primers ptimos (Cano et al., 2010). Finalmente, los primers se enviaron
a sintetizar a la casa comercial Invitrogen Life Technologies . La secuencia
de los primers, el tamao esperado de los productos amplificados para cada
transcrito y el nmero de acceso en el GenBank, se enlistan en la Tabla 2.
26
Figura 5. Resultado del anlisis de los primers para IL-3 mediante el
Software Primer-Blast.
Tamao del
Nombre N de acceso
Secuencias de los primers (5 - 3) amplicn esperado
del Gen Gen Bank
(pares de bases)
FW: TACATCTGCGAATGACTCTGC NM_010556.4

IL-3 132
RV: GGCTGAGGTGGTCTAGAGGTT
FW: ACCACCTATGCGGATTTCAT NM_009969-4

GM-CSF 146
RW: TCATTACGCAGGCACAAAAG
FW: GTGCTGCTCGCAAGTTGAAG NM_008371.4

IL-7 102
RW: AGTTCACCAGTGTTTGTGTGC
FW: TGCACCACCAACTGCTTAGC
GAPDH 258 NM_008084
RV: GGCATGGACTGTGGTCATGAG
Tabla 2. Secuencias de los primers empleados para el RT-PCR en tiempo real
27
Con el fin de evaluar la especificidad de los primers sintetizados, se
realizaron amplificaciones por PCR convencional de los genes evaluados, esto
adems permiti corroborar la calidad de los RNA totales obtenidos, as como
analizar la eficiencia de la transcripcin reversa. Las amplificaciones
obtenidas se evaluaron mediante electroforesis en gel de agarosa 2%, teido
con bromuro de etidio. Las condiciones de amplificacin por PCR convencional
se explican ms adelante.
Por comparacin con el marcador de peso molecular incluido en el gel, se

pudo establecer que los productos amplificados correspondieron al tamao
esperado en todas las reacciones. El tamao de las bandas fueron
determinadas con el Programa de anlisis de imagen TotalLab Quant (Figura
6).
Figura 6. Amplificacin por PCR convencional con los primers especficos

para los genes evaluados. El primer carril corresponde al marcador de
peso molecular de 100 1000 pares de bases.
28
4.3.1.5 Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)
El cDNA sintetizado fue posteriormente amplificado mediante PCR

convencional. La reaccin del PCR se prepar en un volumen final de 25 l, en
una mezcla de reaccin que contena: 1 l de cDNA, 2,5 l de Buffer PCR 10X
(Appied Biosystems), 0,5 l de MIX dNTP 10 mM, 1,5 l de MgCl 15 mM
(Applied Biosystems), 1 l de cada uno de los primers (forward y reverse, 10
l), 0,25 l de Taq-polimerasa (5U/l) (Invitrogen TM Lifes Technologies) y
17,25 l de H20 para PCR.
Las amplificacin del cDNA se realiz en un termociclador (Bioer) y las

condiciones fueron: un paso de 94C por 5 minutos (desnaturalizacin inicial) y
35 ciclos de 94C por 30 s (desnaturalizacin), 55C por 30 s (alineamiento) y
72C por 45 s (extensin). De los 25 l del volumen total de reaccin de PCR
se tomaron 4 l y se mezclaron con 1 l de buffer de carga (0,25 % de azul de
bromofenol, 50% de glicerol, EDTA 1 mM).
Los productos obtenidos se separaron en geles de agarosa horizontal al

2% por electroforesis en buffer TAE 1X (40 mM Tris, 20 mM cido actico, 1
mM EDTA, ph 7,7) a 100 voltios durante 50 minutos. Despus de la corrida,
los geles fueron teidos con bromuro de etidio (0,5 g/ml) y las bandas
resultantes se visualizaron en un transiluminador de luz UV (Biometra TI 1)
que fueron fotografiadas con una cmara digital. Las imgenes digitales
obtenidas en color real fueron seleccionadas y transformadas en una imagen
en escala de grises, para estimar la intensidad de las bandas por
densitometra de una manera indirecta, midiendo el nivel de gris medio de las
bandas (Arrebola, 1999). Todo esto se realiz mediante el Programa de
anlisis de imagen TotalLab Quant (www.totallab.com/products/totallabquant/)
(Figura 7). Todos los valores, expresados en niveles de gris, fueron
normalizados a su respectivo gen de referencia (GAPDH) como sigue:
29
Nivel de gris Gen de estudio
% cambio en la expresin = x 100
Nivel de gris Gen de referencia
Figura 7. Programa de anlisis de imagen TotalLab Quant. Las bandas

corresponden al amplificado del transcrito del gen GM-CSF
4.3.2 Anlisis cuantitativo de la expresin de mRNA de las citoquinas

IL-3, GM-SCF e IL-7 de la mdula sea
Las suspensiones de mdula sea (5 ml/ratn) se obtuvieron de los

fmures de los ratones evaluados. Se juntaron las suspensiones celulares de
3 ratones por grupo (500 l por suspensin), para proceder a extraer el RNA
con Trizol, determinar su integridad por electroforesis, su pureza y
concentracin por espectrofotometra y realizar la transcripcin reversa para la
sntesis de DNA complementario, utilizando la metodologa anteriormente
sealada.
30
4.3.2.1 Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real
La expresin gnica de IL-3, GM-SCF, IL-7 y GAPDH fue evaluada por

PCR en tiempo real utilizando un equipo ROTOR GENE 3000 (Corbett
Research, Mortlake, Australia) Para la prueba se emplearon los primers
especficos para cada gen, el cDNA sintetizado y el reactivo Master Mix Power
SyBrGreen PCR (Applied Byosistem) que contiene todos los componentes
necesarios para la amplificacin (AmpliTaq Gold DNA polimerase LD,
SybrGreen I, dNTPs, referencia interna pasiva). Se siguieron las instrucciones
del protocolo establecido para el kit Power SYBR Green Cells-to-CT.
Se realiz la siguiente mezcla de reaccin en tubos pticos: 10 l de

Master Mix, 1 l de cada primer (Forward y Reverse, 10 M) y 4 l de Agua
para PCR. A cada mezcla se aadi 4 l de cDNA (diluido 1:3 con agua para
PCR). El volumen final fue de 20 l, y las concentraciones finales de cada
primer y cDNA fueron de 500 nM y 2.7 ng/l (si se considera una
retrotranscripcin 100% eficiente), respectivamente; los controles fueron los
tubos con la mezcla de reaccin y agua pura en vez de cDNA. Las muestras
fueron corridas por triplicado y en dos ocasiones separadas, las condiciones
de PCR utilizadas fueron las mismas para los cuatro genes: Activacin de la
enzima (95 por 10 minutos), 40 ciclos de PCR (95C por 15 segundos y 60C
por 1 minuto) y por ltimo la curva de disociacin (melting), que incluye un
calentamiento gradual cada 0,1C, desde 50 a 99C.
El SYBR Green es un flourocromo que tiene la propiedad de unirse a toda

molcula de DNA de doble cadena, de manera inespecfica, por lo que el
incremento de la seal de fluorescencia es proporcional a la cantidad de DNA
de doble cadena presente en la reaccin. Sin embargo esta inespecificidad
puede resultar en falsos positivos porque se puede unir a dmeros de primers.
Una forma de asegurar la especificidad de la reaccin es analizando las
curvas de disociacin o de melting. La curva de disociacin se basa en una
gradiente de temperaturas crecientes, que permite monitorizar la cintica de
disociacin de los fragmentos amplificados a partir de su temperatura de
disociacin (Tm) que es especfica para cada fragmento amplificado, ya que
31
depende del tamao de los amplicones y secuencia de los mismos (contenido
de G y C). La presencia de dos o ms picos sugiere que se ha obtenido ms
de un amplificado y que el proceso de amplificacin no fue especfico para el
DNA blanco (Erali y Wittwer, 2010).
Se consideraron aquellas muestras que mostraron un solo pico en el

anlisis de la curva de disociacin (Figura 8). El Tm aproximado para cada uno
de los amplificados fue:
IL 3 : 75,5 C
GM CSF : 80,3 C
IL 7 : 75,6 C
GAPDH : 84,4 C
Figura 8. Curva de disociacin correspondiente a los fragmentos

amplificados del transcrito del gen IL-7, se observa un solo pico con un Tm
aproximado de 75,6C en todas las muestras analizadas para IL-7.
32
La recoleccin y anlisis de los datos generados fueron realizados
mediante el Rotor Gene Software (versin 1.7) y se utiliz el Mtodo de
Cuantificacin Comparativa incluido en el software. Utilizando ste mtodo ya
no es necesario escoger arbitrariamente el nivel del umbral para generar los Ct
(valor umbral de ciclo) y tampoco realizar una curva estndar de eficiencia por
cada gen analizado, requeridos para calcular la expresin gnica. Este
programa utiliza el criterio del mximo de la segunda derivada, para calcular el
punto inicial y final de la fase exponencial de la amplificacin de cada reaccin,
y obtener matemticamente la eficiencia de amplificacin (AE) y el Take Off
Point (TOP) por cada muestra, ste ltimo equivalente al Ct otra ventaja es
que ambos valores son calculados dentro de la fase exponencial de cada
reaccin. TOP es definido como el ciclo en el que la segunda derivada de la
fluorescencia est al 80% del valor mximo de la curva, y AE es el incremento
promedio de cuatro ciclos de amplificacin despus del TOP, es determinado
a partir de la pendiente de la curva entre TOP y el valor mximo (Figura 9)
(McCurdy et al., 2008).
Figura 9. Grfico de la segunda derivada de la fluorescencia emitido por

cada reaccin, mediante el anlisis del Mtodo de Cuantificacin
Comparativa del software Rotor Gene (versin 1.7).
33
Los valores AE y TOP generados, fueron usados en el modelo matemtico
descrito por Pfaffl, M. (2001) para calcular la cuantificacin relativa de la
expresin gnica, segn la frmula:
(EA blanco) TOP blanco

Cuantificacin relativa =
(EA referencia) TOP referencia
Donde:
EA blanco : Es la eficiencia de amplificacin del gen en estudio (IL-

