UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA

LA MOLINA
Informe de laboratorio N2 Biologa general

Tema: Determinacin experimental de biomolculas I

Protenas y enzimas
INTEGRANTES:
AGUIRRE BOTTGER, Cosette
BERROCAL PUITALLA, Frank
CARRILLO RUIZ, Ricardo
ENRIQUEZ ARAUJO, Fabrizio
VASQUEZ VILLALOBOS, Helena
I. RESULTADOS: La presente prctica de laboratorio estuvo dividida en cuatro
actividades o experiencias. Estas se centraron en la determinacin experimental de
biomolculas. Se observ la desnaturalizacin y presencia de ciertas protenas e
incluso reacciones relacionadas con actividad enzimtica.

1.1 Desnaturalizacin de protenas: Se presentarn las observaciones realizadas

durante el desarrollo de la primera experiencia de laboratorio.

Coloracin inicial de la albmina: Sin coloracin (transparente)

a) Tubo 1: este tubo de ensayo fue introducido durante 3 minutos en un

recipiente de bao mara.
- Contenido del tubo de ensayo: 2 ml de albmina

Lo que se observ fue el efecto del aumento de temperatura en la

protena albmina. Durante el tiempo mencionado, la sustancia en
cuestin adoptada tonalidades blancas y aumentaba su espesor, es
decir, sufra un proceso de solidificacin o agregacin por calor.

b) Tubo 2:

- Contenido del tubo de ensayo: 1 ml de albmina + 1 ml de Acetona

Se observ el efecto de un disolvente orgnico en la albmina. La

coloracin apreciada fue blanca en los pequeos cogulos globulares
formados en la base del tubo de ensayo. El resto de la sustancia tena la
misma tonalidad mencionada pero con menor intensidad.

c) Tubo 3:
- Contenido del tubo de ensayo: 1 ml de albmina + 1 ml de cido
sulfhdrico (H2S)

Se apreci el efecto de un cido frente a la albmina. Si bien es cierto,

al igual que con la acetona, la coloracin observada fue blanca. En este
tubo de ensayo, dicho color predomin en toda la mezcla de manera
casi uniforme y en lugar de observarse pequeos cogulos en la base
del tubo de ensayo, estos estuvieron suspendidos en toda la mezcla.

d) Tubo 4:
- Contenido del tubo de ensayo: 1 ml de albmina + 1 ml de NaCl al 20%

En el caso de este tubo de ensayo, el cambio de color se produjo de manera

lenta. La albmina fue tornndose blanca al entrar en contacto con la sal
neutra adicionada. Sin embargo, la coloracin final propia de una
agregacin, no tuvo la misma intensidad que lo sucedido con el H2S o la
acetona.
 e) Tubo 5:

- Contenido del tubo de ensayo: 1 ml de albmina + 1 ml de cido ntrico

(HNO3)

En este caso tambin se observ el efecto de un cido sobre la

albmina. Es decir existi un cambio de pH. La reaccin fue rpida,
hecho que se evidenci en el cambio brusco de color de la albmina, la
que adopt una tonalidad amarilla en el mismo momento en que entr
en contacto con el HNO3. Adems se not una precipitacin clara de la
muestra.

f) Tubo 6:
- Contenido del tubo de ensayo: 1 ml de albmina + 1 ml de agua
destilada

Este tubo fue la muestra control de la experiencia. El objetivo de

colocarlo se centr en poder realizar comparaciones despus de agregar
distintas sustancias a los otros tubos con albmina. Se observ que la
albmina y el agua destilada se mezclaron de manera uniforme y la
transparencia de la protena se mantuvo.

1.2 Determinacin de presencia de protenas (reaccin de Biuret)

Tubo 1:

- Contenido del tubo de ensayo: 1ml de agua destilada + Hidrxido de sodio

acuoso (NaOH (aq)) + 2 gotas de sulfato de cobre (CuSO4)

La coloracin final observada fue celeste, propia del CuSO4 y la mezcla se

mantuvo translcida. No se apreci ningn tipo de burbujeo o cambio en
cuanto a la apariencia del agua al entrar en contacto con el NaOH (base
fuerte.)

Tubo 2:

- Contenido del tubo de ensayo: 1ml de albmina+ Hidrxido de sodio

acuoso (NaOH (aq)) + 2 gotas de sulfato de cobre (CuSO4)

La coloracin final observada fue violeta. No se apreci ningn tipo de

burbujeo; sin embargo, cuando la albmina entr en contacto con el NaOH,
lentamente se fueron precipitando pequeos agregados en la base del tubo
de ensayo.
1.3 Reconocimiento de la enzima catalasa

Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4

1.- Los trozos de hgado reacciona bruscamente al momento de colocar el agua

oxigenada, por lo cual se produce un intenso burbujeo que se expande de
manera vertical por un tramo del tubo de ensayo (tubo 4).

2.- El frijol reacciona lentamente al igual que los trozos de papa (tubo 1 y 2).

3.- Los trozos de carne reacciona un poco ms lento que los trozos de papa y el
frijol; sin embargo, en cuanto al tiempo de reaccin total, este fue ms
prolongado en comparacin al hgado (tubo 3).

1.4 Reaccin amiloltica:

B) Gotas de lugol +
A) 4 gotas de lugol almidn

D) 15 gotas de almidn + 10 C) 10 gotas de amilasa + 10 gotas de

gotas de amilosa.
Despus de 10 min, se
aadieron 2 gotas de lugol
cido sulfhdrico (H2S)
Despus de 10 min, se aadieron 10
gotas de almidn. Luego se dej
actuar la mezcla durante otros 7 min
y se adicionaron 2 gotas de lugol
 A) Se aprecian las 4 gotas de lugol vertidas, con su color caracterstico
anaranjado. A lo largo del desarrollo se la experiencia no se observa ningn
cambio de color ni burbujeo.

