Académique Documents
Professionnel Documents
Culture Documents
INDICE
1. OBJETIVOS . 2
2. FUNDAMENTO TEORICO . 2
3. PROCEDIMIENTO . 13
4. RESULTADOS Y OBSERVACIONES . 16
5. DISCUSIN . 18
6. CONCLUSIONES . 18
7. RECOMENTDACIONES . 18
8. REFERECIA BIBLIOGRAFICA . 19
9. ANEXOS . 20
10. CUESTIONARIO . 23
1
Uso del Microscopio y Coloracin de Bacterias
I. OBJETIVOS
Utilizar correctamente un microscopio para observas laminas.
Reconocer las partes del microscopio para el manejo y cuidado.
Reconocer las bacterias mediante su forma, tamao, colonia y diferenciar Gram positivo
y Gram negativo.
Identificar los diferentes tipos de bacterias ya sean cocos, bacilos, etc.
II. FUNDAMENTO TEORICO
Para el buen uso del microscopio en el laboratorio de microbiologa se deben tener en cuenta
los siguientes aspectos.
Los microscopios estn numerados y se guardan en gabinetes cerrados.
A cada estudiante del grupo se le asigna un microscopio por el cual ser responsable.
La mesa donde se colocar el microscopio para hacer la observacin debe ser estable
para evitar vibraciones de la muestra durante el examen.
2
La posicin del observador ante el microscopio debe ser cmoda y a una altura
correcta.
El mesn de trabajo debe estar limpio y libre de libros, cuadernos, bandejas y
reactivos.
Cuando se transfiera el microscopio del gabinete al mesn de trabajo, se agarra
fuertemente el brazo del microscopio con una mano y se coloca la otra mano por
debajo del instrumento. Si no se realiza de esta manera, las probabilidades de golpear
contra el mesn o dejarlo caer se elevan.
Bajo ninguna circunstancia se debe tomar el microscopio con una sola mano y menos
an, un microscopio en cada mano.
Una vez finalizada la observacin, se limpian las lentes y se guarda siguiendo las
mismas instrucciones de transporte.
Ocular: Grupo de lentes que aumenta la imagen formada por el objetivo. En su parte
superior lleva una inscripcin que indica el aumento que produce.
Tornillo Macromtrico: Acerca o aleja rpidamente el objetivo a la preparacin para
hacer un enfoque aproximado. Se usa slo con los objetivos de menor aumento.
Tornillo Micromtrico: Permite enfocar con precisin, moviendo muy lentamente el
objetivo.
3
Brazo: Sirve de soporte a los otros elementos del microscopio. Est articulado con el pie
para poder inclinarlo y hacer as ms cmoda la observacin.
Condensador: Es un sistema de lentes situado debajo de la platina que concentra la luz
sobre la preparacin, consiguindose as una iluminacin ms intensa.
Diafragma: Est formado por un conjunto de laminillas que dejan un orificio en su centro.
El dimetro del orificio puede ser variado mediante una palanca, con lo que se regula la
cantidad de luz que llega a la preparacin.
Espejo: Sirve como fuente de luz al reflejar la de un foco externo. Tiene dos caras, una
plana y otra cncava para concentrar ms la luz. En algunos microscopios es sustituido
por una lmpara que se conecta a la red.
Objetivos: Son los grupos de lentes principales, es decir, los que determinan realmente el
aumento mximo y el poder de resolucin del
microscopio. Cada objetivo lleva una
inscripcin formada por dos nmeros
separados por una barra. El primero, ms
grande, indica el nmero de aumentos del
objetivo. El segundo se denomina apertura
numrica y es una medida de la luminosidad
del objetivo. Cuanto menor es la apertura
numrica de un objetivo, mayor es la cantidad
de luz que atraviesa el objetivo.
Los objetivos de mayor aumento (43x y 97x
habitualmente) tienen el extremo retrctil
para protegerlos es caso de choque contra la preparacin, ya que para enfocarlos hay que
acercarlos mucho a la misma.
Los objetivos de gran aumento slo pueden ser utilizados si se interpone entre el objetivo y
la preparacin una gota de un lquido que tenga el mismo ndice de refraccin que el
vidrio (generalmente aceite de cedro) por lo que se denominan objetivos de inmersin.
