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Reduca (Biologa). Serie Tcnicas y Mtodos. 4 (3): 33-47, 2011.

ISSN: 1989-3620

Curso de cromatografa de lquidos de alta resolucin (HPLC):


Prcticas de laboratorio y cuestiones terico-prcticas.
Parte II.
Prctica de laboratorio: anlisis cuantitativo bsico

Eva Mara Daz Pea. Mara Sacristn San Cristbal.


Borja Alarcn Aguareles. Carlos Vicente Crdoba.
Mara Estrella Legaz Gonzlez.

Departamento de Biologa Vegetal I (Fisiologa Vegetal). Facultad de Biologa.


Universidad Complutense de Madrid. Avenida Jos Antonio Novais, 2. 28040 Madrid. Espaa.
evam.diaz@bio.ucm.es marasacristan@bio.ucm.es
borjaestremera@hotmail.com cvicente@bio.ucm.es
melegaz@bio.ucm.es.

Resumen: En la prctica que se plantea, el alumno realiza dos tipos de calibracin, una
absoluta y otra relativa que permiten cuantificar un analito cuya concentracin en la
muestra problema se desconoce. En la calibracin absoluta se emplean
concentraciones crecientes de cido p-hidroxibenzoico analizando la respuesta del
detector. En el caso de la calibracin relativa se emplean concentraciones crecientes
de cido glico en presencia de una concentracin fija de cido p-hidroxibenzoico que
acta como patrn interno.

Palabras clave: Analito. Columna analtica. Cuentas de rea. Detector. Fase


estacionaria. Fase mvil. HPLC. Masa inyectada. Tiempo de retencin.

INTRODUCCIN

Desde la incorporacin de modernos detectores a la salida de la columna y el


acoplamiento de sistemas de integracin, la tcnica de HPLC ofrece la posibilidad de
realizar anlisis cuantitativos. Los sofisticados sistemas de integracin proporcionan
resultados de forma rpida y relativamente sencilla. Sin embargo, es importante
resaltar que la decisin final slo puede ser tomada por el usuario experto en
cromatografa, quien analizar toda la informacin contenida en el cromatograma.

El pico cromatogrfico representa una Gaussiana, que es una distribucin de las


molculas que eluyen a lo largo del tiempo. La cuantificacin del pico conlleva la
evaluacin del nmero de molculas de cada soluto (cada pico) y, por tanto, la
cantidad o concentracin de la misma. El anlisis cuantitativo se basa en la
comparacin de la altura, o el rea, del pico del analito con la de uno o ms patrones
inyectados bajo las mismas condiciones cromatogrficas. El uso de una u otro

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depender de las caractersticas de la banda obtenida, altura en el caso de picos muy


agudos y, normalmente, rea. Siempre y cuando la resolucin (Rs) sea adecuada, el
rea del pico es el parmetro cuantitativo fundamental. sta se mide, bien
triangulando el pico, como se coment en la Prctica del clculo de la eficiencia o
mediante un sistema de integracin digital electrnico en lnea con un ordenador. Para
realizar un buen anlisis cuantitativo hay que tener en cuenta dos aspectos
fundamentales: correcto calibrado del equipo instrumental y las posibles causas de
error en las mediciones. Teniendo estos dos aspectos controlados, existen cinco
mtodos de anlisis cuantitativo que se discuten brevemente a continuacin.

Calibracin directa, absoluta, o de patrn externo

Para realizar el clculo de la composicin de la muestra, se inyectan masas


exactas y conocidas de analito puro (patrn) y se determina su rea (A p). A
continuacin se hace una grfica relacionando el rea del pico (Ap) con su masa (mp),
obteniendo entonces una curva de calibracin que debe ser lineal y pasar por el origen
del eje de coordenadas (Fig. 1). As se realizar despus con cada uno de los patrones.

Ecuacin de la recta

Ap Ap =K mp
Pendiente
K

mp

Figura 1. Recta de calibracin directa.

