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Paso de la preparacin del derivado dinitrofenilado de Interpretacin

la hemoglobina
Colocar 30 mg de la hemoglobina en un tubo con tapn con Se coloca la hemoglobina en un tubo con rosca por que
rosca, adicionar 2.4 mL de Bicarbonato de sodio al 4.2% y posteriormente se necesitar agitar el contenido. Se le adiciona la
disolver la protena solucin de NaHCO3 al 4.2% para basificar el pH ligeramente

Aadir 2 mL de la solucin de DNFB al 1% (medir con pro pipeta) Se aadi DNFB al 1% para que se dinitrofenilaran los alfa
y agitar fuertemente la suspensin durante una hora, amino terminales de las cadenas que componen a la
manteniendo el pH entre 8 y 9 con adicin si es necesario, de hemoglobina, se agitaron por una hora para que ste reaccione
bicarbonato de sodio al 4.2%; si se observa mucho precipitado es de manera ptima.
seal de que el pH est por debajo del necesario

Al terminar la dinitrofenilacin, ajustar el pH debajo de 3 con Se le agrega HCl para protonar los amiocidos terminales y as
aproximadamente 12 gotas de HCl 3 N evitar que el DNFB siga reaccionando

En el tubo, extraer 4 veces la suspensin con volmenes iguales Se agreg ter para obtener los alfa amino terminales protonados
de 5 mL cada vez de ter saturado con solucin acuosa de en la fase acuosa, y en la fase etrea extraer el DNFB que no
FeSO4. reaccion.

Colocar el tubo que contiene la protena dinitrofenilada en bao Se coloc a bao mara para evaporar los residuos de ter que
mara y agitar hasta evaporar los residuos de ter que pudieran pudieran haber quedado
haber quedado
Aadir 5 mL de HCl 6 N. Rotular y calentar en autoclave 3 horas a El HCL se adicion con el objetivo de que no reaccionara la
15 psi protena adems de promover la hidrlisis.

Extraer el hidrolizado 3 veces utilizando porciones de 5 ml de La extraccin se llev a cabo para extraer los derivados
ter cada vez. A l finalizar desechar la fase acuosa. Pasar el dinitrofenilados de los aminocidos N-Terminales ya que al ser no
residuo a un vaso de precipitados polares se encuentran en la fase etrea.

Calentar los extractos etreos en una parrilla casi a sequedad, Para eliminar el ter completamente de los derivados
enfriar y disolver el residuo en 0.5 ml de alcohol absoluto

Realizar la cromatografa en papel de derivado dinitrofenilado de Esto es para separar e identificar el aminocido N-terminal
la hemoglobina.

RESULTADOS.- Para calcular el Rf se aplica la siguiente expresin:


Rf = distancia recorrida por el compuesto (X) / distancia recorrida por el eluyente (Y)
Rf = /

Distancia recorrida por el Distancia recorrida por


compuesto (X) el eluyente
Compuesto (Y) Rf

DNP-Phe 27.3cm 0.6825


DNP-Ala 27.1cm 0.6775
DNP-Val 29cm 0.725
DNFB 19.5cm 40cm 0.4875
Problema 28.4cm 0.71
16.4cm 0.4075
Tabla 2. Resultados y clculo del Rf de cada compuesto.

Comparando los Rf de los diferentes compuestos obtenemos que el valor mas aproximado a nuestro Rf
problema fue la DNP Val. Y un Rf mas de DNFB

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