LA REPLICACIN

Escherichi coli dividindose Metafase mittica de Vicia faba Replicacin semiconservativa

Funciones que debe cumplir el cromosoma: Significado gentico de la Replicacin.

Modelos de Replicacin Propuestos: Semiconservativo, Conservativo y Dispersivo.

La replicacin del ADN bacteriano se ajusta al modelo Semiconservativo: Experimentos de Meselson y Stahl (1958).

El ADN bacteriano es circular: Experimento de Cairns (1963).

La divisin celular en eucariontes: mitosis y citocinesis.

La reproduccin cromatdica en eucariontes se ajusta al modelo semiconservativo: Experimento de Taylor y col.

(1957).

Alteraciones del ciclo celular.

Caractersticas de la Replicacin en Bacterias: nico punto de origen, replicn.

Eucariontes: Muchos orgenes de replicacin, mltiples replicones.

Direccin de sntesis 5' - 3', Bidireccional.

Semidiscontinua, Fragmentos de Okazaki.

Iniciacin mediante ARN cebador.

El crculo rodador.

Replicacin de los telmeros.

Las ADN polimerasas de E. coli.

Las ADN polimerasas eucariticas.

Replicacin del ADN miotocondrial: Lazos D.

Otras enzimas que intervienen en la replicacin: ligasas, girasas, topoisomerasas, etc.

FUNCIONES QUE DEBE CUMPLIR EL CROMOSOMA: SIGNIFICADO GENTICO DE LA REPLICACIN

Las principales funciones que debe cumplir un cromosoma son la de replicarse (producir copias de si mismo), la de
transmitirse de una clula a otra y de una generacin a la siguiente y la de expresar la informacin que contiene.

Bacteria Bacteria dividindose Bacterias descendientes

El significado gentico de la replicacin es el de conservar la informacin informacin gentica, de manera que cuando
una bacteria se divide, de lugar a una bacteria hija que contenga la misma informacin gentica.
En organismos eucariontes el significado de la divisin celular es el mismo, una clula cuando se divide origina dos
clulas hijas idnticas con la misma informacin gentica.

MODELOS DE REPLICACIN PROPUESTOS: SEMICONSERVATIVO, CONSERVATIVO Y DISPERSIVO

Modelo Semiconservativo: Cuando Watson y Crick (1953) propusieron el modelo de la Doble Hlice indicaron que dicho
modelo sugera una forma sencilla de replicacin. El modelo de replicacin propuesto por Watson y Crick supona que el
ADN doble hlice separa sus dos hebras y cada una sirve de molde para sintetizar una nueva hebra siguiendo las reglas
de complementariadad de las bases nitrogenadas. Dicho modelo recibin el nombre de Semiconservativo, ya que las dos
dobles hlices recin sintetizadas poseen una hebra vieja (una mitad vieja) y otra hebra nueva (mitad nueva).

Frente al modelo Semiconservativo propuesto por Watson y Crick (1953) se postularon otros posibles modelos de
replicacin del ADN, uno de ellos se denomin Modelo Conservativo y otro Modelo Dispersivo.

Modelo Conservativo: cuando el ADN doble hlice se replica se producen dos dobles hlices, una de ellas tienen las dos
hebras viejas (esta intacta, se conserva) y la otra doble hlice posee ambas hebras de nueva sntesis.

Modelo Dispersivo: Cuando el ADN doble hlice se replica se originan dos dobles hlices, cada una de ellas con hebras
que poseen tramos viejos y tramos de nueva sntesis en diferentes proporciones.

Los siguientes esquemas representan los tres Modelos de Replicacin:

Semiconservativo Conservativo Dispersivo

LA REPLICACIN DEL ADN BACTERIANO SE AJUSTA AL MODELO SEMICONSERVATIVO: EXPERIMENTOS DE

MESELSON Y STAHL (1958)