Pie: Soporte sobre el cual se apoya el microscopio.
Pinzas: Sirven de sujecin de la preparacin sobre la platina.
Platina: Es la superficie sobre la cual se colocan las preparaciones. Tiene un orificio en su
centro para permitir el paso de la luz. En algunos microscopios est dotada de un sistema
con dos tornillos que permiten el desplazamiento preciso de la preparacin.
4
Portafiltros: Soporte que admite filtros de vidrio de diversos colores. Estos filtros se
utilizan para suavizar la luz o para aumentar el contraste.
Revlver portaobjetivo: Permite colocar en posicin de trabajo a los distintos objetivos
con que cuenta el microscopio. Presenta unas ranuras que facilitan la fijacin del objetivo
en la posicin correcta.
Tincin de Bacterias
La tincin de Gram es uno de los mtodos de tincin ms importantes en el laboratorio
bacteriolgico y con el que el estudiante debe estar perfectamente familiarizado. Su utilidad
prctica es indiscutible y en el trabajo microscpico de rutina del Laboratorio de
Microbiologa las referencias a la morfologa celular bacteriana (cocos, bacilos, positivos,
negativos, etc.) se basan justamente en la tincin de GRAM.
Son tcnicas que permiten observar microorganismos en funcin de la capacidad de los
mismos para retener (o no) determinadas sustancias colorantes, lo que depende de la carga
de la clula y del colorante.
Tinciones s Simples: Utilizan un solo colorante. Se basan en el hecho de que las clulas tienen
una composicin qumica diferente a la de su entorno, de modo que ambos se comportan de
forma diferente frente a un colorante ejemplo: Azul de metileno, safranina, etc.
Una vez fijada la preparacin (tras esperar que se enfrie), cubrir con el colorante durante 1
minuto, lavar a continuacin con abundante agua destilada, y secar con papel filtro.
Obserbar al microscopio.
Tinciones Diferenciales: Se basan en el hecho de que distintos tipos de clulas tienen distinta
composicin qumica, y por lo tanto reaccionan de forma diferente frente a una tincin, lo que
permite clasificar los microorganismos en diferentes frupos, segn su capacidad de tincin.
En este apartado estn dos tinciones de importancia taxonmica y medica: La tincin de
Gram y la de acido alcohol fresistencia( de Ziehl Neelsen). Estas tinciones utilizan mas de un
colorante.
5
bacterias, comprobando diferentes tipos de bacterias se han podido determinar cules
estructuras estn siempre presente y cules no lo son.
Flagelos:
Algunas bacterias producen flagelos, estos son apndices largos y delgados que sirven como
organelos de locomocin, se originan en el citoplasma de la clula en una estructura conocida
como cuerpo basal. El movimiento de las bacterias flageladas se cree que esta asociado a
cambios mecnicos en el cuerpo basal y a la continua generacin de ATP. La rotacin de cada
flagelo empuja a la clula bacteriana en una direccin especfica.
Los flagelos estn constituidos por una protena llamada flagelina y no pueden ser vistos con
un microscopio ordinario sin ser teidos. Los flagelos tambin pueden obsrvese con el
microscopio electrnico por medio de la tcnica sombreado.
Se pueden encontrar dispuestos de maneras diferentes sobre la superficie bacteriana de
acuerdo a esto pueden haber bacterias con:
6
4) Flagelacin peririca: Cuando
los flagelos estn casi siempre
uniformemente distribuidos.
Pared Celular:
Estructura de un flagelo de una bacteria gram Estructura de un flagelo de una bacteria gram
negativa positiva.
7
Pared celular de las Bacterias Gram Positivas:
En la mayora de las clulas gram positivas, la pared celular est compuesta por varias capas
de peptidoglucano (hasta 25 capas)] que conforman una estructura gruesa y rgida,
representando hasta el 90% de la pared celular, formados por unidades de ribitolfosfato o
glicerolfosfato, siendo estos responsables de la carga negativa de la superficie de las bacterias
y pueden intervenir con el paso de iones a travs de la pared celular.