Se inyecta entonces una masa exacta de la muestra problema (mx) y se


determina el rea del componente a analizar (Ax). La masa de cada componente se
obtendr interpolando el valor del rea en la ecuacin correspondiente a cada patrn,
de forma que:

mp = Ap/K

Normalizacin de rea

Como indica su nombre, es un mtodo que permite establecer el porcentaje de


cada componente en la muestra. Se calcula dividiendo el rea de cada componente
entre el rea total y multiplicando por 100. Es decir:

%X = ( Ax/ i Ai) 100

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donde, Ax es el rea del componente X y en el denominador, la suma de todas las


reas. Para que este mtodo sea preciso, se debe cumplir que todos los analitos
eluyan, se detecten y tengan la misma sensibilidad bajo el detector. Normalmente,
slo se aplica a compuestos de una serie homloga.

Normalizacin de rea con factor de respuesta

Cuando se dispone de los patrones, stos se pueden analizar en las mismas


condiciones, con objeto de calcular los factores de correccin (= factores de
respuesta), f. Una substancia (puede ser un analito de la muestra) se elige como patrn
y a su factor de respuesta, fp, se le da un valor arbitrario de 100. El clculo del factor de
respuesta se realiza experimentalmente de la siguiente forma. Se hacen mezclas,
pesadas, que contienen una cantidad conocida del patrn y uno de los otros analitos y
se cromatografan; as con cada uno de ellos. Las reas de los dos picos, Ap (del patrn)
y Ax (del analito desconocido), se miden y se calcula el factor de respuesta relativo del
analito desconocido (fx) de la forma:

fx = fp (Ap/ Ax) (mx/mp)

donde, mx/mp, es el cociente de masas del analito desconocido respecto al


patrn. Cuando se cromatografa la muestra problema, cada rea obtenida se
multiplica por su factor. Entonces, el porcentaje se calcula como antes:

%X = ( Ax fx)/ i (Ai fi) 100

Calibracin indirecta, relativa o mtodo del patrn interno

En este mtodo, el patrn elegido no puede ser un analito de la muestra. Este


patrn se aade a la muestra a analizar en una concentracin conocida; de ah el
nombre de patrn interno. Este patrn interno debe cumplir una serie de requisitos:
eluir cerca de los picos de inters, estar resuelto de ellos, ser de naturaleza qumica
similar a los analitos de inters y no reaccionar con ellos y debe existir en estado puro.

La forma experimental de realizar este proceso es la siguiente: se preparan


muestras que contengan dos patrones, uno, el del analito presente en la muestra a
concentracin variable y otro, el elegido como patrn interno, a una concentracin
fija. Se cromatografan estas muestras y se realiza una curva de calibracin que debe
ser lineal. A continuacin, se representa el cociente de reas del analito patrn a
concentracin variable (Ax), respecto al patrn interno, a concentracin fija (A pi),
frente a la masa variable del analito patrn (mx). La calibracin se representa en la Fig.
2. Cuando se cromatografa la muestra problema en presencia de una concentracin
dada de patrn interno, se obtienen las reas del analito problema y del patrn
interno. Basta entonces, interpolar el cociente de reas en la recta de calibracin para
conocer la masa del analito problema.

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Ecuacin de la recta
Ax/Api
Ax/Api = K mx Pendiente
K

mx

Figura 2. Recta de calibracin indirecta.

Mtodo de adicin de patrn externo

En este mtodo tambin se aade un patrn a la muestra problema, pero la


naturaleza qumica del patrn es la misma que la del analito de inters. Se requiere
una alta reproducibilidad en el volumen de muestra inyectada.

El principio de este mtodo es que la seal extra, producida por la adicin de


patrn, es proporcional a la seal original. La Fig. 3 muestra de forma grfica este
mtodo. Ntese que hay seal cuando no hay adicin de patrn externo; esta
representa la concentracin original que es el objeto de determinacin. A medida que
aumenta la cantidad de patrn externo (mpe) aadido a la muestra, la seal incrementa
(rea de pico), produciendo una lnea recta de calibracin.

rea de pico
Concentracin
original

mpe

Figura 3. Recta de calibracin por adicin de patrn externo.

Para encontrar la cantidad original desconocida de analito, se extrapola la lnea


recta hasta cortar con el eje de abscisas en la zona negativa. Este valor en el eje de
abscisas, cambiado de signo, representa la cantidad (masa) de analito presente en la
muestra antes de la adicin de cualquier cantidad de patrn externo.

En la prctica que se plantea a continuacin, se realizarn cuantificaciones


mediante el mtodo de calibracin directa y mediante el mtodo de calibracin
indirecta.