Meselson y Stahl (1957) disearon un experimento para tratar de averiguar la forma en la que se realiza la replicacin del
ADN en E. coli, es decir, la pregunta que se plantearon fue: Qu modelo de replicacin del ADN sigue E. coli,
semiconservativo, conservativo o dispersivo?. Para contestar a esta pregunta, disearon un experimento en el que
marcaban el ADN de la bacteria E. coli con Nitrgeno pesado N15, para ello hicieron crecer las bacterias durante 14
generaciones sucesivas en un medio que contena como nica fuente de Nitrgeno N15. Durante estas 14 generaciones el
ADN de las bacterias las bacterias se haba sintetizado con bases nitrogenadas con Nitrgeno pesado (N15).
Posteriormente, comprobaron que podan distinguir el ADN del las bacterias que crecan en un medio normal (con N14) del
ADN de las bacterias que haban crecido durante 14 generaciones en N15. Para ello extrajeron el ADN de ambos tipos de
bacterias y lo centrifugaron en un gradiente de densidad de CsCl. El resultado fue que la densidad del ADN de las
bacterias que haban crecido en presencia de N15 era mayor que el ADN de las bacterias que haban crecido con N14.
Una vez comprobado que eran capaces de distinguir el ADN de ambos tipos de bacterias, continuaron el experimento de
la siguiente forma: Las bacterias que haban estado creciendo en Nitrgeno pesado (N15) las pasaron a un medio de
cultivo que contena N14 (Nitrgeno normal) y a distintos tiempos, media generacin, una generacin, dos generaciones,
tres generaciones de replicacin, tomaban una muestra del cultivo bacteriano, extraan el ADN y centrifugaban en
gradiente de densidad de CsCl.
 Esquema Experimentos Meselson y Stahl (1958)

Cuando extraan el ADN de la bacterias que llevaban una generacin creciendo en N14 y centrifugaban en CsCl, obtenan
una sola banda de densidad intermedia (N14-15)entre la del ADN N14 y el ADN N15. Si extraan el ADN de las bacterias
que llevaban dos generaciones creciendo en N14 y centrifugaban en gradiente de CsCl obtenan dos bandas, una
correspondiente al ADN N14 y otra de densidad intermedia (N14-15) entre la del ADN N14 y el ADN N15. La absorbancia a
260 nm es directamente proporcional a la cantidad de ADN que contiene una banda, de manera que al medir la
absorbancia de las dos bandas obtenidas en la segunda generacin, obtenan que ambas contenan igual cantidad de
ADN (1:1). Al extraer y centrifugar en CsCl el ADN de las bacterias que llevaban tres generaciones creciendo en N14,
obtenan dos bandas, una correspondiente al ADN N14 y otra de densidad intermedia (N14-15) entre la del ADN N14 y el
ADN N15. La cantidad de ADN que contena la banda correspondiente al ADN N14 era tres veces mayor que la encontrada
en la banda de densidad intermedia (N14-15), proporcin (3:1).

Los resultados obtenidos por Meselson y Stahl (1958) se ajustaban a un modelo de replicacin semiconservativo. Para
asegurarse, aislaron la banda de ADN de densidad intermedia (N14-15) obtenida a partir de las bacterias que llevaban una
generacin en N14, desnaturalizaron el ADN de la banda mediante calor para separar sus dos hlices y, mantenindolas
desnaturalizadas, centrifugaron en CsCl. Si la replicacin de E. coli se ajustaba al modelo semiconservativo, una de las
hlices debera estar construida con N15 (la vieja) y la otra hlice con N14 (la nueva) y, al centrifugar en gradiente de
densidad esperaramos obtener dos bandas una ms densa correspondiente a la hlice construida con N15 y otra menos
densa sintetizada con N14. El resultado obtenido por Meselson y Stahl (1958) fue precisamente el esperado para una
replicacin semiconservativa.
 Resultados centrifugacin CsCl Matthew Meselson y Franklin W. Stahl

Si la replicacin del ADN de E. coli se ajustar al modelo Conservativo al centrifugar el ADN de las bacterias despus de
un generacin en medio con N14, hubieran obtenido dos bandas una de densidad correspondiente al N14 y otra de
densidad correspondiente al N15. Nunca habran observado, en este caso, una banda de ADN de densidad intermedia
(N14-15).

EL ADN BACTERIANO ES CIRCULAR: EXPERIMENTO DE CAIRNS (1963)

Cairns en 1963, llev a cabo otro experimento en la bacteria E. coli que adems de demostrar que la replicacin de su
ADN se ajustaba al modelo Semiconservativo propuesto por Watson y Crick (1953), tambin demostraba que el ADN de
E. coli es circular. Se trata se la primera evidencia citolgica (mediante observacin al microscopio) de la circularidad del
cromosoma bacteriano, ya que mediante tcnicas de construccin de mapas de conjugacin, ya se haba demostrado
previamente por Jacob y Wollman (1958) que el ADN bacteriano tena un mapa circular.