En resumen podemos decir que los cidos teicoicos, son polmeros de glicerol y ribitol unidos
por grupos fosfatos y a menudo presentan unidos aminocidos como la d-alanina o azucares
como la glucosa. Los cidos teicoicos estn unidos al peptidoglucano mediante un enlace
covalente con el acido N-aceltimuramico, o a los lpidos de la membrana plasmtica, en cuyo
caso se denomina lipoteicoico. Los cidos teicoicos no estn presentes en las clulas gram
negativas.
8
Pared celular de las Bacterias Gram Negativas:
Est compuesta por una capa o por muy pocas capas de peptidoglucano y una membrana
externa. El peptidoglucano est unido a lipoprotenas (lpidos unidos a protenas mediante
enlaces covalentes) de la membrana externa y se encuentra en el periplasma (espacio
periplasmatico), una sustancia gelatinosa localizada entre la membrana externa y la
membrana plasmtica. El periplasma contiene una concentracin elevada de enzimas
degradantes y protenas de transporte la pared celular de las bacterias gram negativas no
contiene cidos teicoicos y el hecho de que contenga una escasa cantidad de peptidoglucano
aumenta su susceptibilidad a la ruptura mecnica.
9
Estructura y composicin de las paredes celulares de bacterias gram positiva y gram
negativas.
Cocos Gram-positivos
10
Bacilos Gram positivos
Cocos Gram-negativos
11
12
III. PROCEDIMIENTO
Con las lminas portaobjeto que le suministre el profesor observe la muestra con el
microscopio de luz utilizando el objetivo adecuado. Para ello se procede de la siguiente
manera:
13
Tincin Gram
Sustancias:
Lugol
Alcohol acetona
Colorante cristal violeta
Safarina
Materiales:
Pipeta
Tubos de prueba
Guantes de Asbesto
Agua destilada
Inoculador
Laminas porta objeto
Mechero
Microscopio
14
la llama tres veces. Dejar enfriar
15
Microscopio Ocular Objetivos Aumento
10x 100x
N1 10x 43x 430x
97x 970x
10x 100x
N2
10x 43x 430x
97x 970x
10x 100x
N3 10x 43x 430x
97x 970x
10x 100x
N4 10x 43x 430x
97x 970x
10x 100x
N5 16x 43x 430x
97x 970x
16
Muestrala letra e: Con un ocular de 10x y un objetivo de 10x obteniendo un aumento de 100x,
se obtiene la misma observacion que con un ocular de 43x no se aprecia mucho la diferencia, sin
embargo se observa manchas ligeramente ramificadas como los hilos debido al papel.
Tincion Gram
V. DISCUSION
17
Las bacterias Gram positivas y Gram negativas tien de forma distinta debido a las
diferencias constitutivas en la estructura de las paredes celulares.
La diferencia esencial entre esos dos tipos de clulas est por tanto en su resistencia a la
decoloracin; esta resistencia se debe probablemente al hecho de que en el caso de
bacterias Gram-negativas, la mezcla de alcohol/acetona es un solvente lipdico y disuelve
la membrana exterior de la pared de la clula (y tambin puede daar la membrana
citoplasmtica a la que se une peptidoglucano). La delgada capa de peptidoglicano es
incapaz de retener el de complejo cristal violeta-yodo y la clula se decolora. Las clulas
Gram positivas, a causa de sus paredes celulares ms espesas (tienen ms peptidoglicano
y menos lpido), no son permeables al disolvente ya que ste deshidrata la pared celular y
cierra los poros, disminuyendo as el espacio entre las molculas y provocando que el de
complejo cristal violeta-yodo quede atrapado dentro de la pared celular. Despus de la
decoloracin las clulas Gram positivas son todava azules, pero las Gram negativas son
incoloras.
VI. CONCLUSIONES
Se comprob el mtodo de Gram tanto positivas y negativas.
Se identifico la existencia de cocos Bacilos, etc.
Se aprendi de manera exitosa el uso correcto del microscopio para realizar los
experimentos.
