CAPTULO
Electroforesis
David Alejandro Lpez de la Mora Ana Soledad Sandoval Rodrguez
Introduccin
En biologa molecular, una gran cantidad de tcni
cas que se realizan comnmente requiere el uso de la
electroforesis, lo que supone una parte importante del
procedimiento sistemtico del anlisis (separacin, puri
ficacin, preparacin) de los cidos nucleicos y las pro
tenas. La mayora de las biomolculas poseen una carga
elctrica cuya magnitud depende del pH del medio en
el que se encuentran; como consecuencia, pueden des
plazarse cuando se someten a un campo elctrico hacia
el polo de carga opuesta al de la molcula. A diferencia
de las protenas, que pueden tener una carga positiva o
negativa, los cidos nucleicos slo poseen carga negati
va, debido a su esqueleto de fosfatos. Por lo tanto, en
una electroforesis, los cidos nucleicos migrarn hacia
el polo positivo, es decir, el nodo. En el caso de las
protenas, que suelen ser de carga neutra, se realiza pre
tratamiento con detergentes, como el dodecilsulfato de
sodio (SDS), que les confiere carga negativa; con ello se
homogeneizan las protenas de la muestra y todas migra
rn hacia el polo positivo; slo se separarn por tamao.
El principio de la electroforesis consiste en la mi
gracin proporcional de las molculas a travs de un gel
u otro tipo de matriz porosa, segn su peso molecular o
tamao; movimiento generado por el campo elctrico.
Elementos necesarios para una
electroforesis
Para realizar una electroforesis se requiere de una serie de
elementos descritos a continuacin y enlistados en la fi-
gura 13-1.
Cmara de electroforesis
La cmara de electroforesis es un dispositivo que permite la
generacin de un campo elctrico alrededor de un gel en el
que se depositan las muestras. Este campo se genera dentro
de una solucin amortiguadora en la que se encuentra su-
mergido el gel que contiene las muestras; el alto contenido
de electrolitos permite la transmisin de la corriente elc-
trica, manteniendo el pH estable al paso de la corriente. La
cmara cuenta con dos polos que se conectan a una fuente
de energa. En las cmaras de electroforesis vertical el polo
positivo se encuentra en la parte inferior de la cmara (fi-
gura 13-2A) y en las horizontales, en uno de los extremos
(figura 13-2B). En ambos tipos de cmaras el polo positivo
se identifica con color rojo y el negativo con negro.
13
Gel
La muestra debe colocarse sobre un medio de soporte, con
la finalidad de evitar perturbaciones mecnicas durante la
separacin. El soporte idneo es un gel semislido o gela-
tinoso, compuesto por polmeros que forman una especie
de malla o microporos tridimensionales a travs de los cua-
les las molculas avanzan, segn el peso molecular, lo que
permite la separacin por tamao de los diferentes com-
ponentes de la muestra. Los geles pueden ser de agarosa
o poliacrilamida. Para la separacin de cidos nucleicos se
usan geles de agarosa o acrilamida y para protenas, slo
de acrilamida.
Geles de agarosa
La agarosa es un polisacrido extrado de algas marinas que
tiene la propiedad de mantenerse en estado slido a tem-
peratura ambiente, que se disuelve con facilidad en tempe-
ratura de 50 a 60C, se torna lquida y se solidifica cuando
se enfra formando un gel altamente poroso. El gel de aga-
rosa es la manera ms efectiva de separar fragmentos de
cido desoxirribonucleico (DNA, deoxyribonucleic acid)
que van de 100 pb a 25 kb. Para elaborar el gel se pesa la
cantidad de agarosa requerida, se disuelve en una solucin
amortiguadora adecuada de la misma composicin y con-
centracin que el buffer de corrimiento y se calienta hasta
formar una solucin. Sin dejar enfriar, se vaca de forma
inmediata sobre un molde de forma rectangular y en uno
de los extremos se coloca un aditamento en forma de peine
con la finalidad de generar los pocillos u orificios en los que
se colocarn las muestras (figura 13-3). La agarosa posee
ventajas sobre la acrilamida, ya que no es un compuesto
txico y permite realizar el anlisis de cidos nucleicos con
pesos moleculares variados, segn la concentracin de
agarosa que se emplee. Sin embargo, su poder de resolu-
cin es menor que el de los geles de poliacrilamida. La con-
centracin de agarosa se escoge segn el tamao del cido
nucleico que se vaya a analizar (cuadro 13-1). El tamao de
los poros de la matriz del gel depende de la concentracin
de agarosa utilizada y la concentracin de agarosa es inver-
samente proporcional al tamao del poro obtenido; esto
es, a mayor concentracin, menor tamao de los poros, y
viceversa, si los poros son pequeos la migracin del cido
nucleico es ms lenta. La figura 13-4 representa la migra-
cin de las molculas de DNA en un gel de agarosa. Du-
rante la electroforesis, los cidos nucleicos lineales con un
peso molecular alto migran al nodo con ms lentitud que
los de menor peso molecular. Esto se debe a que los cidos
118 Metodologa del DNA recombinante