El experimento que realiz Cairns (1963) consisti en mantener un cultivo de E. coli creciendo durante dos generaciones
sucesivas en un medio que contena Timidina tritiada (TH3), es decir, utilizaron un nucletido (la Timina) marcado con un
istopo radiactivo (tritio, H3). Por tanto, cuando las bacterias sintetizaban su ADN empleaban dicho nucletido marcado.
Adems, Cairns (1963) desarroll un sistema para extraer el ADN de E. coli sin romperlo (intacto) y extenderlo sobre un
portaobjetos para posteriormente realizar una autorradiografa, revelarla y observar los resultados al microscopio. Para
realizar la autorradiografa, empleaba una emulsin fotogrfica que colocaba en contacto directo con la preparacin, de
forma que en aquel lugar de la preparacin en que exista TH3, las partculas b del tritio impresionaban la emulsin
fotogrfica y al revelarla apareca una macha o punto en ese lugar. Las autorradiografas correspondientes a la primera
generacin de replicacin presentaban imgenes de puntos formando un crculo. En las autorradiografas
correspondientes a la segunda generacin de replicacin se observaban imgenes de puntos en forma de la letra griega q
pero que mostraban una regin del interior con doble cantidad de puntos.
Cairns (1963) interpret que el cromosoma de E. coli era circular, que se replicada de modo semiconservativo, que exista
un punto de inicio de la replicacin, un origen, y un punto de crecimiento (PC). Sin embargo, esta interpretacin fue
errnea, ya que en E. coli existe un solo punto de iniciacin de la Replicacin (Ori C) pero existen dos puntos de
crecimiento (PC), ya que la replicacin en E. coli, como veremos ms adelante es bidireccional.

Autorradiografa de la 2 generacin de Replicacin con TH3 J. Cairns

LA DIVISIN CELULAR EN EUCARIONTES: MITOSIS Y CITOCINESIS.

El ciclo celular consta esencialmente de dos fases que habitualmente se alternan, La interfase y la divisin celular. A su
vez la Interfase de subdivide en periodo G1, periodo de sntesis S y periodo G2. La duracin relativa de G1, S y G2 vara
de un organismo a otro y dentro del mismo organismo segn el tejido. La divisin celular comprende a su vez dos
fenmenos diferentes e independientes que son la mitosis o cariocinesis (reparto del material nuclear) y la citocinesis
(reparto del citoplasma). Habitualmente, despus de una mitosis se produce una citocinesis. En G1 los cromosomas estn
constituidos por un solo cromatidio procedente de la segregacin anafsica anterior. Para que una clula somtica vuelva
a entrar en divisin es necesario que antes se replique el material hereditario, por tanto, las clulas que entran en mitosis
han pasado previamente por un perodo S de sntesis de ADN. De forma que cuando las clulas entran en mitosis, los
cromosomas estn en estado de dos cromatidios.

La Mitosis o Cariocinesis (reparto del material nuclear) consta de laza siguientes fases: Profase, Metafase, Anafase y
Telofase. Cuando una clula somtica con 2n cromosomas entra en mitosis, todos sus cromosomas estn en estado de
dos cromatidios. Los dos cromatidios hermanos de cada cromosoma son idnticos, contienen la misma informacin
gentica ya que se han originado a partir de doble hlice de ADN mediante replicacin semiconservativa.

En la Interfase el material nuclear, la cromatina, se encuentra descondensada y se observa el nucleolo.

Profase: la cromatina se va contrayendo gradualmente y al final de la profase desaparece la membrana nuclear y el

nucleolo y los cromosomas comienzan a dirigirse al centro de la clula al ecuador.

Metafase: los cromosoma alcanzan su mximo grado de condensacin presentando sus bordes ntidos y se sitan
en la placa ecuatorial (centro de la clula). Tiene lugar la insercin de los microtbulos (fibras) del huso acromtico
en los cinetocoros centromricos. En la placa ecuatorial hay 2n cromosomas constituidos por dos cromatidios.

Anafase: segregacin o separacin de los cromatidios hermanos de cada cromosoma y emigracin a polos
opuestos. Este tipo de segregacin se denomina Anfitlica, los dos cromatidios de un cromosoma se separan y
viajan a polos anafsicos opuestos. A cada polo viajan 2n cromatidios.

Telofase: Termina la emigracin a polos opuestos se descondensan los cromatidios se reconstruye la membrana
nuclear y se reorganiza el nucleolo. Finalmente aparecen dos ncleos hijos idnticos que cada uno contiene 2n
cromatidios.

Despus la citocinesis reparte el material citoplasmtico y aparecen dos clulas hijas idnticas. La citocinesis en clulas
vegetales se produce por coalescencia de vesculas del aparto de Golgi que dan lugar al fragmoplasto figura en forma de
tonel que adquiere el huso acromtico, al ser empujadas sus fibras hacia fuera, el crecimiento de dicho tabique se
produce del interior hacia el exterior de la clula. En las clulas animales la citocinesis tiene lugar por estrangulamiento de
fuera hacia dentro.

Fases del ciclo celular : meristemo radicular de cebolla

Interfase Profase Metafase Anafase Temprana

Anafase Tarda Telofase temprana Telofase tarda Dos clulas

LA REPRODUCCIN CROMATDICA SE AJUSTA AL MODELO SEMICONSERVATIVO: EXPERIMENTO DE TAYLOR

Y Col. (1957).