3, GM-CSF, IL-7)
EA referencia : Es la eficiencia de amplificacin del gen de referencia
(GAPDH)
TOP blanco : TOP control - TOP tratamiento, del gen en estudio
TOP referencia : TOP control - TOP tratamiento, del gen de referencia
Los clculos se realizaron con los promedios de los AE y TOP generados

por muestra, ya que fueron corridos por triplicado. Aquellas muestras con
valores de amplificacin (AE) menores que 1,5 o mayores de 2 fueron
descartadas (Figura 10).
34
Figura 10. Grfico de la segunda derivada generado por el software Rotor
Gene, para los fragmentos amplificados del transcrito del gen IL-7.
4.4 EVALUACIN DEL EFECTO MODULADOR DEL EAc DE MACA SOBRE

LA PROLIFERACIN CELULAR Y PRODUCCIN DE mRNA PARA IL-3,
GM-SCF e IL-7 EN CULTIVOS DE CLULAS MONONUCLEARES DE LA
MDULA SEA
4.4.1 Determinacin de la dosis ptima del EAc sobre la proliferacin

celular
4.4.1.1 Preparacin de la dosis
Se pes el extracto obtenido y se diluy en medio de cultivo DMEM

suplementado con L-glutamina 2mM, HEPES 10 mM, bicarbonato de sodio
2g/L, gentamicina 50 g/ml y estreptomicina 100 g/ml. El preparado se
esteriliz empleando un filtro milipore 0.2 m (CA-membrane). Se prepar una
dosis patrn de 400 g/ml, a partir de la cual se hicieron las diluciones
respectivas para usarlas en los cultivos. Se evaluaron las dosis de 50, 100 y
200 g/ml.
35
4.4.1.2 Obtencin de clulas mononucleares de mdula sea
Los ratones fueron sacrificados por dislocacin cervical y se extrajeron los

fmures de cada ratn. Se cortaron ambos extremos de cada hueso con un
bistur y se utilizaron agujas N 25 con jeringa de 10 ml llenos de medio RPMI-
1640 para obtener la mdula sea, al pasar la jeringuilla por medio del canal
del fmur (por desplazamiento de volmenes con el medio) (Figura 11). El
contenido se recolect en tubos estriles y se disgreg por pipeteo continuo.
La suspensin celular (10 ml) se deposit sobre 4 ml de Ficoll-Hypaque en
tubos cnicos y se centrifugaron a 2500 rpm por 25 minutos. Se extrajo la
capa de clulas mononucleares, succionando cuidadosamente con una pipeta,
y seguidamente se lavaron tres veces mediante centrifugacin a 1000 rpm por
5 minutos. Despus de la ltima centrifugacin se resuspendi el taco celular
en medio de cultivo completo (DMEM suplementado con suero bovino fetal
10%, L-glutamina 2mM, HEPES 10 mM, bicarbonato de sodio 2g/L,
gentamicina 50 g/ml y estreptomicina 100 g/ml), se realiz el recuento de
clulas vivas de la suspensin obtenida mediante el colorante vital Azul de
Tripn en una cmara de Neubauer y se diluy la suspensin celular a la
concentracin de 1 x 106 clulas/ml. Todo el proceso se realiz en completa
esterilidad.
Figura 11. Obtencin de la mdula sea de los fmures de los ratones.
36
4.4.1.3 Cultivo de clulas mononucleares de mdula sea
Se realizaron en placas de 24 pocillos, por triplicado y en un volumen final

de 0,5 ml. En cada pocillo se mezclaron 250 l de la suspensin celular (1 x
106 clulas/ml) y 250 l del medio de cultivo completo conteniendo el extracto
acuoso preparado, en las dosis finales de 50, 100 y 200 g/ml (tratadas). Se
consider como control los cultivos sin EAc. Las placas se colocaron dentro de
una incubadora con 5% de CO2, a una temperatura de 37C y en un ambiente
hmedo, durante 48 horas. Se realiz un recuento diario de todos los cultivos
con azul de Tripn, para comprobar la viabilidad celular.
4.4.1.4 Medicin de la proliferacin celular
Se realiz mediante el ensayo colorimtrio del MTT, que se basa en la

reduccin metablica del Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-
difeniltetrazol (MTT) a un compuesto insoluble de color violeta (formazn),
realizada por la enzima mitocondrial succinato-deshidrogenasa. Este mtodo
es muy utilizado para medir supervivencia y proliferacin celular. La cantidad
de clulas vivas es proporcional a la cantidad de formazn producido (Figura
12) (Mosmann, 1983).
Figura 12. Ensayo del MTT. El formazn formado es disuelto con

solubilizantes (DMSO, alcohol isoproplico, etc.) y la intensidad de la
coloracin es proporcional a la cantidad de clulas vivas.
37
Al cabo del periodo de incubacin, se aadi a cada pocillo 50 l de MTT
(Sigma Chemical Co., St Luis, Mo) a la concentracin de 5 g/ml, y las placas
volvieron a la incubadora toda la noche en las mismas condiciones de cultivo.
Al da siguiente se retir cuidadosamente todo el medio de cultivo de cada
pocillo, se aadi 1 ml de alcohol isoproplico y se mezcl hasta disolver los
precipitados formados (formazn), producto del metabolismo de MTT.
Despus de 4 horas de incubacin a oscuridad, se realizaron las lecturas a
540 nm para determinar sus absorbancias (Abs). El porcentaje de proliferacin
se obtuvo con la siguiente frmula:
(Abs Tratadas - Abs Control)

Porcentaje de proliferacin = x 100
Abs Control
Abs = Absorbancia
4.4.2 Anlisis de la expresin del mRNA de las citoquinas

hematopoyticas IL-3, GM-CSF e IL-7
Se volvieron a realizar los cultivos con la dosis de EAc que mejor estimul
la proliferacin y en las mismas condiciones sealadas, para la obtencin de
los RNA totales en tres periodos de tiempo: 2 horas, 18 horas y 48 horas de
cultivo. Se consideraron estos tiempos con el fin de observar el curso del nivel
de expresin gnica: 0 horas es el nivel basal donde an no se registra una
expresin significativa, 18 horas es donde se da el mayor porcentaje de
expresin gnica (70%) y 48 horas donde no se registrara una expresin
significativa, porque los mRNA fueron traducidos a protenas (Denzler et al.,
2010).
Al cumplir el tiempo de cultivo establecido, los sedimentos celulares de

cada pocillo de la placa de cultivo, se resuspendieron con su mismo medio y
se recolectaron en crioviales estriles para proceder a extraer el RNA con
Trizol, determinar su integridad por electroforesis, su pureza y concentracin
38
por espectrofotometra y realizar la transcripcin reversa para la sntesis de
DNA complementario, utilizando la metodologa anteriormente sealada.
La medicin de la expresin gnica a nivel de mRNA de IL-3, IL-7, GM-

SCF y GAPDH se realiz por PCR en tiempo real utilizando el equipo ROTOR
GENE 3000 (Corbett Research, Mortlake, Australia). Se evalu la especificidad
de la amplificacin para cada uno de los fragmentos de los genes investigados
mediante el anlisis de la curva de disociacin.
La recoleccin y anlisis de los datos generados se hicieron mediante el

software Rotor Gene (versin 1.7) y se utiliz el Mtodo de Cuantificacin
Comparativa incluido en el software.
4.5 EVALUACIN DE LA INFLUENCIA DEL TRATAMIENTO CON EL EAc

DE MACA SOBRE LA PROLIFERACIN DE LAS CLULAS
HEMATOPOYTICAS DE RATONES INMUNOSUPRIMIDOS
4.5.1 Recuento de clulas nucleadas de la mdula sea y sangre

circulante
Al final del tratamiento con el extracto acuoso de maca se obtuvieron

suspensiones celulares de la mdula sea de los fmures de cada ratn, al
cortar los extremos de cada hueso con un bistur y pasar una jeringuilla con 5
ml de medio RPMI por el medio del canal del fmur. El contenido (5 ml/ratn)
se recolect en tubos estriles y se disgreg mecnicamente por pipeteo
continuo. Las muestras de sangre se extrajeron por puncin cardiaca y se
colectaron de forma individual en tubos con EDTA. Para facilitar el recuento
total, se realizaron diluciones de las suspensiones medulares (1/10) y
muestras sanguneas (1/20) en solucin de TURK, que hemolisa los
eritrocitos. La celularidad se determin por recuento al microscopio utilizando
una cmara de Neubauer.
Se realiz un frots de una gota de sangre sobre un portaobjeto, que

posteriormente fue teida con el colorante Wright. La identificacin de las
39
diferentes poblaciones leucocitarias (blastos, granulocitos, linfocitos y
monocitos) se realiz a travs del microscopio con objetivo 100X, los valores
expresados en porcentajes se multiplicaron por el recuento total, para obtener
las poblaciones leucocitarias en nmero absoluto. Alteraciones importantes en
el nmero de leucocitos, conlleva a conocer no slo frmula porcentual, sino,
tambin los valores absolutos de cada tipo celular, para as evitar falsas
interpretaciones.
4.5.2 Evaluacin de la hematopoyesis en el bazo
A lo largo de la vida adulta del ratn y otros mamferos, el bazo contribuye

a la hematopoyesis en condiciones de estrs (hematopoyesis extramedular)
por ejemplo, como una reaccin compensatoria a la mielosupresin inducida
por drogas, ya que la mdula sea se vuelve inadecuada para mantener una
hematopoyesis normal. Las clulas progenitoras hematopoyticas presentes
en el bazo, proliferan formando colonias macroscpicas que son visibles como
discretos ndulos en su superficie (Soto et al., 1999).
La evaluacin de la hematopoyesis esplnica, se realiz mediante el

ensayo de las unidades formadoras de colonias endgenas en la superficie del
bazo (CFU-S). Al trmino del tratamiento, se fijaron los bazos de los ratones
en solucin Bouin por 24 horas a 4C, luego se lavaron con agua corriente
hasta que el agua deje de ser amarilla. Tras el lavado, se cont el nmero de
colonias macroscpicas formadas en su superficie identificadas como ndulos
(Figura 13), con ayuda de un microscopio estereoscpico LEICA Zoom
2000.
40
Figura 13. Colonias macroscpicas formadas en la superficie del bazo de
4.5.3 Respuesta proliferativa de los linfocitos del bazo a mitgenos

