http://www.senasa.gob.

ar/informacion/laboratorio
Universidade Tecnolgica Federal do paran

Lacase
Produo e Atividade de
enzimas

Aluno: Sergio Luis Mndez Hoyos

Prof. Admir Targino
Prof. Juliana Feijo
INTRODUO
Lacase (P-difenol: oxgeno oxidoreductasas) EC 1.10.3.2

Definio:

Enzima capaz de realizar a degradao da

lignina atravs da quebra das ligaes nao
aromticas e oxidao dos compostos
fenlicos da lignina.

As enzima lignoliticas mais efetivas: lignina

peroxidase (lip) manganes peroxidase (Mnp) e
Lacases
Representaao de listones da estructura
cristalina determinada por Rayos X de
lacasa III de T. Versicolor
Riva, 2006; Flores, etal.,2009; Brijwani, et al.,
2010
 Aplicaes, atualidade e potencias

Indstria
Tratamento Txtil
Indstria Biosensores Sntese
de gua (Corant
alimentcia es), Qumica
poluda
Celulose
e Papel
O uso de laccases em diferentes campos foi estudado nas ltimas dcadas.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3989153/
 Objetivos de projeto

Este projeto objetiva valorizar a lignina, atravs de sua

fragmentao por enzimas ligninolticas bacterianas, para
produzir compostos qumicos teis para indstrias qumicas,
cosmticas e farmacuticas, sem agredir o ambiente.
 Agua Bruta Muestra

Entrada estao de tratamento de gua (AB) 500 ml

sada dos fi ltros (AF) 1L
Agua Clorada Muestra
reservatrio de gua (AR) 2L
rede de distribuio (AD) 1L

http://www.senasa.gob.ar/informacion/laboratorio
 Faces do projeto

Isolamento de bactrias do ambiente

Screening de bactrias produtoras de lacase

Identificao de bactrias produtoras de lacase

Produo de lacase intra e extracelular

Quantificao de lacase
 Amostras
Enterococos,Lago Igapo, Sedimento Larisa.

Estoque de 70 isolados pertencentes Laboratrio de Microbiologia

Bsica e Aplicada (LAMBA)-UTFPR.

A cultura estoque encontra-se meio Brain Heart Infusion (BHI) acrescido

de 20% de glicerol.
Materiales y metodos

Lignine Abts
https://www.ajol.info/index.php/ajb/article/vi
ew/127446
 Isolamento

Clulas do estoque sero ativadas por inculo em agar

Cultivo bacteriano MH, seguido de incubao a 37C por 24 horas.

Seleao de colncias
As colncias positivas positivas foram
selecionadas no mesmo meio para confirmar a
atividade positiva com, pela formao de um
halo avermelhado.

Fig. Meios de cultura solida e
liquida
https://www.ajol.info/index.php/ajb/article/view/127446
screening
Cada cepa de isolado foi cultivada em caldo
nutritiente com contendo 0,1% de Lignina/37 C
Actividade enzimatica
Os sobrenadantes foram coletados por
centrifugao e utilizados como enzima bruta. A
enzima bruta e examinada quanto lacase
atividade. O crescimento da cultura celular
medido pelo uso de densidade a 600 nm
 Screening

SCREENING
Meio Caldo Nutriente 30ml
(0,2mM CuSO4, 1% de tween e 0,3%
de Lignina+ 2% DMSO
incubao a 37C/ 24 hrs,
agitao de 120 rpm

ISOLADOS BACTERIANOS
inculo em agar MH,
incubao a 37C por 24 horas.
Identificao de bactrias produtoras de lacase
Tino de gram:
As caractersticas microscpicas sero
avaliadas a reao morfotintorial de Gram.
Ensayo enzimatico

A produo de lacase em cultura

liquida ser realizada segundo
metodologia descrita por
Mongkolthanaruk et al. [13], com os
isolados ABTS-positivos em placa.

Controle
200 ul Sobrenadante meio CN+Lignina Sem ABTS
800ul Tampao acetato de sodio +Abts
(0,25mM)

https://www.seimc.org/contenidos/documentoscientificos/procedimientosmicrobiologia/seimc-
procedimientomicrobiologia37.pdf
Conclusies
As enzimas constituem uma excelente estratgia em processos de degradao
porque diminuem etapas qumicas, o uso de solventes e reagentes orgnicos,
alm de no polurem o ambiente.

Enzimas microbianas ainda no descritas podero tambm ser descobertas,

dado o pouco conhecimento sobre a degradao enzimtica de ligaes
qumicas da lignina.

Bactrias de diversos ambientes sero isoladas, selecionadas e identificadas.

Aquelas que forem capazes de crescer e degradar lignina em seus fragmentos
e compostos aromticos, sero avaliadas.
Bibliografa

Riva, S., 2006. Laccases: blue enzymes for green chemistry. TRENDS in Biotechnology, 24(5), pp. 219-
226.