Taylor y colaboradores (1957) realizaron un experimento con clulas del meristemo radicular de Vicia faba (juda) para
tratar de averiguar como tiene lugar la replicacin de los cromatidios en esta especie eucarionte. El experimento consisti
en someter a las races durante un periodo de Sntesis (periodo S) a la accin de la Timidina tritiada (TH3) y,
posteriormente observar el patrn de marcaje radiactivo de los cromosomas en la primera metafase mittica despus de
la incorporacin del istopo y en la segunda metafase mittica. Para ello, despus de la incorporacin del istopo cortaron
las races las aplastaron sobre un portaobjetos y despus realizaron una autorradiografa.

Las autorradiografas obtenidas ponan de manifiesto que las clulas de la primera metafase mittica despus de la
incorporacin del istopo tenan todos sus cromosomas marcados en sus dos cromatidios con timidina tritiada (TH3). Sin
embargo, las clulas de la segunda metafase mittica despus de la incorporacin del istopo tenan todos sus
cromosomas marcados pero solamente en uno de sus dos cromatidios.
La explicacin que dieron a estos resultados fue que el cromatidio se comportaba como si fuera una doble hlice de ADN
y que se replicaba de forma semiconservativa. Para poder distinguir las clulas del meristemo radicular de Vicia faba de la
1 Metafase mittica de las clulas de la 2 Metafase mittica, trataron las raices con colchicina durante la primera divisin
mittica. La colchicina inhibe la formacin de las fibras del huso acromtico y, como consecuencia, se impide la anafase o
separacin de los cromatidos hermanos a polos opuestos apareciendo clulas con doble cantidad de cromosoma
(poliploides). Por tanto, las clulas de la 2 Metafase tenan doble nmero de cromosomas que las clulas de la 1
Metafase.

El siguiente esquema pone de manifiesto que si se supone que el cromatidio es una doble hlice de ADN que se replica
de forma semiconservativa, se obtienen los resultados observador por Taylor y colaboradores, es decir, todos los
cromosomas de la clula estn marcados en sus dos cromatidios en la 1 Metafase y todos los cromosomas de la clula
estn marcados en un solo cromatidio en la 2 Metafase.

Existen mtodos de tincin ms recientes que permiten comprobar sin necesidad de realizar un marcaje radiactivo que la
replicacin de los cromatidios se ajusta al modelo semiconservativo. Las clulas pasan por dos periodos de sntesis
sucesivos en presencia de bromodesoxiuridina (BUdR). Posteriormente se tien los cromosomas con Giemsa y con un
colorante fluorescente. La bromodesoxiuridina es un anlogo de la Timina y la sustituye durante la replicacin. Los
cromatidios constituidos por dos cadenas con BUdR se tien de color ms claro que los cromatidios que tienen una hlice
original y otra con BUdR que se tien de color oscuro. Este tipo de tincin origina los que se denomina cromosomas en
arlequn, y es especialmente adecuado para distinguir intercambios entre cromtidas hermanas.
 2 Metafase (cromosomas en arlequn)

ALTERACIONES DEL CICLO CELULAR

Lo habitual es que despus de un perodo S de sntesis se produzca una mitosis o cariocinesis seguida de una citocinesis.
Sin embargo, en ocasiones en algunos tipos de clulas animales o vegetales de forma natural o bien mediante
tratamientos con determinados compuestos, es posible obtener variaciones en el ciclo de divisin.

Las principales variaciones en el proceso de divisin celular se han resumido en la siguiente tabla:

VARIACIONES EN EL CICLO DE DIVISIN CELULAR

Endorreduplicacin: Varios perodos S sucesivos sin entrar en mitosis.
Variaciones en la Cuadruplocromosomas. Politenia (cromosomas gigantes de Drosophila
Replicacin y reparto del melanogaster).
material hereditario
Haplocromosomas: Dos mitosis sucesivas sin perodo S entre ambas.
Endomitosis: No desaparece la membrana nuclear, mitosis dentro del ncleo.
Aparecen clulas poliploides.
Variaciones que afectan Variaciones en la anafase: inhibicin de la formacin del huso acromtico. Con
a los estados mitticos colchicina (c-mitosis) mediante anoxia (a-mitosis). Se duplica el nmero de
cromosomas y aparece una clula poliploide.
No reorganizacin del nucleolo: por mutaciones en la ARN Polimerasa I
Cariocinesis sin Citocinesis: La cafena inhibe la citocinesis, aparecen clulas
binucleadas (con dos ncleos)
Variaciones que afectan a Citocinesis sin Cariocinesis: el bromuro de etidio provoca que las clulas se paren
la citocinesis en relacin en profase y se reparta el citoplasma (citocinesis) sin haberse repartido el material
con la cariocinesis del ncleo.
Citocinesis en clulas anucleadas: en algunos organismos en determinados
momentos se observa que clulas sin ncleo reparten su citoplasma.