policlonales
Se realiz mediante la prueba de proliferacin de linfocitos inducidos por

mitgenos, in vitro. Este ensayo permite evaluar la capacidad de los linfocitos
para llevar a cabo la proliferacin clonal en respuesta a un estmulo no
especfico y se usa para medir la funcin inmunolgica despus de la
administracin de algn frmaco o en pacientes bajo sospecha de
inmunodeficiencias (Janeway et al., 2003). Las suspensiones celulares del
bazo, obtenidas en los pasos anteriores se usaron para realizar los cultivos
celulares. La suspensin celular (10 ml) procedente de 3 ratones, se deposit
sobre 4 ml de Ficoll-Hypaque en tubos cnicos y se centrifug a 2500 rpm por
25 minutos. Se extrajo la capa de clulas mononucleadas, succionando
cuidadosamente con una pipeta, y seguidamente se lavaron tres veces
mediante centrifugacin a 1000 rpm por 5 minutos. Despus de la ltima
centrifugacin se resuspendi el taco celular en medio de cultivo completo
RPMI-1640 (suplementado con suero bovino fetal 10%, L-glutamina 2mM,
HEPES 10 mM, bicarbonato de sodio 2g/L, gentamicina 50 g/ml y
41
estreptomicina 100 g/ml), se realiz el recuento de clulas vivas de la
suspensin obtenida mediante el colorante vital azul de Tripn en una cmara
de Neubauer y se diluy la suspensin celular a la concentracin de 1 x 10 6
clulas /ml.
Los mitgenos, concanavalina A (Con A, lote C5275) y Lipopolisacrido

(LPS, lote L4391) fueron adquiridos en Sigma Chemical Co (St. Luis, Mo) y se
reconstituyeron en medio de cultivo RPMI-1640, siguiendo las instrucciones
del inserto, se prepararon soluciones en concentraciones de 500 g/ml para
Con A y 100 g/ml para LPS, que fueron alicuotadas y congeladas a -20 C
hasta su uso.
Los cultivos de clulas mononucleares se realizaron en placas de 24

pocillos, por triplicado y en un volumen final de 0.5 ml. En cada pocillo se
mezclaron 250 l de la suspensin celular (1 x 106 clulas/ml) y 250 l del
medio de cultivo completo slo (control) o conteniendo los mitgenos a las
concentraciones finales de 5 g/ml de Con A y 0,5 g/ml para los cultivos de
esplenocitos (dosis ptimas determinadas en pruebas anteriores). Las placas
se colocaron dentro de una incubadora en atmsfera de CO2 (5%), a 37C y
en ambiente hmedo, durante 48 horas.
Al cabo del periodo de incubacin, se aadi a cada pocillo 50 l de 3-(4,5-

dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol (MTT) a la concentracin de 5 g/ml se
incubaron toda la noche. Al da siguiente se retir cuidadosamente todo el
medio de cultivo de cada pocillo, se aadi 1 ml de alcohol isoproplico y se
incub 4 horas en oscuridad, se realizaron las lecturas de la mezcla a 540 nm
en un espectrofotmetro. El porcentaje de proliferacin se obtuvo con la
siguiente frmula:
(Abs tratadas con mitgeno - Abs no tratadas con mitgeno)

% Proliferacin = x 100
Abs no tratadas con mitgeno
42
4.6 ANLISIS ESTADSTICO
Los resultados fueron analizados usando el paquete estadstico SPSS

(versin 15). Los resultados se expresaron como la media desviacin
estndar y las diferencias entre dos grupos se determinaron mediante el
anlisis de varianza Levene seguido de la prueba t de Student. Las
comparaciones mltiples se realizaron mediante el anlisis de varianza
ANOVA seguido del test de comparacin mltiple HSD de Tukey (varianzas
homogneas) o T3 de Dunnett (varianzas no homogneas). Los valores
p<0.05 fueron considerados estadsticamente significativos.
43
5. RESULTADOS
5.1 IDENTIFICACIN DE LOS PRINCIPALES COMPONENTES PRESENTES

EN EL EXTRACTO ACUOSO (EAc) DE MACA
El extracto acuoso de maca present color mbar oscuro, sabor

ligeramente dulce, olor caracterstico y tuvo un rendimiento de 2,79 gramos de
extracto por cada 100 gramos de maca pulverizada, que equivale a 27,9%.
Cuando el extracto se disolvi en agua para preparar las dosis
correspondientes, se observaron ciertos precipitados blanquecinos. Cuando la
dilucin se someti a calor (60C), los precipitados desaparecieron; lo que
seala que probablemente sean carbohidratos, ya que la solubilidad de ellos
es mayor a medida que aumenta la temperatura. Adems, los precipitados
fueron positivos por la prueba con Lugol.
El extracto acuoso a la dosis de 30 mg/ml, fue positivo para el reactivo de

Molish sealando la presencia de carbohidratos totales y para el lugol
indicando la presencia de almidones. La prueba para triterpenos/esteroles,
taninos y saponinas tambin result positiva; la prueba para alcaloides slo
result positiva para el ensayo de Hager (Tabla 3).
Grupo fitoqumico Prueba bioqumica Resultado
Molish +++
Carbohidratos
Lugol +++
Protenas Bradford +
Flavonoides NaOH ++
Hager ++
Alcaloides
Mayer -
Triterpenos/esteroles H2SO4/Anhidrido actico ++
Taninos Cloruro frrico ++
Saponina Espuma (>2 minutos) ++
Tabla 3. Resultados del tamizaje fitoqumico del extracto acuoso de

Lepidium meyenii (maca).
Fuertemente positivo (+++), Positivo moderado (++), Positivo dbil (+), Negativo (-)
44
La cantidad de carbohidratos totales y protenas por gramo de extracto
acuoso, result ser 636.7 mg y 8.4 mg respectivamente. Adems se
registraron 0,108 mg de antocianinas y 1,47 mg de flavonoles por cada gramo
del extracto acuoso de maca.
5.2 INMUNOSUPRESIN EXPERIMENTAL CON CICLOFOSFAMIDA Y

TRATAMIENTO CON EL EAc DE MACA EN RATONES
5.2.1 Dosis ptima de ciclofosfamida (CF) para inmunosupresin (IS) de

ratones
Los resultados se presentan en la Figura 14 y estn expresados en

porcentajes con respecto al da 0 (100%). La dosis de 65 mg/kg de CF indujo
una mielosupresin de 62,8%, 2 das post-IS; pero 5 das despus de la IS ya
se observaba una recuperacin casi total de clulas nucleadas (89,9%). Con la
dosis de 130 mg/kg, la mielosupresin fue ms severa 2 das despus de la IS
(26,9%) y los recuentos an se mantenan bajos 5 das despus de la IS
(64,7%). A los 7 das hay una recuperacin total con ambas dosis. La dosis de
200 mg/kg result ser muy txica para los animales, uno de ellos muri al da
siguiente y los otros 2 se mostraron inapetentes y presentaron cada de pelo
en todo el cuerpo, poniendo en riesgo la vida del animal y adems el xito del
experimento. Despus de comparar los datos y de acuerdo al objetivo del
estudio se opt por la dosis de 130 mg/kg peso corporal y evaluarlas 2 y 5 das
despus de la inmunosupresin.
Los ratones consumieron la dosis de extracto acuoso con facilidad, adems

los animales tratados con el extracto se mostraron muy activos en
comparacin a los no tratados. La CF ocasion que los animales de todos los
grupos se mostraran inapetentes, con somnolencia y con muy poca actividad.
45
Figura 14. Efecto de diferentes dosis de ciclofosfamida sobre el porcentaje de
clulas nucleadas de la mdula sea. Los ratones fueron inmunosuprimidos con 2
dosis diferentes de ciclofosfamida (65 y 130 mg/kg pc) y las evaluaciones se realizaron a los 2
y 5 das despus de la inmunosupresin. Los valores del da 0 corresponden a los ratones no
inmunosuprimidos y representan el 100% de normalidad. Los datos estn expresados en
porcentajes respecto al da 0, y fueron obtenidos de 3 ratones por grupo.
CF: Ciclofosfamida
5.2.2 Niveles sricos de la enzima heptica transaminasa glutmico

pirvica (TGP)
Los ratones del grupo IS2d-Sin EAc mostraron los mayores promedios de
TGP que fue superior a los dems grupos experimentales (p<0,05). A 5 das
post-IS el grupo IS5d-Sin EAc mostr mayor promedio respecto a los grupos
IS2d-EAc, IS5d-EAc y los no inmunosuprimidos. No hubo diferencia
significativa entre los niveles de TGP de los grupos IS2d-EAc e IS5d-EAc, ni
tampoco de los grupos no inmunosuprimidos (Tabla 4).
46
TGP
GRUPOS DE TRATAMIENTO
(UI/L)
IS2d EAc 70,40 16,73a
IS2d Sin EAc 97,74 7,27b,c,d

IS con CF
IS5d EAc 68,60 5,76b
IS5d Sin EAc 81,81 10,56c,d
EAc 67,85 7,71

No IS con CF
Sin EAc 67,89 9,39
Tabla 4. Efecto del extracto acuoso de maca sobre los niveles sricos de la
enzima transaminasa glutmico pirvica en los ratones inmunosuprimidos con
ciclofosfamida. El experimento tuvo una duracin de 2 meses. Los valores representan la
media SD de dos experimentos independientes. Las diferencias significativas (p<0,05) entre
los grupos fueron determinados con la prueba t Student.
Inmunosuprimidos con CF, evaluados 2 5 das despus de la inmunosupresin

Grupo IS2d EAc : Evaluados 2 das post-IS, tratados con el extracto acuoso
Grupo IS2d Sin EAc : Evaluados 2 das post-IS, no tratados con el extracto acuoso
No inmunosuprimidos con CF
Grupo EAc : Tratados con el extracto acuoso
Grupo Sin EAc : No tratados con el extracto acuoso
a
p<0.05 cuando es comparado con el grupo IS2d Sin EAc EAc : Extracto acuoso de maca
b
p<0.05 cuando es comparado con el grupo IS5d Sin EAc IS : Inmunosuprimidos
c
p<0.05 cuando es comparado con el grupo Sin EAc CF : Ciclofosfamida
d
p<0.05 cuando es comparado con el grupo EAc
47
5.3 EFECTO DEL EAc DE MACA SOBRE LA PRODUCCIN DE mRNA
PARA IL-3, GM-SCF e IL-7 EN CLULAS DEL BAZO Y LA MDULA
SEA DE RATONES INMUNOSUPRIMIDOS
5.3.1 Niveles de expresin de los genes IL-3, GM-SCF e IL-7 por

esplenocitos
La inmunosupresin redujo drsticamente los niveles de expresin de IL-3,