VII. RECOMENDACIONES
18
Al proceder con el experimento de la tincin gram tener cuidado con la cantidad al
momento que se deben colocar las sustancias.
Esperar el tiempo dado por el profesor para seguir con el siguiente paso del experimento.
http://www.bioygeo.info/Microscopio.htm Microscopio
http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/10_Uso_
del_microscopio_de_luz.pdf Microscopio
http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/08_Tem
a_2_morfolog%C3%ADa.pdf Bacterias ,Pared celular
IX. ANEXOS
19
ENFOQUE CON EL OBJETIVO DE INMERSIN (Para uso microscopio)
El enfoque con el objetivo de inmersin se debe realizar con mayor cuidado, pero el
procedimiento es esencialmente el mismo.
1. Enfocar primero con el objetivo de mediano aumento (97 X) un rea conveniente.
2. Colocar una gota de aceite de inmersin sobre la muestra.
3. Separar los objetivos de la lmina y colocar el de inmersin girando el revlver
hasta que ste encaje.
4. Bajar cuidadosamente el objetivo de inmersin, observando lateralmente, hasta
que el objetivo quede sumergido en el aceite.
5. Separar lentamente la lmina con el uso del tornillo macromtrico hasta lograr
ver una imagen.
6. Utilizar el tornillo micromtrico hasta que la imagen se vea ntida.
Este enfoque puede lograrse girando muy poco el tornillo micromtrico, puesto que
la distancia de trabajo del objetivo de inmersin es relativamente corta.
7. Ajustar el condensador y diafragma hasta lograr la iluminacin adecuada.
20
21
Muestra de Algas Colocar en la porta objeto la muestra
Cristal violeta
22
X. CUESTIONARIO
23
3) Hacer una tabla en relacin a enfermedades microbianas que son
transmitidas por el aire, agua y alimentos.
24
Enfermedades Agente causante Modo de transmisin
Salmonellosis Salmonella alimentos
Shigellosis Shigella flexneri, S. boydi alimentos
Gastroenteritis Vibrio Parahaemolyticus alimentos
Botulismo Clostridium botulinum alimentos
Brucelosis Brucella abortus alimentos
Teniasis Taenia saginata alimentos
Toxoplasmosis Toxoplasma gandii alimentos
Colera Vibrio cholerae alimentos
Ambiasis Entamonoeba histolytica alimentos
4)
a) Diferencias qumicas entre las paredes de las bacterias gram
positiva y bacterias gram negativas.
25
b) Afecta la edad del cultivo a la reaccin de tincin de Gram
Si, la edad de las clulas, las condiciones de cultivo y la actividad de sus autolisinas
pueden afectar el resultado de la tincin. Las clulas envejecidas, o crecidas en
condiciones que impiden la sntesis de mucopptido pueden verse de color rojo. La
intensidad de la decoloracin con alcohol suele ser el problema ms comn.
5) Hacer una lista de Bacterias Gram+ y Gram- con las enfermedades que
provocan.
Gram positivas
Bacteria Enfermedad
Staphylococcus aureus Conjutivis, Sinusitis, Meningitos, Bronquitis.
Streptococcus Saprophyticus Infecciones urinarias en mujeres
Streptococcus Pyogenes Escarlatina, Erisipela
En recin nacirdos: Meningitis, sepsis
Streptococcus Agalactiae
bacterianas en adultos; endometritis
Streptococcus Pneumoniae Neumonia Neumococcica
Streptococcus Viridans Endocarditis
Clostridium tetani Tetano
Clostridium botulinum Botulismo
Corynebacterium diphteriae Difteria
Mycrobacterium tuberculosis Tuberculosis
Mycrobacterium leprae Lepra
Hemophilus influenzae Gripe
Gram negativas
Bacteria Enfermedad
Escherichia Coli Gastroenteritis, septicemia, meningitis
neonatal, infecciones del aparato urinario.
Neisseria gonorrhoeae gonorrea
Neisseria Meningitidis Meningitis
Legionella pneumophila legionelosis
Enterobacter cloacae nosocomiales
Salmonella enteritidis Enfermedad gastrointestinal
Brucella Melitensis Fiebre malta
Heloocobacter pylori Gastritis
26