Cmara de A)
electroforesis Peine para pocillos

MIGRACIN DE LA MUESTRA
Gel

Transiluminador Fuente de poder B)

100

MIGRACIN DE LA MUESTRA

Figura 13-2. Cmaras de electroforesis. A) En las cmaras de

Buffer de corrimiento

Marcador de peso

BUFFER
Buffer de carga

electroforesis vertical el corrimiento de la muestra sigue la

gravedad, ya que el polo positivo se encuentra en la parte
Buffer
molecular

1KB

inferior de la cmara. B) En la electroforesis horizontal debe

cuidarse que el nodo se coloque hacia el extremo del gel
donde corren las muestras, de lo contrario las muestras se
saldrn del gel.
Figura 13-1. Elementos necesarios para una electroforesis.
En la imagen se aprecian los elementos que se requieren para
el corrimiento electrofortico y visualizacin del gel. geles con un amplio intervalo de tamaos de poro. El gel de
poliacrilamida es el resultado de la polimerizacin qumi-
ca de una mezcla de acrilamida y bisacrilamida. El tamao
nucleicos de peso elevado tardan ms tiempo en atrave- del poro de un gel de acrilamida est determinado por la
sar los poros de agarosa. En el caso de cidos nucleicos no concentracin total de acrilamida presente (acrilamida +
linearizados, como plsmidos circulares (conformacin bisacrilamida), que generalmente se maneja en proporcin
nativa), cido ribonucleico (RNA, ribonucleic acid) con
estructuras secundarias o DNA de gran longitud, la mi-
gracin no slo depende del peso molecular, sino tambin
del grado de empaquetamiento que presenten. En la elec-
troforesis de un plsmido, por ejemplo, se visualizan tres
conformaciones distintas de la misma molcula: la forma
superenrrollada, la semirrelajada y una relajada. Esto se re-
fleja en tres bandas de tamao diferente, aunque se trate
del mismo plsmido (figura 13-5). Por ello, antes de una
electroforesis es importante la linearizacin y la elimina-
cin de estructuras secundarias por desnaturalizacin de Figura 13-3. Preparacin de un gel de agarosa. La agarosa es
la muestra. La concentracin de agarosa ms utilizada para un polvo que para disolverse requiere calentarse hasta la
electroforesis de cidos nucleicos es de 0.5 a dos por ciento. ebullicin del solvente. Una vez obtenida la solucin de
agarosa, antes de que se enfre a menos de 50C se coloca
Geles de acrilamida en una cmara para formar el gel. El gel se coloca de manera
que los pocillos queden en el extremo donde se localiza el
La acrilamida es un polmero sinttico, termoestable, inco- polo negativo de la cmara de electroforesis, para permitir que
loro y qumicamente inerte, con el que se pueden generar la muestra corra a lo largo del gel.