GM-CSF e IL-7 en el bazo, a dos das post-IS (Grupo IS2d-Sin EAc) al
compararlos con los no inmunosuprimidos (p<0.05), pero el tratamiento con el
extracto acuoso amortiguo estos efectos. A 5 das post-IS se observ el
incremento significativo en el nivel de expresin de las tres citoquinas
evaluadas, siendo superior incluso a los valores obtenidos en los ratones no
inmunosuprimidos (EAc y Sin EAc).
En la Figura 15 se observa que el grupo IS2d-EAc present mayor

expresin gnica de IL-3 con respecto al grupo IS2d-Sin EAc (10 veces ms),
pero fue menor al presentado por los grupos evaluados 5 das post-IS, donde
es notorio un incremento en los niveles de expresin para esta citoquina en
ambos grupos inmunosuprimidos, aunque el grupo IS5d-Sin EAc mostr
mayor produccin que el grupo IS5d-EAc (pero solo fue 1,2 veces ms). Entre
los grupos no inmunosuprimidos, los esplenocitos de los ratones tratados con
el extracto (grupo EAc) mostraron mayor expresin gnica para IL-3 con
respecto a grupo Sin EAc (2,5 veces ms).
La Figura 16 muestra que el tratamiento con el EAc provoc un aumento

en los niveles de mRNA de GM-CSF en el grupo IS2d-EAc respecto al grupo
IS2d-Sin EAc (1,3 veces ms). No se encontraron diferencias de expresin
entre los grupos evaluados 5 das post-IS, ni entre los grupos no
inmunosuprimidos. Los mismos resultados se observaron para los niveles de
expresin de IL-7, slo se observaron diferencias significativas entre los
ratones evaluados 2 das post-IS, donde el grupo EAcIS-2d mostr mayor
expresin gnica para IL-7 (1,5 veces ms) respecto al grupo IS2d-Sin EAc
(Figura 17).
48
A. Imagen de un gel representativo de los productos obtenidos por RT-PCR.
B. Representacin grfica de las intensidades relativas de cada una de las bandas
cuantificadas por anlisis de imagen. Los datos fueron normalizados con los valores de
GAPDH y representan la media SD de dos experimentos independientes. Prueba t
Student.

a
b
c
d
49
de GM-CSF por esplenocitos de ratones inmunosuprimidos con ciclofosfamida.
Student.

a
b
c
d
50
de IL-7 en el bazo de ratones inmunosuprimidos con ciclofosfamida.
Student.

a
b
c
d
51
5.3.2 Niveles de expresin de los genes IL-3, GM-SCF e IL-7 de la mdula
sea
El patrn de expresin de las 3 citoquinas evaluadas no fue el mismo en la

mdula sea que en el bazo, la mayor expresin gnica en la mdula sea se
observ a los 2 das post-IS (IS2d-EAc e IS2d-Sin EAc) y fue superior
respecto a los dems grupos (p<0,05), sin embargo se reduce drsticamente a
los 5 das post-IS hasta llegar a niveles similares a los grupos no
inmunosuprimidos.
No se observaron diferencias de niveles de expresin de IL-3, entre los

grupos IS2d-EAc e IS2d-Sin EAc. Sin embargo a 5 das post-IS el nivel de
expresin de IL-3 en el grupo IS5d-EAc fue superior al grupo IS5d-Sin EAc
(1,8 veces ms) igualndose al grupo EAc. Entre los ratones no
inmunosuprimidos el grupo tratado con el extracto (EAc) mostr mayor nivel de
expresin con respecto al grupo Sin EAc (1,4 veces ms) (Figura 18).
La Figura 19 muestra que los ratones del grupo IS5d-EAc presentan mayor
expresin de GM-CSF con respecto al grupo IS5d-Sin EAc (aunque solo fue
1,2 veces ms). No se encontraron diferencias de expresin entre los grupos
IS2d-EAc e IS2d-Sin EAc, ni tampoco entre los grupos no inmunosuprimidos
(EAc y control).
Los ratones tratados con el extracto y evaluados dos das post-IS (grupo
IS2d-EAc) tuvieron mayor expresin de IL-7 con respecto al grupo IS2d-Sin
EAc (aunque solo fue 1,2 veces ms). No se observaron diferencias de
expresin para IL-7 entre los grupos IS5d-EAc e IS5d-Sin EAc. Entre los
grupos no inmunosuprimidos, los ratones tratados con EAc mostraron mayor
expresin gnica de IL-7 (2,5 veces ms), al compararlo con el grupo Sin EAc.
El grupo EAc tambin registr mayor expresin de IL-7 que los ratones
evaluados 5 das post-IS (grupos IS5d-EAc e IS5d-Sin EAc) (Figura 20).
52
Los niveles de expresin se determinaron mediante RT-PCR en tiempo real. Los datos fueron
normalizados con los valores de GAPDH y representan la media SD de dos experimentos
independientes. Prueba t Student.

a
b
c
d
53
de GM-CSF en la mdula sea de ratones inmunosuprimidos con
ciclofosfamida. Los niveles de expresin se determinaron mediante RT-PCR en tiempo real.
Los datos fueron normalizados con los valores de GAPDH y representan la media SD de dos
experimentos independientes. Prueba t Student.

a
b
c
d
54
independientes. Prueba t Student.

a
b
c
d
55
5.4 EFECTO MODULADOR DEL EAc SOBRE LA PROLIFERACIN
CELULAR Y PRODUCCIN DE mRNA PARA IL-3, GM-CSF E IL-7 EN
CULTIVOS DE CLULAS MONONUCLEARES DE LA MDULA SEA
Se evaluaron tres dosis diferentes de EAc en cultivos de clulas

mononucleares de mdula sea y de ellas la ms eficiente fue la de 100 g/ml,
que estimul la proliferacin en 35,1 % por encima del cultivo sin extracto,
dosis superior a esto result ser txica para las clulas (-3,3%) (Figura 21).
Figura 21. Efecto del extracto acuoso de maca sobre la proliferacin de las
clulas mononucleares de la mdula sea. Las clulas (1 x 106 cells/ml) fueron
cultivadas con diferentes dosis del extracto (0, 50, 100 y 200 g/ml) durante 48 horas y por
triplicado. Los valores representan la media SD de 2 experimentos independientes. Todos
los grupos mostraron diferencias significativas entre ellos (p<0,05). ANOVA y prueba TUKEY
post hoc.
Los niveles de mRNA para los genes de IL-3, IL-7 y GM-SCF, se realizaron
en cultivos de 0, 18 y 48 horas y con 100 g/ml del extracto acuoso, dosis que
result ms efectiva en la prueba de proliferacin. Los resultados de expresin
gnica relativa se presentan en la Tabla 5; se observa que a 18 horas de
56
cultivo, el extracto a la dosis de 100 g/ml provoc un aumento significativo en
los niveles de expresin de IL-7 respecto a su nivel basal (0 horas) (p<0.05), el
incremento observado en los otros genes (IL-3 y GM-CSF) no fue significativo.
Los cultivos que no recibieron el extracto, por el contrario registraron, una
disminucin en la expresin de los 3 genes evaluados, que fue significativa
para IL-3 e IL-7 con respecto a su nivel basal. A 48 horas de cultivo con/sin el
EAc de maca se observa una disminucin significativa en la expresin de los 3
genes evaluados.
Citoquinas hematopoyticas
Tratamiento EAc (g/ml)
IL - 3 GM - CSF IL - 7
0 horas 1,00 1,19 0,7 1,00 0,03
100 18 horas 1,87 1,10 1,56 0,1 2,07 0,76*
48 horas 0,01* 0,00* 0,03 0,03*
0 horas 1,00 1,19 0,7 1,00 0,03
0 18 horas 0,20 0,08* 0,45 0,01 0,17 0,02*
48 horas 0,67 0,57 0,01 0,01* 0,08 0,03*
Tabla 5. Efecto del extracto acuoso de maca sobre la expresin de mRNA de

IL-3, GM-SCF e IL-7 en los cultivos de clulas mononucleares de la mdula
sea. Las clulas (1 x 106 cells/ml) fueron cultivadas con o sin extracto acuoso (100 g/ml),
por triplicado, y el RNA fue extrado en tres tiempos diferentes de cultivo (0, 18 y 48 horas).
independientes.
* p<0,05 con respecto al nivel basal (0 horas) Prueba t Student.
57
5.5 INFLUENCIA DEL TRATAMIENTO CON EL EAc DE MACA SOBRE LA
PROLIFERACIN DE LAS CLULAS HEMATOPOYTICAS DE
RATONES INMUNOSUPRIMIDOS
5.5.1 Recuento de clulas nucleadas de la mdula sea y sangre

circulante
La inmunosupresin provoc un descenso significativo en la celularidad de

la mdula sea con respecto a los ratones no inmunosuprimidos (p<0,05). No
se registraron diferencias de celularidad de mdula sea entre los grupos
IS2d-EAc e IS2d-Sin EAc. A 5 das post-IS se evidenci una recuperacin de
la celularidad, los ratones del grupo IS5d-EAc mostraron mayor recuento con
respecto al grupo IS5d-Sin EAc (p<0,05), pero fueron inferiores respecto a los
no inmunosuprimidos. Entre los grupos no inmunosuprimidos, los ratones
tratados con el extracto (EAc) mostraron mayor recuento de clulas de mdula
sea con respecto a los no tratados (Sin EAc) (Figura 22).
Todos los grupos inmunosuprimidos mostraron menor recuento de sangre

perifrica con respecto a los ratones no inmunosuprimidos. No se encontr
diferencia de recuento entre los grupos IS2d-EAc e IS2d-Sin EAc. Los ratones
del grupo IS5d-EAc mostraron mayor recuento promedio de sangre circulante
con respecto al grupo IS5d-Sin EAc (p<0,05), pero fue inferior con relacin a
los ratones no inmunosuprimidos. No hubo diferencia entre los promedios
celulares de los grupos EAc y Sin EAc (Figura 23).
En cuanto al recuento diferencial, los ratones del grupo IS2d-EAc

mostraron mayores promedios de blastos, neutrfilos y monocitos que el grupo
IS2d-Sin EAc (p<0,05). A 5 das post-IS, el grupo IS5d-EAc mostr mayor
recuento de neutrfilos y monocitos que el grupo IS5d-Sin EAC; no se
encontraron diferencias de recuento de linfocitos, aunque el grupo IS5d-EAc
mostr mayor promedio (p= 0,065). No se observan diferencias significativas
entre los grupos no inmunosuprimidos (EAc y Sin EAc), pero ellos fueron
superiores a los grupos inmunosuprimidos (Tabla 5).
58
nucleadas de mdula sea en ratones inmunosuprimidos con ciclofosfamida.
El experimento tuvo una duracin de 2 meses. Los valores representan la media SD de dos
experimentos independientes. Las diferencias significativas (p<0,05) entre los grupos fueron
determinados con la prueba t Student.