CARACTERSTICAS DE LA REPLICACIN EN BACTERIAS: NICO PUNTO DE ORIGEN, REPLICN

Como ya hemos visto la replicacin en bacterias se ajusta al modelo semiconservativo. En las bacterias existe un solo
origen de replicacin, denominado Ori C y, a partir de este nico punto de origen, la replicacin progresa en dos
direcciones, de manera que existen dos puntos de crecimiento (PC) u horquillas de replicacin. El cromosoma bacteriano
ser una unidad de replicacin se le denomina replicn.
El origen de replicacin en E. coli es una secuencia de 245 pb que contiene una secuencia de 13 pb repetida tres veces
en tndem. Adems esta regin contiene cuatro zonas de unin a la protena Dna A que se encarga de separar las hlices
para comenzar la replicacin.

Cuando las molculas de ADN circular se replican se observan lo que se denominan "ojos o burbujas" de replicacin. La
forma que adoptan los intermediarios de la replicacin se parece a de la letra griega .

Burbuja Forma

EUCARIONTES: MUCHOS ORGENES DE REPLICACIN. MLTIPLES REPLICONES.

La principal diferencia de la replicacin de virus y bacterias con la replicacin de eucariontes radica en que los eucariontes
poseen muchos orgenes de replicacin, probablemente debido a la enorme cantidad de ADN que poseen y a que su
material hereditario en la inmensa mayora de los casos esta repartido en varias molculas de ADN distintas o varios
cromosomas. Por tanto, los eucariontes tienen en cada cromosoma muchos orgenes de replicacin, y como
consecuencia, muchos replicones (unidades de replicacin).

Esquema con mltiples orgenes de replicacin Muchos orgenes de replicacin en D. Melanogaster

 DIRECCIN DE SNTESIS 5' - 3', BIDIRECCIONAL

Las ADN polimerasas de E.coli (las enzimas encargadas de sintetizar ADN) solamente saben sintetizar ADN en la
direccin 5' - 3'. Es decir, solamente son capaces de aadir nucletidos al extremo 3' OH de otro nucletido trifosfato. Las
ADN polimerasas necesitan un extremo 3' OH al que aadir nucletidos trifosfato para comenzar la sntesis de ADN.

La replicacin del ADN en E. coli es bidireccional, ya que a partir de un punto de origen progresa en dos direcciones
opuestas, existiendo dos puntos de crecimiento (PC) u horquillas de replicacin. Cuando se mira solamente una de las
horquillas de replicacin, una de las hlices se sintetiza de forma continua, la hlice conductora (tambin llamada hlice
lder), mientras que la otra hlice se sintetiza de manera discontinua, hlice retardada (tambin llamada hlice retrasada),
a base de fragmentos cortos. Si se observan simultneamente las dos horquillas de replicacin, a un lado del origen la
hlice de nueva sntesis se polimeriza de forma continua, mientras que al otro lado del origen se polimeriza de forma
discontinua.

Para demostrar que la replicacin es bidireccional se pueden realizar experimentos que se denominan de pulso y caza, en
los que la clula es expuesta durante un breve periodo de tiempo en un medio con timidina tritiada TH3 (pulso) y despus
se pasa a un medio con timidina no radiactiva (fra) en exceso (caza). Posteriormente se extiende el ADN se un
portaobjetos y despus se realiza una autorradiografa.

Replicacin bidireccional: Experimento de pulso y caza

SEMIDISCONTINUA, FRAGMENTOS DE OKAZAKI

Debido al antiparalelismo de las dos hlices del ADN y a que las ADN polimerasas solamente saben sintetiza ADN en la
direccin 5'P - 3'OH, la sntesis de una de las hebras se puede realizar de forma continua, mientras que la otra hlice para
poder sintetizarla al mismo tiempo se necesita polimerizarla a base de ir aadiendo pequeos fragmentos (fragmentos o
piezas de Okazaki). Como una hlice se sintetiza de forma continua y la otra lo hace de forma discontinua, se dice que la
Replicacin es Semidiscontinua.
 INICIACIN MEDIANTE ARN CEBADOR

Como ya hemos dicho anteriormente, las ADN polimerasas solamente saben sintetizar ADN en la direccin 5' - 3'
aadiendo nucletidos al extremo 3' OH de otro nucletido. Para que puedan iniciar la sntesis de ADN necesitan un
extremo 3' OH al que ir aadiendo nucletidos, y ese extremo 3' OH lo suministra un ARN de pequeo tamao alrededor
de 25 a 30 ribonucletidos que se denomina ARN cebador o "primer".