Muestra
Migracin
Patrn o
Ladder
Banda de DNA
Gel
Figura 13-4. Electroforesis de cidos nucleicos. Se representa
un gel de agarosa en el cual se visualiza un marcador de peso
molecular junto a las muestras para ayudar en la determi-
nacin del peso molecular de los fragmentos. La muestra se
carga en los pocillos y se deja correr hacia el polo negativo.
de 19:1. Regulando la concentracin de ambas y su propor-
cin se consiguen distintas porosidades, siempre menores
que la de los geles de agarosa. Cuando la acrilamida se en-
cuentra en disolucin acuosa experimenta autopolimeri-
zacin de forma espontnea y lenta, con el resultado de
que las molculas de acrilamida se unen cabeza con cola.
En presencia de un sistema generador de radicales libres
se da una polimerizacin vinlica en la cual se activan los
monmeros de acrilamida, quedan en estado de radical
libre y reaccionan rpidamente para formar polmeros de
A
B diogrfica y registro permanente. La electroforesis con geles
C superior o concentrador y un gel inferior de separacin o
Figura 13-5. Perfil electrofortico de un plsmido. Aunque
la molcula de DNA (en este caso un plsmido) tenga la
misma longitud en pb, puede demostrar diversos patrones
de corrimiento electrofortico segn la conformacin de la
estructura. A) Plsmido superenrrollado. B) Plsmido circular.
C) Plsmido linearizado.
Electroforesis 119
Cuadro 13-1. Concentraciones de agarosa para geles de cidos
nucleicos. El cuadro indica las concentraciones de agarosa
recomendadas segn el peso molecular que se espera encon-
trar en las muestras. Al aumentar la concentracin de agarosa
se reduce el poro del gel, lo que permite la discriminacin de
fragmentos de menor tamao.
Agarosa (%) Tamao de banda
0.3 > 700 pb
0.5 700 pb a 25 kb
0.8 500 pb a 15 kb
1.0 250 pb a 12 kb
1.2 150 pb a 6 kb
1.5 80 pb a 4 kb
2.0 100 pb a 3 kb
3.0 500 pb a 1 kb
4.0 100 pb a 500 pb
6.0 10 pb a 100 pb
cadena larga. El polmero en disolucin no forma un gel,
sino que se encuentra en estado viscoso debido a que las
cadenas pueden deslizarse unas sobre otras; la formacin
del gel requiere que varias cadenas queden trabadas (lo
que se consigue con la bisacrilamida). La acrilamida es una
neurotoxina, por lo que debe manejarse con precaucin.
Tambin es esencial almacenarla en un lugar refrigerado,
seco y oscuro para reducir la autopolimerizacin y la hi-
drlisis. La bisacrilamida, o N,N-metilenbisacrilamida,
est compuesta por dos molculas de poliacrilamida enla-
zadas por sus grupos amino, no reactivos. Este compuesto
se polimeriza junto con la acrilamida y establece puentes
entre las cadenas lineales de poliacrilamida, con lo que se
evita su deslizamiento y conduce a la formacin del gel. El
gel de acrilamida es capaz de soportar mayores voltajes que
la agarosa y es susceptible de teirse por varios procedi
mientos; tambin puede desteirse en caso necesario. Los
geles de acrilamida pueden digerirse para extraer fraccio-
nes separadas (bandas) o desecados para su exposicin ra-
de acrilamida siempre se realiza en cmaras verticales. La
electroforesis de protenas emplea geles de acrilamida de
dos capas a diferente concentracin de acrilamida, un gel
de resolucin. El gel de concentracin tiene un tamao de
poro grande y se prepara con un amortiguador de Tris/HCl
con pH de 6.8, dos unidades de pH menor que el buffer
de corrimiento hecho de Tris/SDS/glicina. Estas condi-
ciones proporcionan un ambiente para que las protenas
recubiertas con SDS se concentren. El tamao del gel de
120 Metodologa del DNA recombinante
apilamiento debe ser del doble de la altura del pozo donde
se va aplicar la muestra. Este gel se coloca sobre el gel
de resolucin, un gel de poliacrilamida de poro pequeo
hecho de un amortiguador de Tris/HCl, con un pH de 8.8.