a
b
c
d
59
nucleadas de sangre circulante en ratones inmunosuprimidos con

a
b
c
d
60
Tabla 6. Efecto del extracto acuoso de maca sobre el recuento diferencial de
sangre circulante en ratones inmunosuprimidos con ciclofosfamida. El
experimento tuvo una duracin de 2 meses. Los valores representan la media SD de dos
experimentos independientes. Las diferencias significativas (p<0,05) entre los grupos fueron
determinados con la prueba t Student.

a
b
c
d
61
5.5.2 Hematopoyesis en el bazo
Los ratones del grupo IS5d-EAc mostraron un mayor recuento significativo

de macrocolonias en la superficie del bazo en comparacin con los otros
grupos inmunosuprimidos (Figura 24). No se encontr diferencias significativas
de recuento entre los grupos IS2d-EAc, IS2d-Sin EAc; sin embargo, ambos
fueron inferiores con respecto al grupo IS5d-Sin EAc (p<0,05) (Figura 25).
Figura 24. Macrocolonias en el bazo de ratones inmunosuprimidos con

ciclofosfamida y evaluadas 5 das despus de la inmunosupresin. El
experimento tuvo una duracin de 2 meses, despus del cual de fijaron los bazos en solucin
Bouin para su posterior observacin al microscopio estereoscpico.
A. Bazo de un ratn tratado con el extracto acuoso (grupo IS5d-EAc), ntese la mayor
presencia de ndulos en toda la superficie del bazo, que le da un aspecto grumoso.
B. Bazo de un ratn no tratado con extracto (grupo IS5d-Sin EAc), el nmero de ndulos es
inferior en comparacin a la imagen de la izquierda.
62
Figura 25. Efecto del extracto de maca sobre el recuento de las unidades
formadoras de colonia esplnica (CFU-S) de ratones inmunosuprimidos con

*p<0,05 cuando es comparado con el grupo IS5d Sin EAc
EAc : Extracto acuoso de maca

IS : Inmunosuprimidos
CF : Ciclofosfamida
63
5.5.3 Respuesta proliferativa de los linfocitos del bazo a mitgenos
policlonales
La inmunosupresin redujo drsticamente la respuesta proliferativa de los

linfocitos del bazo a concanavalina A y LPS a 48 horas de cultivo. Los
linfocitos procedentes del bazo de ratones inmunosuprimidos tratados con el
extracto acuoso (grupos IS2d-EAc e IS5d-EAc) mostraron mayor respuesta
proliferativa a concanavalina, respecto a los grupos no tratados (grupos IS2d-
Sin EAc e IS5d-Sin EAc), aunque fue inferior en comparacin a los ratones del
grupo EAc. Entre los grupos no inmunosuprimidos, el grupo EAc mostr mayor
promedio, que adems fue significativo respecto a todos los grupos
experimentales. No se encontraron diferencias entre los grupos EAc e IS5d-
EAc, pero ambos fueron superiores al grupo IS5d-Sin EAc (Figura 26).
No hubo diferencia entre los promedios de proliferacin de los linfocitos del

bazo a LPS de los grupos EAc y Sin EAc, pero ambos fueron significativos
(p<0.05) con respecto a los grupos inmunosuprimidos. Los linfocitos de los
ratones inmunosuprimidos y tratados con el extracto (grupos IS2d-EAc e IS5d-
EAc) mostraron mayor capacidad de respuesta a LPS que los grupos IS2d-Sin
EAc e IS5d-Sin EAc. No se encontr diferencia de respuesta entre los grupos
IS2d-Sin EAc e IS5d-Sin EAc. El grupo IS5d-EAc mostr mayor promedio que
el grupo IS2d-EAc (Figura 27).
64
a concanavalina A de los linfocitos del bazo de ratones inmunosuprimidos con
ciclofosfamida. Las clulas (1x106 cells/ml) fueron cultivadas en presencia y ausencia de
Concanavalina (5 g/ml) por 48 horas. La proliferacin celular fue medida con el ensayo del
MTT. Los resultados se expresaron como % de proliferacin con respecto al cultivo control (sin
mitgeno). Los valores representan la media SD de dos experimentos independientes.
Prueba t Student.

a
b
c
d
65
a Lipopolisacrido de los linfocitos del bazo de ratones inmunosuprimidos con
ciclofosfamida. Las clulas (1x106 cells/ml) fueron cultivadas en presencia y ausencia de
Lipopolisacrido (0,5g/ml) por 48 horas. La proliferacin celular fue medida con el ensayo del
MTT. Los resultados se expresaron como % de proliferacin con respecto al cultivo control (sin
mitgeno). Los valores representan la media SD de dos experimentos independientes.
Prueba t Student.

a
b
c
d
66
6. DISCUSIN
La maca es ampliamente consumida por los pobladores andinos, debido a

sus propiedades nutricionales y medicinales. La divulgacin de sus
propiedades atrajo el inters de investigadores que identificaron varios de sus
compuestos qumicos a los que se les atribuyen las propiedades
farmacolgicas. Como consecuencia se han incrementado los cultivos de la
especie, siendo el ecotipo amarillo el ms comn y comercial (47,8%), y se
han desarrollado a nivel industrial diferentes preparaciones como harina,
cpsulas y tabletas, que tienen gran acogida. La poblacin nativa peruana
consume un promedio diario de 50 a 100 gramos de maca y la manera en que
la consumen es hirvindola por varios minutos, y en forman de mermelada o
bebida (Gonzales, 2012). En este trabajo se utiliz el extracto acuoso de
maca, que es la forma que se encuentra directamente relacionado con su
consumo tradicional. Se obtuvieron 27,9% de extracto acuoso por cada 100
gramos de maca pulverizada y la dosis empleada fue de 200 mg/kg de peso
corporal (p.c.), por lo que a una persona adulta de peso promedio de 70 kilos,
le correspondera un consumo diario de 14 gramos del extracto acuoso, o de
50 gramos de harina de maca, que debe ser hervida antes de su consumo; por
lo que la dosis empleada est dentro del consumo tradicional de la poblacin.
El anlisis fitoqumico permiti identificar algunos de los componentes

presentes en el extracto acuoso utilizado en este estudio, que excluye la
posibilidad de prdida de nutrientes en el extracto al pasar por un proceso de
ebullicin; se identificaron los carbohidratos y protenas, principales fuentes de
energa de los organismos, que participan en mltiples procesos biolgicos. El
estudio cuantitativo determin que el porcentaje de carbohidratos y protenas
presentes en el extracto es del 63,7% y 0,84% respectivamente. La cantidad
de carbohidratos corresponde a lo reportado ampliamente en el hipoctilo seco
de maca, de un 50 - 70%. Sin embargo, el porcentaje obtenido de protenas
fue muy inferior, ya que la literatura seala que el hipoctilo seco presenta de
10 - 16% de protenas totales (Obregn, 1998), es probable que con la
extraccin acuosa no se logre obtener todas las protenas presentes y que la
67
mayora de ellas se quedaron en el pellet no utilizado despus de la
centrifugacin. Los flavonoides son compuestos fenlicos con demostrada
accin antioxidante y eliminadora de radicales libres, entre ellos destacan los
flavonoles y las antocianinas; el extracto acuoso present antocianinas y
flavonoles en concentraciones reportadas por otros investigadores (Sandoval
et al., 2002). Tambin result positiva para triterpenos/esteroles, taninos y
saponinas, metabolitos que estaran relacionados al efecto antioxidante de la
maca (Castao, 2008). Es importante mencionar que algunos investigadores
recomiendan para la deteccin de saponinas, esperar la persistencia de la
espuma por 30 minutos; como en este trabajo slo se consider 3 minutos, es
necesario repetir el ensayo para confirmar su presencia en el extracto acuoso.
No se pudo confirmar la presencia de alcaloides con las dos reacciones
empleadas, ya que slo reaccion frente al reactivo de Hager, pero no sucedi
con el reactivo de Mayer. La deteccin de alcaloides mediante reacciones de
precipitacin pueden dar falsos positivos y negativos, por lo que se conviene
realizar varias reacciones de deteccin para confirmar los resultados (Lpez-
Casamayor, 2007).
Adems de sus propiedades sobre la reproduccin, la maca tambin ha

mostrado capacidad para estimular la respuesta inmune humoral y celular. Un
trabajo anterior seal que ratones inmunosuprimidos con 50 mg/kg de
ciclofosfamida y tratados con el extracto acuoso de maca, presentaron un
mayor recuento de clulas sanguneas, lo que indica un posible efecto sobre la
hematopoyesis (Torres, 2008).
Muchos pacientes que reciben quimio/radioterapia desarrollan una

supresin inmune y hematopoytica, que es el principal factor limitante para su
uso continuo en la clnica. En este sentido, el desarrollo de estrategias que
eviten las complicaciones provocadas por la quimioterapia, podran disminuir
considerablemente el riesgo de padecer infecciones y reducir el nmero de
das en el hospital, adems de mejorar la calidad de vida de los pacientes.
Como los efectos estimulatorios de un compuesto o suplemento nutricional

