LABORATORIO DE BIOQUIMICA GENERAL ALUMNOS CRUZ JIMENEZ LUIS ANGEL CALZADA CONTRERAS JAZMIN SECCION: 3 PARCTICA 1 : DETERMINACION DE AMINOACIDOS TERMINALES CON GRUPO ALFA AMINO LIBRE METODO DE SANGER
INTRODUCCION : Preparacion del derivado dinitrofenilado de la
hemoglobina . Las protenas son molculas formadas por aminocidos que estn unidos por un tipo de En un tubo adicionamos nuestra muestra de hemoglobina agregando bicarbonato de sodio para enlaces conocidos como enlaces peptdicos. Las solubilizar la hemoglobina , seguido de eso le agregamos protenas suponen aproximadamente la mitad del peso el reactivo 1-fluor -2,4-dinitrobenceno ( DNFB ) y de los tejidos del organismo, y estn presentes en todas agitamos vigorosamente por una hora para que las clulas del cuerpo, adems de participar en reaccionara con los aminos libres dando formacin prcticamente todos los procesos biolgicos que se dinitrofenilos derivados , dando una pigmentacin producen. Los aminocidos son compuestos cristalinos amarilla .Adicionaremos HCl para hidrolizar que contienen un grupo cido dbil, carboxilo (-COOH) provocando el rompimiento de enlaces peptdicos liberando agua , seguido adicionaremos ter saturado y un grupo bsico dbil, amina (-NH2), unido al carbono con solucin acuosa de sulfato frrico para estabilizar y todo aminocido tiene un grupo amino terminal y un la reaccin y eliminar los residuos de aminocidos con grupo carboxilo terminal . cadena sin presencia de N- terminal . Despues colocamos nuestro tubo a bao maria para eliminar los La determinacin de la estructura total de la molecula de vapores de ter que ayan quedado , aadimos HCL para insulina fue realizada en 1984-1953 por el Dr . Frederick hidrolizar y dejarlo en la autoclave 3 horas a 15 libra sanger (premio nobel de qumica, 1964) en una serie de por pulgada cuadrada de presin . En la siguiente sesin brillantes investigaciones en el curso de las cuales se volvimos a agragra el ter para eliminar los residuos que introdujeron un buen numero de tcnicas para la se encuentran en la fase acuosa y extraer nuestra determinacin de secuencias de aminocidos en cadenas muestra que solo contiene los aminocidos libres y ppticas . circunstancia favorable en esta rea analtica dinitrofenilados derivados . Calentamos nuestra muestra fue la probabilidad de escindir la molecula de sus enlaces en una parrilla casi a sequedad para eliminar los residuos disulfuro mediante oxidacin por acido performico . de ter sobrante y enfriamos . Agregamos etanol para disolver nuestra muestra y precedemos a realizar la OBJETIVOS : cromatografa en papel de los aminocidos dinitrofenilados de la hemoglobina . Indentificar el aminocido alfa-amino terminal de las cadenas de la molecula de hemoglobina Cromatografia en papel de los aminocidos mediante el mtodo de sanger . dinitrofenilados tipo y la muestra problema .
En nuestro papel whatman colocamos diferentes
muestras de los derivados dinitrofenilados de los RESULTADOS : aminocidos : Valian , Alanina , Fenilalanina , DNFB , y nuestra muestra problema , utilizando acido ctrico citrato como solvente dejndolo saturar por 4 horas y dejar secar , por ultimo precedemos a calcular los rf de dinitrofenilada , las muestras para saber que contiene nuestro problema . entonces al final solo quedaban aminocidos , En la siguiente pagina se incorpora la tabla anexa de y no todos los resultados del cromatograma . dinitrofenilados ya que paso por un preceso de Que se hizo Para que lo hize hidrolizis de tipo acida y Agregamos bicarbonato Para solubilizarla y para a una alta presin y de sodio a la hemoblobina darle un pH alcalino a la temperatura para romper reaccin ya que el mtodo los enlaces peptdicos , es de sanger ocurre en decir fracionamos en medio alcalino pedazos nuestra protena . Agregamos el reactivo para que reaccionara con Agregamos de nuevo ter Para eliminar los residuos DNFB y agitamos los aminos libres , y saturado y comenzamos que se encontraban en la vigorosamente formar dinitrofenilos con otra extraccin fase acuosa y extraer derivados , dando una nuestra muestra que solo pigmentacin amarilla , contiene los aminocidos para facilitar la libres y dinitrofenilos identificacin de derivados . aminocidos y separa los Calentamos en la parrila Para eliminar los residuos mismo , dejando de ter de la sustancia etiquetado el amino Enfriamos y disolvimos Para disolver nuestra terminal con el color en acetona muestra y realizar el amarillo cromatograma . Adicionamos HCl 3N Para que detener la reaccin y deje de DISCUSIN : nitrofenilar con el cambio brusco de pH , El mtodo de sanger de secuencia de aminocidos cambindolo a un medio emplea el reactivo DNFB para identificar al aminocido acido para que la reaccin N terminal de protenas , el grupo alfa amino del de sanger ya no se pueda aminocido esta libre y dezplaza al fluor del reactivo realizar y se detenga la produciendo HF y un pptido en el que el aminocido N reaccin . terminal queda enlazado al resto 2,4-dinitrobenzeno . Agregamos ter saturado Para estabilizar la El petido restante se aisla e Hidroliza utilizando HCl , en con solucin acuosa de reaccin y disminuir la presencia de temperatura y presin por lo cual el 2,4- sulfato frrico . reactividad de la reaccin dinitrofenilado del aminocido se identifica presentando ya que esta con eter puro coloracin amarilla , lo cual indica la presencia del puede ser muy brusca y aminocido alfa terminal de la hemoglobina a un pH asi eliminar los residuos bsico . de aminocidos con cadena sin presencia de N CONCLUSIONES : Terminal . Colocamos el tubo a bao Para eliminar los vapores Al obtener la relacin de diferentes sustancias logramos maria de ter que aya quedado . identificar que aminocidos contena nuestra solucin Aadimos HCl 6 N Para Hidrolizar problema, al comparar nuestra solucin problema, nos Se dejo en autoclave 3 Para romper los enlaces dimos cuenta de que haba DNP- Val, debido a sus horas a 15 libras sobre peptdicos debido a que valores de RF cercanos, por lo cual podemos concluir pulgada cuadrada estos enlaces son difciles que la hemoglobina tiene como aminocido N-terminal de romper . a la Valina en sus cuatro cadenas ya que no se Tubo que quedo Contenia la protena rota presentaron coincidencia con otro aminocido tipo. en pedacitos ya que los enlaces peptdicos se haban roto y una contenia el aminocido BIBLIOGRAFIA : Bioqumica 4ta edicin . chistopher K. , K.E Van Holde , Dean R.A , Spencer J., Ed Pearson ,pp 1357 , 2013. Fundamentos de bioqumica , jose M. y Armando G. Ed. Tebar , pp 444, 2006