En el gel de resolucin es donde las protenas se separan de
acuerdo con su tamao, de manera dependiente del por-
centaje de acrilamida utilizado para su preparacin, como
se describe en el cuadro 13-2. La adicin de SDS a los geles
de poliacrilamida es opcional; cuando se hace, mantiene a
las protenas en estado extendido, lo que facilita la movilidad
electrofortica de la protena mediante el gel y permite que la
movilidad dependa exclusivamente de su masa molecular.
En la figura 13-6 se representa la electroforesis de prote-
nas en gel de acrilamida.
Buffer de corrimiento
El buffer de corrimiento es de la misma composicin y pH
que el buffer con el que se prepara el gel de resolucin, ya
sea de agarosa o de acrilamida. ste proporciona el medio
para la transmisin de la corriente elctrica y mantiene el
pH sin variaciones mientras se realiza el corrimiento. En
el caso de los cidos nucleicos, pueden emplearse TBE o TAE
como buffer de corrimiento. El buffer TBE contiene Tris
base, cido brico y EDTA, y se maneja a un pH de 7.2. El
buffer TAE contiene Tris base, cido actico y EDTA, ajus-
tado a pH 8.5. El buffer de corrimiento de electroforesis de
protenas lleva Tris, 25 mM, SDS al 1% y glicina, 192 mM,
a un pH 8.3.
Marcador de peso molecular
Los marcadores de peso molecular son una mezcla de mo-
lculas de DNA o de protenas de tamao conocido que
permiten determinar por comparacin el tamao de las
molculas (cidos nucleicos o protenas) contenidos en
Cuadro 13-2. Concentraciones de acrilamida para geles
de cidos nucleicos. El cuadro indica las concentraciones de
acrilamida recomendadas segn el peso molecular que se
espera encontrar en las muestras. Al aumentar la concentra-
cin de acrilamida se reduce el poro del gel, lo que permite la
discriminacin de fragmentos de menor tamao.
Acrilamida (%) Pares de bases
3.5 1000 a 2000
5.0 80 a 500
8.0 60 a 400
12.0 40 a 200
15.0 25 a 150
20.0 6 a 100
Muestra
Gel de
Migracin
empacamiento
Patrn o
Ladder
Banda de
protenas
Gel de
resolucin
Figura 13-6. Electroforesis de protenas. Las protenas se
corren en geles de acrilamida formados por dos fases.
Una fase superior donde las molculas se concentran y una
inferior donde la muestra se separa en sus componentes
segn su peso molecular. Al estar pretratadas con SDS, las
protenas se rodean de cargas negativas, lo que les permite
migrar hacia el polo positivo con independencia de su carga
inicial.
las muestras sometidas a electroforesis. Los marcadores de
peso molecular estn disponibles comercialmente en una
amplia variedad. En el caso de marcadores de peso mo-
lecular de cidos nucleicos, stos pueden ser bacterifagos
o plsmidos sometidos a corte con enzimas de restriccin
que generan fragmentos de diversos tamaos; tambin
puede tratarse de molculas de DNA sintticas denomina-
das escaleras, porque contienen fragmentos con incremen-
tos de tamao gradual. En la figura 13-7 se pueden ver las
bandas que se obtienen de los fragmentos con un marca-
dor de uso comn, como es el fago Phi X174/Hae III y una
escalera denominada 1 Kbase plus ladder. Los marcadores
de peso molecular de protenas suelen ser una serie de pro-
tenas de peso molecular conocido (que van desde 10 hasta
300 kDa), las cuales pueden estar teidas o coloreadas. En
los casos en que la electroforesis sea un paso previo para
la tcnica de Western blot, tambin se dispone de marca-
dores de peso molecular de protenas recombinantes que
contienen un sitio de unin a inmunoglobulina (Ig) G. El
sitio de unin a IgG puede ser reconocido por un anticuer-
po primario o secundario empleado para la deteccin de la
protena buscada por Western blot. Este sistema es com-
patible con quimioluminiscencia, el marcaje cromognico
y la fluorescencia.
 Electroforesis 121