son difciles de evaluar en personas o animales saludables, se us la
68
ciclofosfamida en un modelo murino, como una aproximacin para los estudios
de inmunomodulacin en individuos inmunocomprometidos. La ciclofosfamida
(CF) es un agente alquilante muy usado en los regmenes quimioterapeticos
debido a su amplio espectro antitumoral, y como inmunosupresor en las
enfermedades autoinmunes.
Esta droga por s misma es inactiva y requiere su activacin metablica en

el hgado por las enzimas del citocromo P450 para formar mostaza de
fosforamida y acrolena, sustancias alquilantes responsables de su accin
citotxica (Penel et al., 2012). El principal mecanismo de la CF como agente
antitumoral, es la induccin de entrecruzamiento de las cadenas de DNA/RNA
mediante reacciones de alquilacin en clulas que se dividen activamente, por
lo que no solo est restringido a las clulas cancerosas sino tambin a otras
clulas con proliferacin activa como las clulas madre y progenitoras de la
mdula sea. Es ms txico para los tejidos altamente proliferantes como el
sistema hematopoytico, gastrointestinal, epitelial, folculos pilosos, las
glndulas genitales, adems de ejercer una profunda depresin de la
respuesta inmune humoral y celular (Dolgova et al., 2012). Sin embargo la CF
tiene roles antineoplsicos e inmunomoduladores que son dosis-dependiente;
significando que dosis mnimas pueden reforzar la respuesta inmune. Por lo
tanto, una seleccin razonable de la dosis, tiempo y frecuencia, es primordial
para el establecimiento exitoso de inmunosupresin en modelos de animales
(Huyan et al., 2011).
La dosis empleada de CF para inducir una inmunosupresin vara de un

estudio a otro. Sefc et al. (2003) emplearon 135 mg/kg de CF en dosis nica y
observaron que la celularidad de la mdula sea retorn a los valores
normales despus de 6-7 das, aunque la composicin celular se mantuvo
alterada hasta el da 14. Wang et al. (2011) emplearon la dosis 80 mg/kg de
CF durante tres das y evaluaron los resultados despus de 4 das de la ltima
dosis, donde reportaron que los valores de leucocitos todava se mantenan
bajos. En este estudio, se probaron tres dosis diferentes de CF y se evalu el
efecto inmunosupresor mediante el recuento de clulas nucleares de la
mdula sea a los 2 y 5 das despus de la inmunosupresin. Se consideraron
69
estos das con la finalidad de obtener datos consistentes sobre el efecto
modulador del extracto en la recuperacin hematopoytica murina despus de
un dao agudo por la CF. Se decidi trabajar con la dosis de 130 mg/kg de
peso corporal, ya que se obtuvieron bajos recuentos celulares a los 2 das
despus de la inmunosupresin, que se mantuvieron bajos hasta 5 das post-
IS, a diferencia de la dosis de 65 mg/kg p.c., en el que se observ que 5 das
post-IS se produjo la recuperacin casi total de la cantidad de clulas
nucleadas (89.9%) (Figura 14).
En el estudio realizado se utiliz el extracto acuoso de maca en la dosis de

200 mg/kg. Respecto a la dosis empleada, Alzamora L. (2003) administr la
dosis oral de 75 mg/kg del extracto clorofrmico y obtuvo resultados favorables
en la respuesta inmune humoral y celular. Torres D. (2008) emple la dosis de
300 mg/kg del extracto acuoso, metanlico y clorofrmico, demostrando el
efecto modulador sobre la celularidad, hemograma y produccin de
anticuerpos contra glbulos rojos. Muchos estudios realizados con otras
plantas, sealaron que el incremento en las dosis produce una superacin del
estado de inmunosupresin en menor tiempo (Bafna y Mishrash, 2005; Wang
et al, 2011; Patra et al., 2012). El tiempo de tratamiento fue de 2 meses, se
consider este tiempo para confirmar el efecto hematopoytico del extracto de
maca en el ratn, es decir, garantizar que todos los efectos biolgicos
observados estn siendo influenciados por el extracto y que su consumo en un
tiempo prolongado no es hepatotxico para el organismo.
El hgado es el lugar primario de biotransformacin de compuestos

extraos, pero tambin es particularmente vulnerable a ellos. La
hepatotoxicidad del extracto acuoso de maca se evalu midiendo los niveles
sricos de TGP, que es una enzima heptica muy utilizada como marcador de
dao heptico (Alvarez, 2005); los resultados confirmaron que el consumo por
2 meses del extracto acuoso de maca a la dosis de 200 mg/kg no result
daino para los animales, ya que sus niveles de TGP fueron similares a los no
tratados con el extracto (67.65 vs 67.89). Reportes anteriores tambin indican
la ausencia de toxicidad de la maca en el desarrollo embrionario, la
70
descendencia, el hemograma y los niveles de enzimas hepticas de los
roedores (Canales et al., 2000; D'Arriago et al., 2004; Castaeda et al., 2007).
Otros estudios adems sealan el potencial antioxidante de la maca,

demostrado por su capacidad de atrapar los radicales libres y proteger a las
clulas contra el estrs oxidativo (Sandoval et al., 2002), revertir los
parmetros lipdicos, de glucosa y el nivel de enzimas anti-oxidantes en ratas
con hipertrigliceridemia hereditaria (Vecera et al., 2007) y aumentar la relacin
glutatin reducido/glutatin oxidado (GSH/GSSG) a nivel plasmtico,
contribuyendo con la mejora del estado redox en un modelo de diabetes
experimental (Cisneros et al., 2011). El tratamiento con CF produce niveles
altos de dao oxidativo en el tejido heptico, que es evidenciado por la
elevacin de la concentracin de malondialdehdo (MDA) que indica un
incremento de la peroxidacin lipdica en el hgado y por la inactivacin de
funciones antioxidantes, causando un aumento de radicales libres de oxgeno
(ROS). El ROS incrementa la peroxidacin lipdica, que a su vez altera la
integridad de las membranas, causa la prdida de permeabilidad, disminucin
de fluidez y por ende la fuga de enzimas como la TGP (Shathish et al., 2012;
Kim et al., 2012). En el presente trabajo, la administracin de CF indujo un
aumento significativo en los niveles de TGP de todos los animales, sin
embargo los grupos tratados previamente con el extracto de maca no
modificaron sus niveles basales de TGP y fueron similares a los no
inmunosuprimidos con CF (Tabla 4), estos resultados confirman el efecto
hepatoprotector de la maca frente a un agente txico como la ciclofosfamida.
La inmunosupresin redujo drsticamente los niveles de expresin de IL-3,

GM-CSF e IL-7 en el bazo a 2 das post-IS (Grupo IS2d-Sin EAc), al
compararlos con los no inmunosuprimidos (p<0,05), pero el tratamiento con el
extracto acuoso amortigu estos efectos (Grupo IS2d-EAc). El incremento en
la produccin de las 3 citoquinas est asociada a una hematopoyesis creciente
en el bazo en ambos linajes: mieloides (IL-3, GM-CSF) y linfoide (IL-7);
adems, de una mayor supervivencia y funcin efectora de las clulas
diferenciadas (Reddy et al., 2000). Como la produccin de estas citoquinas es
realizada por las clulas estromales y accesorias, es probable que estas
71
clulas provenientes de ratones tratados con el extracto, respondan en menor
tiempo (2 post-IS) ante una emergencia y secreten estas citoquinas para
restaurar la homeostasis hematopoytica (Figuras 15, 16 y 17).
El patrn de expresin de las 3 citoquinas evaluadas no fue el mismo en la

mdula sea que en el bazo; la mayor expresin gnica en la mdula sea se
observ a los 2 das post-IS (IS2d-EAc e IS2d-Sin EAc) y fue superior respecto
a los dems grupos (p<0.05); sin embargo, se reducen drsticamente a 5 das
post-IS hasta llegar a niveles similares a los grupos no inmunosuprimidos
(Figuras 18, 19 y 20), que es cuando se registra la mayor expresin en el bazo
(IS5d-EAc e IS5d-Sin EAc) indicando que la mdula sea responde primero
ante una emergencia hematopoytica y detiene su produccin en el momento
en que aumenta la respuesta hematopoytica en el bazo, esto estara
relacionado con la movilizacin de las clulas madre/ progenitoras, ya que
ellas estn donde hay citoquinas para poder proliferar y diferenciarse. Sefc et
al. (2003) reportaron que al 5to da de la inmunosupresin con CF, hay un
incremento significativo de clulas progenitoras en el bazo que est
acompaado con una reduccin de ellas en la mdula sea, debido a la
migracin de los progenitores de la mdula al bazo, porque el nmero de estas
clulas en el bazo pasa de 4% a 69%. Los ratones tratados con el extracto
mostraron mayor expresin de IL-7 a 2 das post-IS que indicara mayor
proliferacin y diferenciacin de los progenitores hacia el linaje linfoide,
adems de sus efectos sobre los linfocitos maduros (Meenu, W., 2008).
Aunque a 5 das post-IS hay disminucin en la expresin de las 3 citoquinas,
los animales tratados con el extracto presentan mayor produccin de IL-3 y
GM-CSF en la mdula sea (p<0.05). Todos estos resultados demuestran que
el extracto acuoso de maca puede atenuar la mielosupresin inducida por
ciclofosfamida, incrementando la produccin de las 3 citoquinas evaluadas en
el bazo y mdula sea.
Para confirmar los efectos del extracto acuoso de maca sobre la

produccin de citoquinas hematopoyticas y su relacin con las clulas
progenitoras de la mdula sea, se procedi a evaluar su accin en cultivos de
clulas mononucleares de mdula sea. El extracto acuoso de maca a la
72
dosis de 100 g/ml estimul la proliferacin de clulas mononucleares de la
mdula sea a las 48 horas de cultivo (Figura 21) y esto acompaado de una
mayor produccin de mRNA para las citoquinas hematopoytica IL-3, GM-CSF
e IL-7 a las 18 horas de cultivo, aunque solo fue significativo para IL-7 (Tabla
5). La IL-3 y el GM-CSF son secretados principalmente por las clulas T
activadas y estn implicados en la supervivencia, proliferacin y diferenciacin
de las clulas progenitoras hacia el linaje mieloide, aunque a diferencia del
GM-CSF, la IL-3 acta en los estados ms primitivos de la clula
hematopoytica. La IL-7 es liberada por las clulas del estroma (fibroblastos,
clulas reticulares) y son absolutamente necesarios para el desarrollo de los
linfocitos T y B del ratn. Esto implica que las clulas mononucleares
obtenidas por gradiente en Ficoll Hypaque, constituyen una mezcla de
poblaciones celulares hematopoyticas y estromales (Serrano et al., 2005).
Aunque en condiciones normales la hematopoyesis es controlada por