La sntesis de ADN comienza, por tanto, sintetizando un corto segmento de ARN denominado cebador, dicho cebador lo
sintetiza un enzima denominado Primasa. La Primasa es una ARN polimerasa que utiliza como molde ADN. Todos los
fragmentos de Okazaki comienzan por un Cebador. Posteriormente, la Holoenzima de ADN polimerasa III lleva a cabo la
sntesis del fragmento de ADN correspondiente hasta llegar al siguiente cebador. En ese momento, la ADN polimerasa I
sustituye a la Holoenzima de ADN polimerasa III. La ADN polimerasa I se encarga de retirar el ARN cebador mediante su
actividad exonuetdica 5'P - 3' OH y al mismo tiempo rellena el hueco sintetizando ADN.

Por ltimo, los dos fragmentos de Okazaki tienen que unirse, es necesario enlazar el extremo 3'OH de un fragmento con
el 5'P del siguiente fragmento. Dicha labor de sellado y unin de los sucesivos fragmentos la realiza la Ligasa.
 CRCULO RODADOR

Los mecanismos de replicacin en virus y bacterias dependen de la propia estructura del material hereditario o
cromosoma de la especie procarionte estudiada. Por tanto, el mecanismo de replicacin vara segn se trata de molculas
de ADN circulares doble hlice (E. coli, papovavirus), ADN cirlar de una hlice (fX174), ADN doble hlice lineal con
redundancia terminal (fago T7) o ADN doble hlice lineal con extremos cohesivos (fago l). El mecanismo de replicacin
puede adoptar la forma q (E. coli, plasmidios), el modelo del circulo rodador (fX174, Fago l) o el Lazo de desplazamiento o
lazo D (ADN mitocondrial).

En el modelo del crculo rodador una endonucleasa corta una de las hlices (hlice externa en el esquema) y el extremo 5'
se fija a la membrana. El extremo 3'OH producido por el corte lo utiliza la ADN polimerasa como cebador para ir
aadiendo nucletidos y copiando la otra hlice (hlice interna en el esquema). Por el otro extremo de la hlice cortada (el
extremo 5') tambin se va sintetizando una nueva hebra. Lo que se supone que sucede es que la hlice interna girara de
forma continua en el sentido indicado haciendo que cada vez saliera ms cantidad de la hlice inicialmente cortada por la
endonucleasa. La hlice interna seguira dando vueltas de forma que sera copiada varias veces al igual que la hlice que
emerge por el lado derecho, formndose una molcula ADN doble hlice muy larga que contienen varias copias sucesivas
del ADN del fago. Estas molculas reciben el nombre de multmeros o concatmeros. El el caso del fago l, posteriormente
una endonucleasa denominada ter reconoce la secuencia de doce pares de bases de los extremos cohesivos del fago y
produce un corte asimtrico para liberar copias independientes del ADN doble hlice lineal del fago.

Esquema Circulo rodador Circulo rodador

REPLICACIN DE LOS TELMEROS

Las molculas ADN doble hlice lineal tienen problemas para replicar sus extremos, ya que las ADN polimerasas
necesitan un extremo 3' OH al que ir aadiendo nucletidos. Uno de los extremos de cada hlice (el extremo 5') se puede
copiar sin problemas debido a que viene cebado desde atrs, sin embargo, el extremo contrario (extremo 3') no podra
replicarse ya que no puede ser cebado desde atrs. Como consecuencia quedara un corto segmento al final sin copiarse
y se ira acortando el ADN por ese extremo en cada ronda de replicacin.

Problemas de replicacin de los extremos

Algunos virus resuelven este problema de una manera sencilla. Por ejemplo, el fago l cuyo material hereditario es ADN
doble hlice lineal con extremos cohesivos, lo primero que hace cuando infecta a E. coli y va a replicar su ADN es
convertirse en ADN doble hlice circular a travs de los extremos cohesivos. De este manera, ya han desaparecido los
problemas de replicacin de los extremos lineales.

Otros virus, como los Adenovirus resuelven el problema gracias a la existencia de una protena que se une al extremo 5' y
que contiene un residuo de serina unido a un nuclotido CTP que suministra el extremo 3' necesario para que la ADN
polimerasa pueda cebarse y copiar el extremo. La protena que forma un complejo con la ADN polimerasa tiene 80 Kd, sin
embargo, la protena que aparece en el interior de las partculas virales maduras tiene solamente 55 Kd. Por tanto,
durante la maduracin del virus debe ser procesada y pasar de 80 Kd a 55 Kd. El virus f29 tambin tiene protenas unidas
al extremo 5' implicadas en la replicacin y algunos virus ARN como el virus de la polio poseen protenas de bajo peso
molecular (Vpg) con solo 22 aminocidos estn unidas al extremo 5' .