molcula cromognica que emite energa fluorescente y

12 000 permite visualizarla. El transiluminador es el sistema em-
pleado con ms frecuencia por ser simple y efectivo. En
1 353
1 078 general emiten energa a una longitud de onda a 302 nm,
872 5 000 aunque tambin existen para 254 y 365 nm; suelen contar
603
con un botn para baja/alta intensidades por si se requiere
una menor exposicin de la muestra a la luz ultravioleta.
Algunos tambin permiten la seleccin de entre dos longi-
tudes de onda, lo que los hace ms flexibles. Los epitrans
310 iluminadores (365, 480 nm) generan la emisin visible por
271 281 2 000
fluorescencia igual que el transiluminador pero, a diferen-
234
1 650 cia de ste, la fuente de energa se encuentra reflejada y no
194 pasa a travs de la muestra. El epiiluminador es efectivo en
geles muy densos.
Una vez que se tienen los materiales necesarios existen
1 000
188 dos maneras de realizar la electroforesis: de forma hori-
850 zontal y vertical.
650
72
Electroforesis horizontal
500
Se lleva a cabo con gel de agarosa para cidos nucleicos.
400
Para el corrimiento el buffer debe cubrir el gel, con la fina-
300 lidad de evitar que se seque por el calentamiento inducido
por el paso de la corriente elctrica. Al momento de cargar
200 las muestras en los pocillos, se puede optar por hacerlo en
100
seco; esto es, llenar parcialmente la cmara con lquido de
corrimiento de tal manera que la parte superior del gel no
se cubra de buffer para que los pocillos puedan llenarse sin
Figura 13-7. Marcadores de peso molecular para DNA. En la interferencia del lquido. Una vez cargada la muestra, se
la imagen el primer carril corresponde a las bandas que se corre por unos minutos a bajo voltaje hasta que la muestra
obtienen de los fragmentos con un marcador como es el fago entre en el gel y entonces se cubre del todo con el buffer de
Phi X174 digerido por la enzima Hae III, mientras el segundo corrimiento. Tambin existe la tcnica denominada elec-
carril muestra los fragmentos de una escalera formada por
troforesis submarina, en la que la totalidad del gel se cubre
segmentos sintticos de DNA.
con buffer de corrimiento, desde el momento de cargar las
muestras en los pocillos, como se ejemplifica en la figura
13-8. En esta tcnica el buffer siempre debe cubrir el gel, y
Buffer de carga se llama submarina porque la muestra se coloca con el gel
Este amortiguador tiene como fin brindar peso, densidad sumergido en el buffer.
y color a la muestra, lo que facilita su depsito en el poci-
llo y evita su salida del gel; permite, adems, monitorear el
corrimiento de la muestra en el gel. Se emplea en relacin Electroforesis vertical
1:3 para cidos nucleicos o 1:6 para protenas, respecto a la
Empleada de forma exclusiva con gel de poliacrilamida, se
cantidad de muestra. El buffer de carga de cidos nucleicos
utiliza para protenas o cidos nucleicos de pequeo tama-
contiene Tris, azul de bromofenol, azul de xileno y glice-
o. El gel debe estar contenido entre dos placas rectangula-
rol. Mientras que el buffer de carga para protenas contiene
res de vidrio donde la corriente elctrica se genera gracias
Tris-HCl, pH 6.8, ditiotritiol (DTT), SDS, glicerol y azul
al buffer en el que se encuentra embebido el gel y llena las
de bromofenol. En el caso de que se deseen condiciones
cubetas o compartimientos del nodo y el ctodo como se
reductoras y desnaturalizantes, deber aadirse betamer-
aprecia en la figura 13-9.
captoetanol a este buffer y habr que calentar las muestras
a 95C por cinco minutos.
Procedimiento general de una
Transiluminador ultravioleta electroforesis
El transiluminador es un aparato que transmite luz del es- A continuacin se exponen los pasos de los que consta una
pectro ultravioleta a travs de la muestra, lo cual excita la electroforesis tpica.
122 Metodologa del DNA recombinante
+ de la longitud del DNA (pb) y se representar en bandas
Migracin de la muestra
Figura 13-8. Ejemplificacin de electroforesis submarina. La
muestra se coloca despus de haber vertido el buffer de
corrimiento y retirado el peine que sirve de molde para la
formacin de los pocillos.
1. Preparar un gel de agarosa o acrilamida a la concentra-
cin requerida.
2. Mezclar las muestras a analizar con un buffer de carga
adecuado.
3. Cargar las muestras en el gel.
4. Realizar la corrida electrofortica al voltaje pertinente.
5. Visualizar los cidos nucleicos o las protenas.
Electroforesis de cidos nucleicos
El mtodo ms comn para la electroforesis de DNA es
elaborar un gel horizontal de agarosa, con una concentra-
cin de 0.5 a 2%. La carga elctrica de la molcula de DNA
la otorgan sus grupos fosfato, de carga negativa, y cuyo n-
Figura 13-9. Electroforesis vertical. En esta cmara se aprecia cmo el gel de acrilamida ha quedado embebido en el buffer de
corrimiento en su extremo superior gracias a la colocacin de amortiguador en la parte interna de la cmara. El buffer de la parte
externa permite que el polo positivo cuente con la misma solucin buffer que transmita la corriente a la parte inferior del gel.
mero es igual al doble del nmero de pares de bases. Dado
que la forma de la molcula de DNA siempre es la misma,
la movilidad de la electroforesis depender nicamente
(figura 13-10). El corrimiento se realiza a voltajes de entre
25 y 100 V; a mayor voltaje mayor velocidad de corrimien-
to. El avance electrofortico se monitorea a travs de la vi-
sualizacin de los colorantes (azul de bromofenol y azul de
xileno) contenidos en el buffer de carga con el que se mez-
cl la muestra previa a su colocacin en el pocillo. Si los
fragmentos de DNA son pequeos (menos de 50 pb) o bien
se requiere discernir entre fragmentos de cidos nucleicos
con una diferencia de longitud de 1 a 20 pb, se recomienda
utilizar un gel de poliacrilamida que permita esta resolu-
cin. Las agarosas con un punto de fusin bajo permiten la
preparacin de geles a elevadas concentraciones y se acon-
seja para obtener una buena separacin de molculas de
DNA con < 1000 pb. Son ideales para preparar geles anal-
ticos de productos procedentes de tcnicas de reaccin en
cadena de la polimerasa (PCR, polymerase chain reaction)
u otras. Algunas son capaces de separar fragmentos que
difieren entre 10 y 20 pb. Para la preparacin del gel debe
estandarizarse primero qu concentracin de agarosa es la
ms adecuada, segn la muestra que se desee separar.
El volumen de agarosa depende del tamao de la c-
mara de electroforesis; 20 a 25 ml son suficientes para
las dimensiones ms comunes del gel: 8 6 0.5 cm
(L A A). Inmediatamente despus de vaciar la agarosa
a la cmara, debe insertarse el o los peines necesarios. La
agarosa tarda en solidificar alrededor de 20 min, mientras
que la poliacrilamida, unos 30 min. Una vez solidificado el
gel, se aade el buffer de corrimiento (TAE o TBE) a con-
centracin 1X, cubriendo perfectamente el gel (0.5 a 1 cm
por encima del gel) y se retiran los peines. Las muestras se
Buffer interno
Buffer externo