diversas citoquinas, pueden existir biomolculas de origen y naturaleza distinta
a stas que tambin pueden llegar a modular la proliferacin y diferenciacin
de las clulas hematopoyticas. La estimulacin de la proliferacin de las
clulas de la mdula sea es un indicador que el extracto de maca es capaz
de promover la hematopoyesis medular, en este caso estimulando a las
clulas del entorno (linfocitos T y clulas del estroma) a producir las citoquinas
necesarias que regulan la proliferacin y diferenciacin de las clulas
hematopoyticas; no se puede descartar un efecto directo de algunos
metabolitos del extracto sobre las mismas clulas madre/progenitoras.
Santiago et al. (2010) reportaron que la casena es capaz de inducir la
proliferacin de clulas mononucleares de ratn en ms del 80%, adems
sealaron que encontraron receptores para la casena en las clulas
mieloides, que probablemente puedan incidir en su proliferacin. Chen et al.
(2006) reportaron que el extracto crudo de la toda la planta de Angelica
sinensis estimula la proliferacin de las clulas mononucleares
hematopoyticas murinas y la produccin de factores hematopoyticos, a
travs de las vas MAPK ERK1/2 y P38, que son importantes reguladores del
crecimiento, diferenciacin o apoptosis celular. Los resultados obtenidos en los
73
cultivos in vitro de mdula sea, demuestran que la maca estimula la actividad
hematopoytica.
El recuento de clulas nucleadas de la mdula sea y sangre perifrica es

el principal parmetro clnico que refleja el dao de las drogas citotxicas. Los
ratones inmunosuprimidos presentaron los menores recuentos celulares, y
esto es debido a que el metabolismo de la CF por la enzimas hepticas,
generan productos alquilantes que interfieren con las sntesis de DNA,
afectando a las clulas de divisin activa como las clulas madre/progenitoras
de la mdula sea, provocando la muerte celular (Patra et al., 2012); adems
de los radicales libres que inducen estrs oxidativo en las clulas (Tripathi y
Jena, 2009). Sin embargo los grupos tratados con el extracto acuoso de maca
presentan un mayor recuento de clulas nucleadas en mdula sea y sangre
perifrica a 5 das post-IS (Figuras 22 y 23); la estimulacin de la proliferacin
celular en la mdula sea pone en evidencia que el extracto es capaz de
promover la hematopoyesis medular, que se refleja en el mayor recuento total
y diferencial en la periferia. Es probable que la mayor produccin de citoquinas
registradas en estos grupos, cumplan un rol importante en la repoblacin de
las clulas de la mdula sea y sangre perifrica, y segn los resultados la IL-
3 estara involucrada en el mayor recuento celular de la mdula sea, por ser
una de las citoquinas involucradas en los primeros estados de la
hematopoyesis. Adems, su mayor produccin no slo se observ a los 5 das
post-IS sino tambin en el grupo EAc (no IS); tampoco se puede descartar al
GM-CSF e IL-7, que tambin se incrementaron en la mdula sea, por lo tanto
hay estimulacin de ambos linajes. La presencia de blastos en la sangre
perifrica del grupo IS2d-EAc en relacin al grupo IS2d-Sin EAc, confirma el
efecto protector del extracto acuoso en las clulas inmaduras; este mismo
grupo tambin present mayores recuentos de granulocitos y monocitos
(p<0,05) (Tabla 6), probablemente relacionado con la mayor produccin del
mRNA para GM-CSF, que est involucrado en la diferenciacin de los
progenitores hacia granulocitos y macrfagos; sera interesante medir las
concentraciones srica de esta citoquina, junto con la GM-CSF y M-CSF para
confirmar la estimulacin del extracto al linaje granulocito/macrfago.
74
Existen muchos reportes que sealan que las clulas de sangre perifrica
siguen un ritmo circadiano. En los ratones, animales nocturnos por naturaleza,
los leucocitos alcanzan su punto mximo en las primeras horas de la maana
y van decreciendo a lo largo del da (Pelegri et al., 2003). Esto podra explicar
la gran magnitud de desviacin estndar observada en el recuento total de
leucocitos (Figura 26, grupos No IS) y que se vio reflejada en el recuento
diferencial de sangre perifrica (Tabla 6), por lo que se midi su coeficiente de
variacin y result menor del 50% (datos no mostrados). Una forma de medir
el error muestral es a travs del coeficiente de variacin, que permite evaluar
la calidad estadstica de las estimaciones, un coeficiente menor del 50% indica
que la media aritmtica es representativa (Mitacc, 1996).
En el ratn, la hematopoyesis no solo se produce en la mdula sea sino

tambin en rganos distintos como el hgado y el bazo, en este trabajo se ha
comprobado la produccin esplnica de mRNA para las 3 citoquinas
evaluadas; la hematopoyesis esplnica contribuye a la hematopoyesis medular
en condiciones de estrs, como una reaccin compensatoria a la
inmunosupresin inducida por CF, ya que la mdula sea se vuelve
inadecuada para mantener una hematopoyesis normal (Kim, 2010). El
recuento de CFU-S es una medida indirecta de la frecuencia de clulas
madre/progenitoras con alta capacidad proliferativa que derivan de la mdula
sea formando discretos ndulos en la superficie del bazo (Parekkadan B y
Yarmush M, 2009). Los ratones del grupo IS5d-EAc mostraron incremento
significativo en el recuento de colonias (Figuras 24 y 25), lo que demuestra
que hay una mayor migracin de clulas pluripotentes al bazo, donde
encuentran las citoquinas hematopoyticas que propician condiciones
necesarias para proliferar y diferenciarse; esto concuerda con la mayor
produccin de mRNA para la 3 citoquinas reportadas en los ratones del grupo
IS2d-EAc, cuyo resultado fue evidente a los 5 das post-IS en forma de
ndulos esplnicos y coincidiendo con investigadores como Shin et al. (2008)
quienes reportaron que Myelophil, que es una mezcla de extractos de Astragali
radix y Salviae radix, restaur la mielosupresin inducida por 5-Fluorouracilo
mediante la sobre-regulacin de IL-3 en el bazo, adems del incremento de los
75
parmetros hematolgicos y el contaje de progenitores hematopoyticos en
ensayos clonognicos.
La CF tambin puede afectar la funcin (activacin, proliferacin y

diferenciacin) de las clulas T y B, produciendo inmunosupresin. El ensayo
de la proliferacin de linfocitos inducidos por mitgenos permite evaluar la
capacidad de los linfocitos para llevar a cabo una proliferacin clonal en
respuesta a un estmulo no especfico (Janeway et al., 2003). La interaccin
de las clulas con el mitgeno, inicia una cascada de eventos bioqumicos y
expresin de genes que inducen a las clulas en reposo, a entrar al ciclo
celular para luego proliferar y diferenciarse, liberando citoquinas, factores de
crecimiento y anticuerpos (linfocitos B) que regulan otras funciones celulares
(Stoecker et al., 1978; Wang et al., 2005). En el presente estudio, la respuesta
proliferativa de los linfocitos T y B a sus respectivos mitgenos fue
drsticamente reducida en los grupos tratados con CF (IS2d-Sin EAc e IS5d-
Sin EAc). Sin embargo el tratamiento con el extracto acuoso de maca
promovi la recuperacin de la respuesta proliferativa de las clulas T y B. La
mayor respuesta proliferativa de los linfocitos del bazo frente a Con A refleja la
mayor presencia de linfocitos T en los ratones tratados con el extracto de
maca, esto se relaciona con la mayor produccin de mRNA de IL-3 y GM-CSF
observada en los grupos tratados con el extracto (Figuras 15 y 16), porque los
linfocitos T son las principales fuentes productoras de estas citoquinas, esta
afirmacin se ve reforzada con la mayor expresin de IL-7 reportada en estos
grupos (Figura 17), esta citoquina participa en la regulacin de las funciones
efectoras de los linfocitos T. La mayor respuesta proliferativa de los linfocitos
ante LPS, refleja la mejora en inmunidad humoral relacionada con los linfocitos
B, que explicara el mayor ttulo de anticuerpos reportados en trabajos
anteriores con ratones tratados con extractos de maca (Alzamora et al., 2007;
Torres, 2008).
El efecto txico de la CF sobre las funciones inmunes y hematopoyticas

no solo es por el dao directo al DNA sino tambin por el incremento de la
produccin de ROS, que puede llevar a la supresin de la mdula sea a
travs de la induccin de apoptosis y senescencia en las clulas madre y
76
progenitoras (Chen et al., 2012), por lo que la presencia de metabolitos con
accin anti-oxidante e inmunoestimuladora en el extracto de maca seran
responsables de los efectos observados en la hematopoyesis. Estudios
realizados por Sandoval et al. (2002) empleando el extracto acuoso de maca
hervida (ecotipo amarillo) demostraron su capacidad de atrapar radicales libres
y proteger a las clulas contra el dao oxidativo. Or (2008) report que el
extracto acuoso de maca amarilla fue capaz de ejercer efecto protector a nivel
heptico y artico en ratas hipercolesterolmicas y atribuye esta capacidad a
la presencia de fenoles y flavonoides. Son muchos los metabolitos de la maca
a los que se les puede atribuir estos efectos; los compuesto fenlicos (taninos
y flavonoides) y sus comprobadas propiedades quimio-protectoras (Huang et
al., 2010; Sandhar et al., 2011); los isotiocianatos, por su capacidad de reducir
la activacin de los carcingenos e incrementar su detoxificacin (Wu et al.,
2009); los alcaloides -carboline (reportado en la Maca por Piacente et al. en
2002) y su actividad anti-genotxica y anti-mutagnica relacionado a sus
propiedades anti-oxidantes (Moura et al., 2007); las saponinas y sus
propiedades inmunoestimulantes (Rajput et al., 2007). Por otra parte, existen
muchos trabajos que sealan que tambin es fundamental el aporte energtico
en los mecanismos inmunolgicos (Calder y Kew, 2002; Wintergerst et al.,
2007; Marimuthu et al., 2012), por lo que el mayor contenido de nutrientes
presentes en el extracto acuoso de maca tambin contribuiran a los
resultados observados.
77
7. CONCLUSIONES
1. La dosis de 130 mg/kg de ciclofosfamida (CF) induce inmunosupresin