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OBJETIVO DE LA PRCTICA

Se realizarn dos rectas de calibracin, una directa y otra inversa. En la


calibracin directa, se cuantificar la concentracin de cido glico utilizando una
gama de concentraciones variable. En la calibracin indirecta, se cuantificar la
concentracin de cido glico, utilizando como patrn interno cido p-hidroxibenzoico
a una concentracin fija. Se realizarn las siguientes representaciones grficas:

1. Recta de calibracin directa de cido glico.


2. Recta de calibracin indirecta de cido glico, utilizando cido p-
hidroxibenzoico como patrn interno.

MATERIAL Y MTODOS

Equipo cromatogrfico. Cromatgrafo de Lquidos de Alta Resolucin.

Cromatgrafo lquido. Spectra Physics 8810 (Thermo Electron Corporation, Asheville,


NC, USA), con un loop de inyeccin de 20 L.

Bomba. SP 8810 LC (Thermo Electron Corporation, Asheville, NC, USA), elctrica


alternante de pistn recproco.

Fase estacionaria.
Columna: Mediterranea sea C18 (Teknokroma, S.C.L. Spain).
Tipo: Fase Reversa.
Longitud (L): 120 mm.
Dimetro de partcula (dp): 5m.
Dimetro interno (di): 4,6 mm.

Temperatura. 25oc.

Fase mvil.
Reservorio A: Acetonitrilo (ACN).
Reservorio B: 4% de cido actico en agua Milli-Q.
Fase mvil: 30% de A y 70% de B, en condiciones isocrticas.
Flujo de fase mvil: 1,0 mLmin 1.

Detector SP 8490 UV-Visible (Thermo Electron Corporation, Asheville, NC, USA).


Longitud de onda de anlisis: 270 nm (segn el mximo de absorbancia obtenido
en el espectro de absorbancia de cido glico, ver Fig. 6). A esta longitud de
onda, el cido p-hidroxibenzoico tambin muestra una absorbancia
relativamente alta (ver Fig. 5).
Rango (UAFE): 0,005 unidades.

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Sistema de integracin. DataApex Clarity LiteTM software para Windows (DataApex


Ltd., Praha, Czech Republic).

Muestras empleadas. cido glico (M.M.=170,1), en la recta de calibracin directa y


cidos glico y p-hidroxibenzoico (M.M.=138,1) en la calibracin indirecta. En la Fig. 4
se muestran las estructuras moleculares de dichos cidos.

COOH COOH

HO OH
OH OH

cido glico cido p-hidroxibenzoico

Figura 4. Frmulas estructurales del cido glico y del cido p-hidroxibenzoico.

RESULTADOS Y DISCUSIN

Antes de realizar la cuantificacin, se debe hacer el espectro de absorbancia de


los analitos a utilizar, disueltos en 4% cido actico en agua Milli-Q:ACN (80:20, v/v),
para poder escoger la longitud de onda ms adecuada. En el caso que nos ocupa,
tenemos dos analitos, cidos glico y p-hidroxibenzoico y no necesariamente tienen
por qu tener un espectro idntico. El cido glico presenta un mximo de absorbancia
principal a 270 nm (Fig. 6), mientras que el cido p-hidroxibenzoico posee una mximo
principal de absorbancia a 256 nm (Fig. 5). No obstante, ste ltimo tiene casi un 50%
de absorbancia a 270 nm, respecto al 100% de absorbancia a 256 nm. En situaciones
de este tipo debe escogerse una longitud de onda de anlisis donde todos los analitos
muestren una seal apreciable de absorbancia. El espectro de absorbancia de un
analito es una caracterstica del analito en cada disolvente, un mismo analito puede
tener espectros de absorbancia ligeramente distintos, dependiendo del disolvente en
el que se haya disuelto. En esta prctica, se ha elegido una longitud de onda de 270
nm, dado que el analito problema, cido glico, tiene aqu su mximo y el cido p-
hidroxibenzoico, que se utilizar como patrn interno, tambin absorbe lo suficiente
como para poder ser detectado.

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-1
Figura 5. Espectro de absorbancia del cido p-hidroxibenzoico a una concentracin de 5 gmL
disuelto en 4% cido actico en agua Milli-Q:ACN (80:20, v/v). Sobre la curva, el nmero 1 representa
el mximo principal de absorcin a 256 nm.

