Paso de la preparacin del derivado dinitrofenilado de
la hemoglobina
Colocar 30 mg de la hemoglobina en un tubo con tapn con
rosca, adicionar 2.4 mL de Bicarbonato de sodio al 4.2% y
disolver la protena
Aadir 2 mL de la solucin de DNFB al 1% (medir con pro pipeta)
y agitar fuertemente la suspensin durante una hora,
manteniendo el pH entre 8 y 9 con adicin si es necesario, de
bicarbonato de sodio al 4.2%; si se observa mucho precipitado es
seal de que el pH est por debajo del necesario
Al terminar la dinitrofenilacin, ajustar el pH debajo de 3 con
aproximadamente 12 gotas de HCl 3 N
En el tubo, extraer 4 veces la suspensin con volmenes iguales
de 5 mL cada vez de ter saturado con solucin acuosa de
FeSO4.
Colocar el tubo que contiene la protena dinitrofenilada en bao
mara y agitar hasta evaporar los residuos de ter que pudieran
haber quedado
Aadir 5 mL de HCl 6 N. Rotular y calentar en autoclave 3 horas a
15 psi
Extraer el hidrolizado 3 veces utilizando porciones de 5 ml de
ter cada vez. A l finalizar desechar la fase acuosa. Pasar el
residuo a un vaso de precipitados
Calentar los extractos etreos en una parrilla casi a sequedad,
enfriar y disolver el residuo en 0.5 ml de alcohol absoluto
Realizar la cromatografa en papel de derivado dinitrofenilado de
la hemoglobina.
RESULTADOS.- Para calcular el Rf se aplica la siguiente expresin:
Rf = distancia recorrida por el compuesto (X) / distancia recorrida por el eluyente (Y)
Rf = /
Distancia recorrida por el
compuesto (X)
Compuesto
DNP-Phe 27.3cm
DNP-Ala 27.1cm
DNP-Val 29cm
DNFB 19.5cm
Problema 28.4cm
16.4cm
Tabla 2. Resultados y clculo del Rf de cada compuesto.
Comparando los Rf de los diferentes compuestos obtenemos que el valor mas aproximado a nuestro Rf
problema fue la DNP Val. Y un Rf mas de DNFB
.
Interpretacin
Se coloca la hemoglobina en un tubo con rosca por que
posteriormente se necesitar agitar el contenido. Se le adiciona la
solucin de NaHCO3 al 4.2% para basificar el pH ligeramente
Se aadi DNFB al 1% para que se dinitrofenilaran los alfa
amino terminales de las cadenas que componen a la
hemoglobina, se agitaron por una hora para que ste reaccione
de manera ptima.
Se le agrega HCl para protonar los amiocidos terminales y as
evitar que el DNFB siga reaccionando
Se agreg ter para obtener los alfa amino terminales protonados
en la fase acuosa, y en la fase etrea extraer el DNFB que no
reaccion.
Se coloc a bao mara para evaporar los residuos de ter que
pudieran haber quedado
El HCL se adicion con el objetivo de que no reaccionara la
protena adems de promover la hidrlisis.
La extraccin se llev a cabo para extraer los derivados
dinitrofenilados de los aminocidos N-Terminales ya que al ser no
polares se encuentran en la fase etrea.
Para eliminar el ter completamente de los derivados
Esto es para separar e identificar el aminocido N-terminal
Distancia recorrida por
el eluyente
(Y) Rf
0.6825
0.6775
0.725
40cm 0.4875
0.71
0.4075
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