Replicacin de los extremos en Adenovirus

La replicacin de los extremos de los cromosomas eucariticos tambin supone un problema, ya que los cromatidios son
molculas de ADN doble hlice lineal y se iran acortando en las sucesivas replicaciones. La manera de solventar este
problema consiste en disponer de secuencias repetidas en los extremos, los telmeros eucariticos contienen una
secuencia corta rica en Guanina repetida cientos de veces ( por ejemplo la secuencia 5' TTGGGG 3' en el ciliado
Tetrahymena). Adems, los telmeros poseen extremos 3' monocatenarios que pueden autoaprearse y suministrar un
extremo 3' para replicar los extremos cromosmicos.
Un enzima denominado Telomerasa aade estas secuencias a los extremos cromosmicos. La Telomerasa lleva una
corta secuencia de ARN (por ejemplo AACCCC) que sirve de molde para sintetiza la secuencia repetida de los extremos
(TTGGGG). La telomerasa, es una transcriptasa inversa, ya que tomando como molde ARN sintetiza ADN. La adicin de
estas secuencias cortas que lleva a cabo la Telomerasa contrarresta la tendencia al acortamiento de los telmeros
durante la replicacin normal.

La telomerasa tiene un pequeo fragmento de ARN

LAS ADN POLIMERASAS DE E. Coli.

En la bacteria E. coli Arthur Kornberg encontr tres ADN polimerasas diferentes, la ADN Pol I, ADN Pol II y ADN Pol III.
Por sus estudios sobre la replicacin del ADN y las polimerasas le concedieron el Premio Nobel en 1959.

Las principales etapas de la sntesis de ADN son:

Sntesis de los desoxirribonucletidos monofosfato (dNMPs): dAMP, dTMP, dGMP y dCMP.

Fosforilacin mediante Quinasas de los dNMP, para convertirlos en desorribonucletidostrifosfato dNTPs: dATP,
dTTP, dGTP y dCTP.

Polimerizacin o sntesis del ADN: seleccin de los dNTPs complementarios a las de la cadena molde y formacin
del enlace fosfodister entre el extremo 3' del nucletido (dNTP) anteriormente incorporado y el extremo 5'P del
siguiente dNTP.

Las ADN Polimerasas de E. coli solamente saben sintetizar (polimerizar) ADN en la direccin 5'P - 3'OH.

Las principales caractersticas de las ADN Polimerasas de E.coli, se pueden resumir en la siguiente tabla:

ADN Pol I ADN Pol II ADN Pol III

Estructura

PM (dalton) 109.000 90.000 900.000

Constitucin Monmero Monmero Multmero asimtrico

N Polimerasas/clula 400 Desconocido 10-20

Actividad/Funcin

Polimeras 5'-3' /Elongacin SI SI SI

Exonucleasa 3'-5'/Correctora SI SI SI

Exonucleasa 5'-3'/Reparacin SI NO NO

La ADN Pol III y la ADN Pol I son las enzimas que intervienen directamente en la replicacin del ADN de E. coli. La ADN
Pol I tiene un papel reparador, retira los cebadores con su actividad exonucleasa 5'- 3' y rellena el hueco con su actividad
polimerrasa 5'- 3'.

A la ADN Pol II se la asigna exclusivamente una funcin reparadora, pero la muchas de sus caractersticas y el papel que
juega en la replicacin del ADN, si es que juega alguno, son desconocidas.

La ADN Pol III es la enzima que realiza la mayora de la replicacin del ADN, el corazn cataltico del enzima lo
constituyen las subunidades a (encargada de la polimerizacin), e (realiza la funcin correctora de pruebas) y q
(ensamblaje de las subunidades?). Realmente, el complejo enzimtico que lleva a cabo la replicacin es un multmero
denominado Holoenzima de ADN Pol III que posee muchas cadenas o subunidades polipeptdicas. Este multmero es
realmente un dmero asimtrico, una mitad del dmero se encarga de sintetizar la hlice retardada y la otra mitad sintetiza
la hlice conductora. La subunidad t interviene en la unin del dmero, el complejo g-d produce la unin al ADN molde y la
subunidad b sujeta el enzima al ADN.