-1
Figura 6. Espectro de absorbancia del cido glico a una concentracin de 5 gmL disuelto en 4%
cido actico en agua Milli-Q:ACN (80:20, v/v). Sobre la curva, el nmero 1 representa el mximo
principal de absorcin a 270 nm.

Recta de calibracin directa

El analito problema es el cido glico. En este tipo de calibracin se procede


experimentalmente de la siguiente manera: Se prepara una disolucin madre de cido

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glico disuelto en fase mvil (4% cido actico en agua Milli-Q:ACN (80:20, v/v) y de
sta se van haciendo tantas diluciones como puntos se quieran realizar en la recta de
calibracin. En este caso concreto, se preparar una disolucin madre de cido glico a
una concentracin 0,05 mgmL-1 y, diferentes diluciones, para conseguir
concentraciones de 0,005; 0,01; 0,02; 0,03; 0,04 y 0,05 mgmL-1. Cada una de estas
disoluciones se inyecta en el cromatgrafo en las condiciones descritas y se obtiene el
resultado de la respuesta del detector, expresada en cuentas de rea.

Recta de calibracin indirecta

El analito problema es el cido glico. En este tipo de calibracin se utiliza


tambin un patrn interno, cido p-hidroxibenzoico, que cumple los requisitos
expresados con anterioridad. La forma de proceder experimentalmente es la siguiente:
Se prepara una disolucin madre de cido glico 0,05 mgmL-1 y las diferentes
diluciones para obtener la gama de concentraciones expuesta anteriormente en la
calibracin directa, es decir, 0,005; 0,01; 0,02; 0,03; 0,04 y 0,05 mgmL-1. A cada una de
estas disoluciones se les aade una concentracin fija de cido p-hidroxibenzoico de
0,05 mgmL-1. Cada una de estas disoluciones se inyecta en el cromatgrafo en las
condiciones descritas y se obtiene la respuesta del detector expresada en cuentas de
rea.
Unidades de Absorbancia

Tiempo (minutos)

-1 -1
Figura 7. Cromatograma de cido glico 0,005 mgmL y cido p-hidroxibenzoico 0,05 mgmL a un
-1
flujo de fase mvil de 1 mLmin .

Pico Resultado tR (min) Cuentas de rea


(nmero) (%) (106)
1 11,5 3,22 4,2
2 85,57 4,27 31,23

Tabla 1. Resultados de la cuantificacin del cromatograma de cido glico 0,005 mgmL-1 y cido p-
-1 -1
hidroxibenzoico 0,05 mgmL a un flujo de fase mvil de 1 mLmin .

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Por razones de economa, se muestran los cromatogramas obtenidos de las


disoluciones preparadas para la calibracin indirecta, exclusivamente (Figs. 33 a 38). En
las Tablas 7 a 12 se muestran los resultados de cuantificacin de los picos, obtenidos
mediante el software correspondiente.

El cido glico eluye con un tR de 3,22 0,2 min y el cido p-hidroxibenzoico con
un tR de 4,31 0,5 min. El pico (rea) del cido glico aumenta a medida que aumenta
la concentracin (masa inyectada en el loop de 20 L), mientras que el pico de cido
p-hidroxibenzoico se mantiene constante ya que su concentracin no vara en cada
una de las inyecciones. A continuacin se muestran estos resultados en las Figs. 7 a 12
y en las tablas 1 a 6. En este caso, todas las condiciones de anlisis se mantienen y lo
nico que vara es la concentracin inyectada del analito problema.
Unidades de Absorbancia

Tiempo (minutos)

-1 -1
Figura 8. Cromatograma de cido glico 0,01 mgmL y cido p-hidroxibenzoico 0,05 mgmL a un
-1
flujo de fase mvil de 1 mLmin .

Pico Resultado tR (min) Cuentas de rea


(nmero) (%) (106)
1 16,71 3,23 6,55
2 83,29 4,36 32,67

-1
Tabla 2. Resultados de la cuantificacin del cromatograma de cido glico 0,01 mgmL y cido p-
-1 -1
hidroxibenzoico 0,05 mgmL a un flujo de fase mvil de 1 mLmin .