experimental que se mantuvo hasta 5 das despus de su aplicacin.
2. La administracin del extracto acuoso de maca por dos meses no result
hepatotxico para los animales de experimentacin y result
hepatoprotector frente a la toxicidad inducida por ciclofosfamida.
3. El extracto acuoso de maca estimula la produccin de mRNA para las
citoquinas IL-3, GM-CSF e IL-7 en el bazo de los ratones evaluados dos
das despus de la inmunosupresin con ciclofosfamida.
4. En los ratones tratados con el extracto acuoso y evaluados dos das
despus de la inmunosupresin muestran una mayor expresin de IL-7 en
la mdula sea. A 5 das post-IS, el extracto estimula la produccin de
mRNA para IL-3 y GM-CSF.
5. El extracto acuoso de maca a la dosis de 100 g/ml estimula la
proliferacin de clulas mononucleares de mdula sea in vitro y provoca
el incremento significativo en los niveles de mRNA para IL-7.
6. El extracto acuoso de maca induce el incremento del recuento de clulas
nucleares de mdula sea, sangre perifrica y colonias macroscpicas
endgenas en el bazo, adems de una mayor respuesta proliferativa a
mitgenos de los linfocitos T y B en los ratones inmunosuprimidos con CF.
78
8. RECOMENDACIONES
Es importante profundizar los estudios a nivel celular y molecular del

hipoctilo de maca sobre la hematopoyesis, para determinar la poblacin
celular sobre la que acta y las vas intracelulares implicadas. Se puede
realizar cultivos de clulas de mdula sea en ensayos clonognicos o de
formadoras de colonias en medio semislido, que permitira conocer la
poblacin progenitora hematopoytica sobre la que tiene efecto el extracto
de maca.
Sera interesante realizar estudios del efecto de la maca a nivel de la
eritropoyesis. Se puede partir de animales con anemia inducida y evaluar si
la administracin del extracto acuoso puede revertir la anemia, incrementar
la produccin de eritropoyetina y la expresin de genes relacionados al
linaje eritroide.
Evaluar diferentes fracciones del extracto acuoso de maca sobre la
proliferacin, produccin de citoquinas hematopoyticas y formacin de
colonias de las clulas de mdula sea, e identificar el metabolito
responsable del efecto observado.
79
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10. ANEXOS
Posible mecanismo modulador de la hematopoyesis producido por el

extracto acuoso de maca
A partir de los resultados obtenidos, se intentar representar grficamente

las posibles relaciones entre el extracto acuoso empleado en las pruebas y
sus clulas blanco para la produccin de las citoquinas estudiadas.
El extracto acuoso de maca podra actuar reduciendo la formacin de

radicales libres producidos por la ciclofosfamida en las clulas con alta
actividad proliferativa, como las clulas madre/progenitoras hematopoyticas,
esto podra estar mediado por los flavonoides u otros metabolitos presentes en
el extracto, tambin podra actuar inhibiendo directamente la accin alquilante
de CF sobre el DNA de las clulas proliferantes; aunque no se puede
descartar un efecto a nivel de membrana, con una accin similar a citoquinas
y/o activando vas de sealizacin intracelulares implicadas en la produccin
de citoquinas hematopoyticas. Esto dara como resultado una mejor
respuesta hematopoytica a la mielosupresin, como una mayor produccin
de IL-3 y GM-CSF por parte de los linfocitos T y de IL-7 por parte de las
clulas estromales, principales productoras de estas citoquinas, demostrado
por la mayor expresin de mRNA para estas tres citoquinas. La IL-7 adems
de estimular una mayor proliferacin y diferenciacin de los progenitores hacia
el linaje linfoide, tiene efecto sobre los linfocitos maduros, como los linfocitos
T. La sobreexpresin de estas tres citoquinas atena la mielosupresin
inducida por ciclofosfamida, reflejado en un mayor recuento celular de mdula
sea, sangre perifrica y esplnico de clulas progenitoras y maduras (Figura
28).
92
Figura 28. Posible mecanismo de accin del extracto acuoso de maca sobre
las clulas hematopoyticas. El EAc de maca tendra un efecto (directo o
indirecto) sobre las clulas hematopoyticas (E, SC, P, T) estimulando la
produccin de citoquinas hematopoyticas como IL-3, GM-CSF e IL-7 que a su
vez actuaran sobre ellas mismas u otras clulas, induciendo la hematopoyesis
(Linaje linfoide y mieloide) y ofreciendo proteccin frente a CF.
EAc: Extracto acuoso de maca
CF: Ciclofosfamida
E: Clulas estromales
SC: Clula madre
P: Clula progenitora,
T: Linfocitos T
L: Clulas del linaje linfoide
M: Clulas del linaje mieloide
GM-CSF: Factor estimulador de colonias de granulocitos y monocitos
93

Extracto Acuoso de Lepidium Meyenii

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UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

(Universidad del Per, Decana de Amrica)

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS

PRODUCCIN DE mRNA PARA CITOQUINAS

Tesis para optar al Grado Acadmico de

Bachiller Evelyn Katy Alvarez Salazar

porque Jehov tu Dios estar contigo en dondequiera que vayas

A Dios, por acompaarme y guiarme a lo largo de mi vida, por ser mi fortaleza

LISTA DE TABLAS III

2.1 Lepidium meyenii WALPERS (MACA) 3

2.2 HEMATOPOYESIS Y CITOQUINAS 6

2.4 EMPLEO DE PLANTAS COMO PROTECTORES FRENTE A DROGAS 11

4.1 ELABORACIN DEL EXTRACTO ACUOSO (EAc) DE MACA E 14

4.2 INMUNOSUPRESIN EXPERIMENTAL CON CICLOFOSFAMIDA 18

4.3 EVALUACIN DEL EFECTO MODULADOR DEL EAc DE MACA SOBRE 22

4.4 EVALUACIN DEL EFECTO MODULADOR DEL EAc DE MACA SOBRE 35

4.6 ANLISIS ESTADSTICO 43

5.1 IDENTIFICACIN DE LOS PRINCIPALES COMPONENTES PRESENTES 44

5.2 INMUNOSUPRESIN EXPERIMENTAL CON CICLOFOSFAMIDA Y 45

5.3 EFECTO DEL EAc DE MACA SOBRE LA PRODUCCIN DE mRNA PARA 48

5.4 EFECTO MODULADOR DEL EAc SOBRE LA PROLIFERACIN 56

5.5 INFLUENCIA DEL TRATAMIENTO CON EL EAc DE MACA SOBRE LA 58

Lepidium meyenni (maca) es un cultivo tradicional de los Andes Centrales

En el presente estudio, se trataron ratones Balb/c a dosis de 200 mg/kg de

La administracin de EAc en ratones IS, increment (p<0.05) la produccin

El EAc de maca estimula la produccin de mRNA para las tres citoquinas

Palabras clave: Lepidium meyenii, maca amarilla, extracto acuoso,

Lepidium meyenni (maca) is a traditional crop of the Central Andes of Peru.

The administration of EAc in immunosuppressed mice, increased mRNA

Keywords: Lepidium meyenii, yellow maca, aqueous extract,

Tabla 1. Protocolo empleado para el tratamiento con el extracto acuoso de

Figura 1. Hipoctilos del Lepidium meyenii Walpers (maca), ecotipo amarillo.

EAc: Extracto acuoso

La hematopoyesis es el proceso de formacin, desarrollo y maduracin de

La mdula sea es un lugar de continua proliferacin y renovacin de

En los ltimos aos se est produciendo una tendencia de rpido

Es as como en los ltimos aos se han evaluado cientficamente muchas

Dado que estas clulas inmaduras responden a una serie de citoquinas

2.1 Lepidium meyenii WALPERS (MACA)

Es un cultivo tradicional de los Andes Centrales Peruanos, que crece y se

Los cultivares de maca que existen en la actualidad se diferencian

El nombre cientfico Lepidium meyenii Walpers fue designado por el doctor

Los anlisis bromatolgicos realizados a la maca comprobaron su alto valor

En 1961 se report por primera vez la presencia de alcaloides, glucsidos,

Alcaloides, hasta 4 fracciones macana 1, 2 3 y 4 (Dini et al., 1994)

Adems de esteroles (Gutirrez et al., 2009), antocianinas, flavonoides

Algunas de las propiedades atribuidas a la maca han sido comprobadas

Esta planta tambin ha demostrado poseer actividades

2.2 HEMATOPOYESIS Y CITOQUINAS

Es el proceso a travs del cual se generan las clulas de la sangre y ocurre

El sistema hematopoytico est formado por diferentes tipos celulares

Clulas madre hematopoyticas (CMH) (0.01%), son las ms primitivas

La hematopoyesis no solo puede ocurrir en la mdula sea sino tambin en

Las citoquinas son piezas claves en la regulacin de la hematopoyesis,

La Interleuquina 3 (IL-3) tambin conocida como factor estimulador de

La Interleuquina 7 (IL-7) es una glicoprotena de 20-28 KD, producida por

La ciclofosfamida (CF) es una de las drogas alquilantes ms utilizada en

La supresin de las funciones de la mdula sea o mielosupresin es uno

Salem et al. (2012) reportaron que la administracin de 4 mg ciclofosfamida

Sefc et al. (2003) en un trabajo realizado con ratones C57B1/10SnPh

Actualmente, se estn aplicando estas drogas antineoplsicas en

2.4 EMPLEO DE PLANTAS COMO PROTECTORES FRENTE A DROGAS

Muchas de las plantas utilizadas en la medicina tradicional poseen efecto

La administracin de los constituyentes de 4 plantas chinas (Frmula Si-