Mayor intensidad
Mayor tamao
Menor intensidad
Menor tamao
Figura 13-10. Movilidad de fragmentos de DNA. La imagen
muestra fragmentos de DNA de mayor a menor tamao
(parte superior hacia parte inferior) visualizados con un agente
intercalante. Se aprecia cmo la intensidad de la banda obser-
vada es variable, lo que indica groso modo cul fragmento se
encuentra en mayor cantidad y cul en menor.
mezclan con el buffer de carga y se depositan de forma cui-
dadosa en los pocillos, con lo que se evita que se salgan y
puedan contaminar el pocillo contiguo. Debe considerarse
el uso de un marcador de peso molecular en, por lo menos,
uno de los carriles, para la determinacin del peso molecu-
lar de la muestra. Este marcador tambin debe mezclarse
con un buffer de carga, excepto cuando ya viene preparado
para su uso de la casa comercial en que se obtuvo.
Una vez depositadas las muestras en los pocillos, se
procede a la transmisin de la corriente elctrica. Se co-
nectan los cables de la fuente de energa de cada polo elc-
trico a la cmara de electroforesis en el electrodo que le
corresponda y se aplica un voltaje de acuerdo con el peso
molecular de las molculas de DNA que se va a separar.
Para el caso de productos de PCR (entre 100 pb y 1.5 kb)
se recomienda usar voltajes comprendidos entre 75 y 100
V. Para muestras de DNA genmico y plasmdico (> 2 kb)
se recomienda aplicar valores de entre 25 y 75 V. En la figu-
ra 13-11 se aprecia una fuente de energa, con su pantalla,
que indica el amperaje. Es importante que se estandarice el
tiempo de electroforesis a fin de conseguir la mejor reso-
lucin posible.
Durante el corrimiento se monitorea la migracin de
la muestra con colores que contiene el buffer de carga, en
que se observa el color azul y el verde correspondientes
a los colorantes azul de bromofenol y azul de xileno, de
forma respectiva. En geles de agarosa, dentro del rango
Electroforesis 123
V
mA
V/A
STOP RUN/PAUSE VOLTS/AMPER
Figura 13-11. Fuente de poder. La imagen muestra una tpica
fuente de poder donde se indica el miliamperaje a que est
siendo corrida la muestra. La seleccin de las condiciones de
corrimiento puede ser con un amperaje constante o bien a
voltaje constante, como en este caso.
de 0.5 y 1.5%, el azul de xileno migra de manera similar
a un fragmento de DNA de 4 kb, mientras que el azul de
bromofenol se comporta como un fragmento de 300 pb.
La electroforesis se detiene cuando se considera que la
muestra se localiza en la posicin deseada, o bien cuando
la muestra ha corrido por lo menos tres cuartas partes
del gel.
Hay mltiples factores que pueden afectar la migra-
cin del DNA, como la concentracin del gel utilizado, el
tamao de la molcula de DNA muestra, el empaqueta-
miento del DNA, el voltaje, la temperatura del buffer de
corrimiento (que puede aumentar demasiado si el voltaje
es muy alto), la contaminacin con agentes intercalantes
en la muestra, la composicin del buffer de corrimiento,
etctera.
Visualizacin de las muestras
Para la visualizacin de los cidos nucleicos se utiliza un
colorante fluorescente, el bromuro de etidio, que tiene la
propiedad de intercalarse entre las bases nitrogenadas del
DNA y el RNA. Debido a esta propiedad es un agente mu-
tagnico y debe manipularse con cuidado. El bromuro de
etidio, por lo general, se incorpora a la agarosa (0.5 mg/
ml) antes de permitir la solidificacin, o puede incorporar-
se luego del corrimiento, incubando el gel en una solucin
que lo contenga a 0.5 mg/ml. El bromuro de etidio emite
fluorescencia de color naranja cuando se expone a la luz ul-
travioleta con longitud de absorcin de 254 nm, y longitud
de emisin de 366 nm. La seal fluorescente es proporcio-