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Unidades de Absorbancia

Tiempo (minutos)

-1 -1
Figura 9. Cromatograma de cido glico 0,02 mgmL y cido p-hidroxibenzoico 0,05 mgmL a un
-1
flujo de fase mvil de 1 mLmin .

Pico Resultado tR (min) Cuentas de rea


(nmero) (%) (106)
1 28,32 3,25 9,9
2 71,68 4,36 25,05
-1
Tabla 3. Resultados de la cuantificacin del cromatograma de cido glico 0,02 mgmL y cido p-
-1 -1
hidroxibenzoico 0,05 mgmL a un flujo de fase mvil de 1 mLmin .
Unidades de Absorbancia

Tiempo (minutos)

-1 -1
Figura 10. Cromatograma de cido glico 0,03 mgmL y cido p-hidroxibenzoico 0,05 mgmL a un
-1
flujo de fase mvil de 1 mLmin .

Pico Resultado tR (min) Cuentas de rea


(nmero) (%) (106)
1 37,2 3,23 16,07
2 62,8 4,33 27,12
-1
Tabla 4. Resultados de la cuantificacin del cromatograma de cido glico 0,03 mgmL y cido p-
-1 -1
hidroxibenzoico 0,05 mgmL a un flujo de fase mvil de 1 mLmin .

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Unidades de Absorbancia

Tiempo (minutos)

-1 -1
Figura 11. Cromatograma de cido glico 0,04 mgmL y cido p-hidroxibenzoico 0,05 mgmL a un
-1
flujo de fase mvil de 1 mLmin .

Pico Resultado tR (min) Cuentas de rea


(nmero) (%) (106)
1 43,67 3,24 23,71
2 56,33 4,36 30,58
-1
Tabla 5. Resultados de la cuantificacin del cromatograma de cido glico 0,04 mgmL y cido p-
-1 -1
hidroxibenzoico 0,05 mgmL a un flujo de fase mvil de 1 mLmin .
Unidades de Absorbancia

Tiempo (minutos)

-1 -1
Figura 12. Cromatograma de cido glico 0,05 mgmL y cido p-hidroxibenzoico 0,05 mgmL a un
-1
flujo de fase mvil de 1 mLmin .

Pico Resultado tR (min) Cuentas de rea


(nmero) (%) (106)
1 48,37 3,22 31,92
2 51,62 4,31 34,07
-1
Tabla 6. Resultados de la cuantificacin del cromatograma de cido glico 0,05 mgmL y cido p-
-1 -1
hidroxibenzoico 0,05 mgmL a un flujo de fase mvil de 1 mLmin .

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Representacin grfica de la recta de calibracin directa de cido glico

En la Tabla 7 se muestran los resultados de la cuantificacin del cido glico,


obtenidos de los cromatogramas mostrados anteriormente. Como se observa, las
cuentas de rea del pico, que son directamente proporcionales a su concentracin
(masa inyectada), aumentan al aumentar sta. En la tabla tambin se muestra la ligera
variacin del tR, as como la masa inyectada. Por convenio, a la hora de hacer la
representacin grfica de la calibracin directa, en el eje de abscisas se mostrar la
masa inyectada (mi) en lugar de la concentracin. sta se calcula en funcin del
volumen de muestra inyectada en la columna a travs del loop de inyeccin, 20 L
en este caso.

tR cido glico Masa inyectada Concentracin Cuentas de rea


(min) (g) (mgmL -1) (106)
3,22 0,1 0,005 4,2
3,23 0,2 0,01 6,55
3,23 0,4 0,02 9,9
3,21 0,6 0,03 16,07
3,24 0,8 0,04 23,71
3,22 1 0,05 31,92

Tabla 7. Resultados de la cuantificacin de cido glico inyectado a diferentes concentraciones.

36

30
Cuentas de rea (10 )
6

24

18 y = 604,97x - 0,2024
R2 = 0,9826
12

0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
Masa inyectada (g)

Figura 13. Variacin de las cuentas de rea en funcin de la concentracin de cido glico (en color
azul). En color rojo se muestra el ajuste, por regresin lineal, de esta curva as como la ecuacin de la
recta obtenida.

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La representacin de los valores mostrados en la Tabla 7 da una curva que se


ajusta, por regresin lineal, a una recta cuya ecuacin se observa en la Fig. 13. Por
tanto, el cido glico en el rango de concentraciones ensayadas produce una respuesta
lineal en el detector, esto es, a mayor masa inyectada, mayor respuesta.