Rodrguez-Couto, S., 2011. Production of laccase and decolouration of the textile dye
Remazol Brilliant Blue R in temporary immersion bioreactors. Journal of Hazardous Materials ,
Issue 194, pp. 297-302.

Brijwani, K., Rigdon, A. & Vadlani, P., 2010. Fungal Laccases: Production, Function, and Applications
in Food Processing. Enzyme Research, Volumen 2010, pp. 1-10.

Flores, C. y otros, 2010. Production of laccases by Pleurotus ostreatus in submerged fermentation

in co-culture with Trichoderma viride. Journal of Applied Microbiology, Issue 108, pp. 810-817.

Manjarrs K., Castro A. y Rodrguez E. 2010. Produccin de lacasa utilizando Pleurotus

ostreatus sobre cscara de pltano y bagazo de caa. Revista Lasallista de Investigacin. 2 (7),
pp 9-15.
PRODUAO DE LACCASAS EM
LABORATORIO
E ST U D I O C O M PA RA T I V O 1
 Comportamento independente durante a produo e atividade de laccasas
bacterianas com indutores e ons metlicos

https://www.ajol.info/index.php/ajb/article/view/127446
Objetivo de artigo 1

O objetivo deste estudo foi isolar estirpes

bacterianas que produzem enzimas
laccasas e capacidade do enzima
extracelular para reduzir os corantes em
um curto perodo de cultivo.

Fig. Corantes
artificiais.
https://www.ajol.info/index.php/ajb/article/view/127446
 Atividade
Cultivo bacteriano enzimatica

Determinao de
propriedades de
enzimas brutas a Temperatura e pH
diferentes temperaturas
e pH
METODOLOGIA
sobrenadante
guardado para
utilizao como
ADN molde.

O modelo de DNA
Identificao de foi adicionado a 45
bacterias laccasas l de Mistura Mestre
de Reao em PCR

Secuenciao
Os indutores foram adicionados em caldo nutritivo para melhorar a quantidade de produo de lacase:

https://www.ajol.info/index.php/ajb/article/view/127446

As quatro cepas seleccionadas, codificadas G1, G2, G32 e G44, que possuem potencial de atividade
de laccasa em meio ambiente a 37 C, usando guaiacol como fonte de energia.
Propriedades de enzimas brutas a
diferentes temperaturas e pH
Temperatura

O valor ideal da temperatura foi de 37 C para as

estirpes G1 e G44, proporcionando atividade de
Laccase a 75 e 56 mU / L, respectivamente

G32 teve uma temperatura ideal a 32 C.

So a cepa G2 apresentou maior atividade de lacase
a (45 C)

pH

O pH ptimo foi determinado pH (3,0 a 9,0) para a

atividade de lacase a 32 C.

Reao em cadeia da polimerase
(PCR)
http://biologia.laguia2000.com/tecnicas-en-
biologia/explicando-el-protocolo-de-la-pcr
ADN molde
Pela suspenso de clulas de cepas bacterianas foi
10000 rpm/ 5 minutos
Se uso sobrenadante como ADN molde.
O modelo de DNA foi adicionado a 45 l de
DreamTaq (PCR) Mistura Mestre usando o primeiro
par de:
27f (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ')
1492r (5'-GGTTACCTT-GTTACGACTT-3 ').
condies de amplificao
As condies de amplificao foram as seguintes:
95 / 3 min;
35 ciclos de desnaturao a 95 C /30 s,
Recozido a 55 C/ 30 s,
Extenso a 72 C/2 minutos;
E a extenso final a 72 C /10 min.
Sequenciao
sequenciao de ADN foi realizada. Asequncia
foi comparada com a base de dados de NCBI de
nucletidos (Www.ncbi.nih.gov/blst) e o alinhamento
mltiplo de sequncias foi realizada usando o
CLUSTALW
(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa / Clustalw2).
 Identificao de bacterias
laccasas

Identificaao

A cepaG1, G2, G32 e G44 pertencia a

Rhodococcus sp., Enterobacter sp.
Staphyococcus saprophyticus e Delftia
tsuruhatensis, respectivamente, com 99% de
identidade.

Rhodobacter capsulatus contedo protena

de lacase putativa (Alexandre e Zhulin, 2000)

http://genomes.urv.cat/UPGMA/
decolorao
PRODUAO DE LACCASAS EM
LABORATORIO
E ST U D I O C O M PA RA T I V O 2
 DR. ROBERTO PARRA
SALDVAR

Uso y produccin de enzimas lacasas para aplicaciones en

remediacin de efluentes con contaminantes emergentes

Pycnoporus sanguineus
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3989153/
 Products

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3989153/
 TESTE DE PRODUO DE LACASE

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/P
MC3989153/
 Materiais e Metodos do Artigo 2

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3989153/
 Resultados do Artigo 2
Actividade Lacase

Fig. 1 Optimizaao de meios

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3989153/