Esquema de la formacin y composicin del Holoenzima de ADN Pol III

El proceso de sntesis de ADN tiene que producir dos molculas exactamente iguales, ya que cualquier error que se
cometa durante la replicacin, si no se repara, se convertir en una mutacin. Por tanto, Las ADN polimerasas deben ser
bastante fieles copiando el ADN. Para ello poseen una funcin correctora de pruebas que retira el ltimo nucletido que la
polimerasa haya introducido de forma incorrecta, dicha funcin, se denomina funcin exonucleasa 3' - 5' y la lleva a cabo
la subunidad e de la ADN Pol III.
En el siguiente esquema se indica como la subunidad e de la ADN Pol III retira la Adenina introducida de forma incorrecta
mediante la funcin exonucleasa 3' - 5'.

LAS ADN POLIMERASAS EUCARITICAS

Las ADN polimerasas eucariticas tienen una diferencia interesante con las ADN polimerasas de E. coli, ya que se utilizan
dos polimerasas diferentes una para sintetizar la hlice conductora y otra para producir la hlice retardada. La ADN
polimerasa sintetiza la hlice retardada mientras que la ADN polimerasa sintetiza la hlice conductora. En la siguiente
tabla se resumen las polimerasas de mamferos:

ENZIMA FUNCIN

ADN Pol Sntesis Hlice retardada. Sntesis del cebador: 10 bases de ADN y 25 de ARN.

ADN Pol Sntesis de la Hlice conductora.

ADN Pol Polimerizacin de las Piezas de Okazaki.

ADN Pol Unin de los fragmentos de Okazaki ( de aproximadamente 250 pb).

ADN Pol Sntesis ADN mitocondrial.

REPLICACIN DEL ADN MITOCONDRIAL: LAZOS D

La replicacin del ADN mitocondrial en mamferos se ajusta al modelo del Lazo de Desplazamiento o lazo D. Las dos
hlices del ADN mitocondrial se pueden diferenciar en base a su densidad, existiendo una hlice Ligera (L) y otra hlice
pesad (H). En primer lugar, se inicia la replicacin o sntesis de la nueva Hlice Ligera (L), sin que se comience la
replicacin de la nueva hlice pesada. El origen de replicacin de la hlice ligera (L) es diferente al de la hlice pesada
(H), de forma que existen dos orgenes de replicacin diferentes para cada una. Adems, una vez iniciada la replicacin
de la nueva hlice ligera (L), la sntesis es unidireccional, tienen lugar en una sola direccin y avanza desplazando a la
otra hebra. Cuando se ha sintetizado, aproximadamente, 2/3 de la nueva hlice ligera, comienza la sntesis de la nueva
hlice pesada (H), en una sola direccin opuesta a la de sntesis de la hlice ligera L. Por consiguiente, la sntesis de la
nueva hlice L termina antes que la de la nueva hlice H. Como se puede ver, la replicacin del ADN mitocondrial es
diferente a la del cromosoma de E. coli, existen dos orgenes de replicacin diferentes para cada hlice y la replicacin es
unidireccional.

Replicacin ADN mitocondrial ADN mitocondrial

OTRAS ENZIMAS QUE INTERVIENEN EN LA REPLICACIN: LIGASAS, GIRASAS, TOPOISOMERASAS, ETC.

Adems de las ADN polimerasas I y III, de la ARN-Polimerasa o Primasa que sintetiza el cebador y de las Ligasas que
unen las piezas de Okazaki, en la replicacin del ADN intervienen otras enzimas. Algunas de estas enzimas son las
siguientes:

Helicasas: son enzimas que rompen los puentes de hidrgeno que mantienen unidas las dos cadenas de la doble
hlice. Entre las helicasas de E. coli se encuentran las protenas Dna B y Rep. La protena Rep parece ayudar a
desenrollar la doble hlice por delante de la polimerasa.

La protena SSB: se une al ADN de hlice sencilla y lo estabiliza retrasando la regeneracin de la doble hlice.

La accin de las Helicasas durante la replicacin genera retorcimientos que deben ser eliminados. El ADN circular puede
sufrir enrollamientos y retorcimientos, dichos superenrollamientos se generan y eliminan por enzimas denominadas
Topoisomerasas.

Topoisomerasas: pueden producir o eliminar nudos o enlaces en una hlice. existen toposiomerasas de la clase I
que cortan solamente una de las dos hlices y topoisomerasas de la clase II que cortan ambas cadenas. En E. coli,
las enzimas Topi I i Topo III pertenecen a la clase I, mientras que la la Girasa es de la clase II. Cuando se separan
las dos hlices durante el avance de la horquilla de replicacin se producen superenrollamientos positivos en otras
regiones que relajan la tensin. La Girasase necesita para eliminar los superenrollamientos positivos que se generan
por delante de la horquilla de replicacin.
 Retorcimientos y enrollamientos del ADN circular

Superenrrolamiento en ADN doble hlice circular.

Autor: Csar Benito Jimnez, Profesor Titular de Gentica, Departamento de Gentica, U.C.M.