Este tipo de calibracin se utiliza siempre y cuando haya certeza de que en la


muestra problema existe un determinado analito y ste adems est comercializado
en forma pura. En el caso que nos ocupa, el analito presente en la muestra es el cido
glico, el cual adems existe comercializado como patrn puro. De esta forma, una vez
obtenida la ecuacin de la recta correspondiente a la calibracin directa, cualquier
valor de cuentas de rea de cido glico presente en la muestra problema puede ser
interpolado para obtener la masa inyectada (concentracin) de cido glico presente
en la muestra.

Representacin grfica de la recta de calibracin indirecta de cido glico utilizando


cido p-hidroxibenzoico como patrn interno.

En la Tabla 8 se muestran los resultados de la cuantificacin de cido glico a


concentracin variable, empleando como patrn interno una concentracin fija de
cido p-hidroxibenzoico. Tambin se muestran las ligeras variaciones que pueden
darse en el tiempo de retencin de los dos analitos y la masa inyectada, consecuencia
de la inyeccin en el loop de 20 L. En el caso de la calibracin indirecta, en el eje de
ordenadas se representa la respuesta del detector expresada en cuentas de rea
relativas; esto es, la respuesta en el detector del analito problema respecto a la del
patrn interno y en el eje de abscisas, la masa inyectada de analito problema.

Concentracin Cuentas de rea


Concentracin tR cido cido p - Masa inyectada
tR cido glico Masa inyectada cido glico cido p - relativas (C.a. cido
cido glico hidroxibenzoico cido p -
(min) (g) hidroxibenzoico glico / C.a cido-p-
(mgmL-1) (min) hidroxibenzoico (g)
(mgmL-1) hidroxibenzoico)
3,22 0,1 0,005 4,27 1 0,05 0,13
3,23 0,2 0,01 4,36 1 0,05 0,2
3,23 0,4 0,02 4,33 1 0,05 0,39
3,21 0,6 0,03 4,36 1 0,05 0,59
3,24 0,8 0,04 4,36 1 0,05 0,77
3,22 1 0,05 4,31 1 0,05 0,94

Tabla 8. Resultados de la cuantificacin de cido glico, inyectado a diferentes concentraciones, en


presencia de una concentracin fija de cido p-hidroxibenzoico.

A continuacin se muestra la representacin grfica de la recta de calibracin


indirecta, empleando un patrn interno a concentracin fija, que es capaz de corregir
los posibles errores en la cuantificacin. Como en el caso de la calibracin directa, la
grfica se ajusta a una recta. En la Fig. 14 se muestra la representacin grfica de la
curva de calibracin indirecta, donde se observa que las cuentas de rea relativas son
directamente proporcionales a la masa de cido glico inyectada en la columna (color
azul); estos valores ajustados, por regresin lineal, dan una recta (color rojo) con un
coeficiente de ajuste prcticamente igual a la unidad.

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1,2

1
Cuentas de rea relativas
0,8

0,6
y = 0,9321x + 0,0208
0,4 R2 = 0,9981

0,2

0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
Masa inyectada (g)

Figura 14. Variacin de las cuentas de rea relativas en funcin de la concentracin variable de cido
glico y fija de cido p-hidroxibenzoico, como patrn interno (en color azul). En color rojo se muestra
el ajuste, por regresin lineal, de esta curva as como la ecuacin de la recta obtenida.

En la prctica, las muestras problema a las cuales se adiciona una concentracin


fija del patrn interno, son inyectadas en el sistema cromatogrfico y el detector
produce una respuesta cuantitativa expresada en cuentas de rea. Se calcula entonces
el cociente entre las cuentas de rea del analito problema y las del patrn interno y se
interpola en la recta con objeto de obtener la masa inyectada (concentracin) del
analito problema.

BIBLIOGRAFA DE CONSULTA

Dolan, J. W. y Snyder, L. R. 1989 Troubleshooting LC Systems: A Comprehensive


Approach to Troubleshooting LC Equipment and Separations. Humana Press,
Totowa, New Jersey.

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Recibido: 14 junio 2010.


Aceptado: 3 de agosto 2011.

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