nal a la cantidad de producto, como puede observarse en
la figura 13-12. Su sensibilidad permite detectar cerca de
30 pg de cido nucleico por banda (segn el grosor del gel).
El bromuro de etidio es teratognico, mutagnico y cance-
rgeno, por lo que para este procedimiento se recomienda
124 Metodologa del DNA recombinante
el uso de guantes. En la actualidad, el bromuro de etidio
se ha sustituido por un compuesto comercial, SYBR Safe,
que se une de manera no covalente a los cidos nucleicos.
Este colorante tiene una fluorescencia a 280, una excita-
cin mxima a 502 nm y una emisin mxima a 530 nm.
Con este colorante, el DNA puede visualizarse con una luz
ultravioleta en el rango de 470 a 530 nm. Por otro lado,
el colorante de cianina asimtrico el SYBR-Green es un
fluorforo que se une con gran afinidad al surco menor del
DNA bicatenario, y es unas 25 veces ms fluorescente que
el bromuro de etidio. Este colorante con epiiluminacin de
254 nm puede detectar 60 pg de dsDNA/banda; 1 a 2 ng
de oligonucletidos, y 100 a 300 pg de RNA o ssDNA/banda.
Para los geles de acrilamida una alternativa al bromuro de
etidio es el nitrato de plata; sin embargo, ste utiliza reac-
tivos peligrosos, como el formaldehdo. Por otro lado, la
tincin con plata es ms sensible que el bromuro de etidio,
ms barata a largo plazo y menos txica. En la figura 13-12
se aprecia una muestra visualizada por bromuro de etidio
y otra por SYBR Safe.
Electroforesis de protenas
El mtodo ms empleado para electroforesis de protenas
se lleva a cabo en un sistema discontinuo; es decir, un
gel conformado por dos geles de poliacrilamida (uno de
resolucin y otro de compactamiento), que difieren en su
concentracin, composicin y pH. Los geles estn unidos
pero limitados por una fase de separacin visible a contra
luz; para lograrlo, deben prepararse por separado, espe-
A)
Figura 13-12. Visualizacin de fragmentos de DNA. Estas imgenes son de un gel de agarosa donde la muestra fue visualizada por
A) bromuro de etidio y B) colorante de cianina asimtrico (SyberR-Green).
rando la polimerizacin total del primero, para continuar
con la del segundo; de lo contrario, en estado lquido, se
mezclaran.
Para el caso de los geles de acrilamida para cidos
nucleicos slo se tiene una fase, conformada por el gel de
resolucin, en el que las molculas de DNA migrarn, ge-
nerando un patrn electrofortico, segn su tamao.
Para electroforesis de protenas, la acrilamida se pre-
para a partir de una solucin al 30% de acrilamida-bisacri-
lamida 19:1. sta se mezcla con el buffer correspondiente y
una solucin de SDS; adems, se aade persulfato de amo-
nio (APS) y N,N,N,N-tetrametiletilenodiamina (TEMED)
como polimerizadores en concentraciones del orden de 1 a
10 mM. El APS genera radicales libres, por lo que es un ini-
ciador de la reaccin de polimerizacin que al final forma
el gel. El TEMED funciona como otro iniciador de polime-
rizacin. Las propiedades del gel resultante dependen de la
concentracin de APS y TEMED, ya que un aumento en
su concentracin disminuye la longitud media de la cadena
de polmero y, por lo tanto, disminuye su elasticidad y le
resta transparencia al gel. Por ello, debe utilizarse la menor
concentracin posible de catalizadores que permita la po-
limerizacin en un tiempo ptimo.
El gel de acrilamida se forma entre dos vidrios, y el
sistema completo se sumerge en el buffer de corrimiento
dentro de la cmara vertical de electroforesis. En el mo-
mento de sumergir los geles en el tanque, se debe asegurar
que los pocillos del gel estn totalmente cubiertos por el
buffer. Es comn en los geles de acrilamida realizar un pre-
corrimiento de unos 10 a 30 min a voltajes bajos, con el
B)

cual se asegura que los pocillos se limpien antes de cargar
las muestras.
Para la preparacin de la muestra de protena se reali-
za una reaccin fisicoqumica, en la que se rompen enlaces
peptdicos y puentes disulfuro por accin de detergentes
inicos (SDS), reactivos reductores (betamercaptoetanol)
y temperaturas elevadas (95C), que al final consigue des-
naturalizar la protena hasta su estructura primaria. La
muestra mezclada con el buffer de carga se deposita con
cuidado en los pocillos, evitando la contaminacin del po-
cillo contiguo. Hay que considerar el uso de un marcador
estndar de protenas para la medicin del peso molecular
de la muestra, que debe someterse a los mismos tratamien-
tos que la protena.
Una vez colocadas las muestras de protenas en cada
pocillo del gel, se conectan los cables correspondientes
de los electrodos a la fuente de energa, con la seleccin de
voltaje o amperaje adecuados. Para el clculo del voltaje
es importante conocer la distancia en centmetros del gel
desde la parte superior hasta la parte inferior. La distancia
multiplicada por 8-15 V permitir determinar el voltaje del
corrimiento. El voltaje ptimo depender de la molcula
que se piensa separar; en consecuencia, se recomienda es-
tandarizar este procedimiento. El valor del amperaje o co-
rriente elctrica (medida en amperios o miliamperios) de-
pender de la fuerza inica del buffer. En el caso de trabajar
con buffer Tris-SDS-glicina, el valor recomendado es de 25
a 30 mA. La electroforesis se realiza hasta que el colorante,
visualizado como una lnea azul, haya llegado a los lmites
de la parte inferior del gel.
Visualizacin de las muestras
Si se requiere, el gel se sumerge en un recipiente que con-
tiene el colorante azul brillante de Coomassie y se incuba
por unos minutos; esto permitir la visualizacin de las
bandas de protenas. El proceso de coloracin se basa en la
atraccin electrosttica del enlace peptdico de las prote-
nas sobre grupos de cido sulfnico, que tien la protena
de color azul. Asimismo, las fuerzas de van der Waals y
las interacciones hidrofbicas participan en este proceso
de unin mecnica. La tincin de Coomassie Blue clsi-
ca, por lo general puede detectar bandas de protena de
50 ng mientras que la tincin con plata incrementa este
lmite de sensibilidad unas 50 veces. La tincin con plata
consiste en desarrollar el color en el gel por incubacin en
soluciones de metano al 140%: cido actico al 10%, luego
metanol al 40%, seguido de agua y posteriormente tiosul-
fato de sodio al 0.01%. Despus de este proceso, se lava y
se procede a la incubacin en fro (4C) en cloruro de plata
al 0.1%; posteriormente, se lava e incuba con carbonato de
sodio al 2% en formalina al 0.04% (llamada tambin formol
al 35%), que acta como revelador. Por ltimo, se incuba
con soluciones de cido actico antes de fotografiar o es-
canear.
Electroforesis 125
Muchas variables pueden influir en la intensidad del
color y todas las protenas tienen caractersticas distintas
de tincin.
Algunas veces, el gel se seca para conservarlo. Para
ello, primero se deshidrata en glicerol-metanol y, poste-
riormente, se coloca en una lmina de celofn hidrof li-
co y no plastificado que cubra totalmente el gel. Se cubre
el gel con un segundo celofn previamente remojado en
agua y se sella con calor. Aqu se deja secar en condiciones
ambientales por aproximadamente dos das o se acelera el
proceso con el uso de desecadores de geles.
Algunas protenas pueden migrar de forma irregular
y aparecer con un peso molecular mayor que el esperado;
esto puede deberse a que presentan modificaciones pos-
traduccionales en su estructura, como residuos de gluco-
silacin, fosforilacin y acetilacin, que podran retardar
la migracin de las muestras. Asimismo, si existe desna-
turalizacin de las protenas, se considera que la protena
est degradada y suelen aparecer manchas difusas en todo
el carril.
Aplicaciones de la electroforesis
Algunos de los usos de la electroforesis para cidos nuclei-
cos en geles de agarosa son determinar los tamaos mo-
leculares de los cidos nucleicos, analizar los fragmentos
cortados con enzimas de restriccin (mapa de restriccin),
comparar los tamaos de distintos tipos de DNA, aislar y
recuperar fragmentos de DNA purificados para clonacio-
nes moleculares, y analizar productos de PCR, entre otros.
Asimismo, la electroforesis puede ser un proceso previo a
las tcnicas de hibridacin, como el Southern blot (DNA)
o el Northern blot (RNA), en que la presencia de deter-
minada secuencia del cido nucleico en una mezcla de
molculas se distingue por su tamao, la cual se confirma
por hibridacin con una sonda especfica. En el caso de
las protenas, la electroforesis se aplica para la identifica-
cin de fracciones proteicas o protenas particulares por
tamao, como es el caso de la electroforesis de globulinas,
o protenas sricas; pero, sobre todo, para la identifica-
cin de molculas particulares empleando despus una
reaccin antgeno-anticuerpo especfica en la tcnica de
Western blot. Asimismo, la electroforesis es crucial en tc-
nicas como la secuenciacin, en que, tras un corrimiento
electrofortico de las cuatro reacciones de elongacin con
los dideoxinucletidos (vase el captulo 18), se puede de-
ducir la secuencia del segmento de cido nucleico. Incluso,
los secuenciadores automticos modernos emplean una
electroforesis capilar para el discernimiento de la secuen-
cia. Tambin, los termocicladores en tiempo real basan la
deteccin de los fragmentos amplificados en una electrofo
resis capilar, en que es posible la deteccin inmediata de los
segmentos amplificados y su lectura por el lser correspon-
diente al flurocromo con que el producto est marcado.
126 Metodologa del DNA recombinante
Ejercicios de integracin
Con base en la imagen de una electroforesis de agarosa para
fragmentos de DNA representada en la imagen, conteste las
siguientes preguntas:
1. De qu peso molecular es la banda de menor tamao
del carril C?
2. De qu peso molecular es la banda de mayor tamao
del carril D?
3. En qu carril y qu peso molecular presenta la banda
que tiene mayor concentracin?
4. En qu carril y qu peso tiene la banda de menor con
centracin?
5. Suponiendo que son muestras de DNA digeridas por
enzimas de restriccin, qu carriles contienen aparen
temente la misma muestra. Explique su respuesta?
6. En qu carril se localiza el marcador de peso mo
lecular?
7. Indique el sentido de corrimiento de las muestras con
una flecha.
8. Seale la polaridad correspondiente a cada extremo
del gel.