B) En el momento en el que el lugol entr en contacto con el almidn ya

colocado en el recipiente se apreci de manera inmediata un cambio de
coloracin. La mezcla adquiri un color azul marino oscuro intenso.

C) Cuando el almidn y la saliva se mezclan, aparentemente no se observa

cambio alguno ya que no se logra percibir ningn cambio de color o algn tipo
de efervescencia. No obstante, cuando, al cabo de 10 minutos, se le agrega dos
gotas de lugol a la mezcla, esta adopta un color caf claro translcido.

D) Al mezclar la saliva con las 10 gotas de cido sulfhdrico, no se observa un

cambio en la apariencia, hecho que se repite cuando se le agrega almidn a la
mezcla ya preparada. Sin embargo, cuando se adicionan las dos gotas de lugol,
la coloracin cambia rpidamente tornndose a un color azul oscuro, similar a
lo acontecido en la parte B.

II. DISCUSIONES

2.1 Desnaturalizacin de protenas:

La protena implicada en esta primera experiencia fue la albmina, una de las

protenas ms abundantes entre los componentes de la clara del huevo. Esta
protena presenta grupos sulfhdrido, los que la hacen muy reactiva y fcilmente
desnaturalizable. Fue exactamente esta desnaturalizacin la observada en esta
primera experiencia.

Tubo 1: Albmina sometida a bao mara

Como se seal en la seccin de resultados el aumento de temperatura implic un

cambio gradual en cuanto a la coloracin y grado de agregacin de la albmina. Ello
es una clara caracterstica de desnaturalizacin ya que se vara la organizacin de la
protena (Navas, 2010). Lo que explica el hecho de esa precipitacin es que un
aumento de temperatura implica la ruptura de los enlaces dbiles, principalmente
interacciones no covalentes, que componen la estructura terciaria. Al ocurrir ello,
se desorganiza la estructura de la protena de manera que el medio interior
reacciona con el medio acuoso produciendo una agregacin de naturaleza
irreversible. Dicha agregacin fue la observada al ver cmo la albmina iba
aumentando su espesor y cambiando de color (Gmez & Del Olmo, 2011)
 Tubo 2: Albmina ms acetona

En cuanto a este tubo de ensayo, lo que se observ principalmente que la protena

sufra un proceso de agregacin. Segn Seeley (2007) la polaridad del disolvente
disminuye cuando se le aaden sustancias menos polares que el agua como el
etanol o la acetona. Con ello disminuye el grado de hidratacin de los grupos inicos
superficiales de la molcula proteica, provocando la agregacin y precipitacin. Los
disolventes orgnicos interaccionan con el interior hidrofbico de las protenas y
desorganizan la estructura terciaria, ello da lugar a su desnaturalizacin y
precipitacin. La accin de los detergentes es similar a la de los disolventes
orgnicos.

Tubo 3 y 5:

En ambos tubos se realiz un cambio brusco de pH. La diferencia observable en

cuanto al tubo 3 y el tubo 5 fue principalmente el color, puesto que la agregacin y
posterior precipitacin de las protenas se apreci en ambos tubos de ensayo. Un
cambio en el pH produce un cambio de carga. Gmez y Del Olmos (2011) mencionan
que ello sucede principalmente en las cadenas laterales polares.

En cuanto al cambio de pH del medio y el comportamiento de las protenas, es

necesario conocer el punto isoelctrico de esta. En el caso de la ovoalbmina, su
punto isoelctrico es de 4,5 (Arzeni, 2014). Ya que en ambos casos, el pH del medio
fue notablemente menor, los iones H+ de los cidos en cuestin afectaron las cargas
de las cadenas laterales de los aminocidos. Ello alter las caras electrostticas
siendo estas las responsable de prevenir la formacin de agregados con tal de
mantener la actividad biolgica de la protena.

- Tubo 3: Albmina mezclada con cido sulfhdrico (H2S)

El comportamiento observado en este tubo de ensayo fue similar al notado en el

tubo 5, teniendo como diferencia el cambio de color. Lo que sucede al agregar cido
sulfhdrico es que acta sobre todo en las regiones metlicas de las protenas,
hecho que impide su funcionamiento.

- Tubo 5: Albmina mezclada con cido ntrico (HNO3)

La reaccin apreciada fue rpida y con un cambio en la coloracin notable (de

transparente a amarillo) casi en el mismo instante en el que las dos sustancias
entraron en contacto. En cuanto al cambio de color observado, segn el informe de
la Escuela Europea de Luxemburgo (2012), esta reaccin se debe a la formacin de
un compuesto aromtico nitrado de color amarillo cuando las protenas son
tratadas con cido ntrico concentrado. Ello sucede si las protenas son portadoras
de grupos bencnicos, tirosina, fenilalanina y triptfano; y en el caso de la
albumina, esta es una protena portadora fenilalanina y tirosina (Arzeni, 2014).
- Tubo 4: Albmina ms NaCl (aq) al 20%

Cuando la albmina entra en contacto can sales neutras en estado acuoso, Gmez
(2011) indica que se disuelven con el agua (disociacin) robando la esfera de
solvatacin que rodea a las protenas. As, se da lugar a una prdida de solubilidad
drstica al aumentar la concentracin de la sal. Luego, estos solutos compiten por
el agua, rompiendo los enlaces dbiles o interacciones electroestticas y por tanto,
la protena pierde su estructura (se expande) y funcin.

- Tubo 6: albmina mezclada con agua destilada

Este tubo fue la muestra control de la experiencia. No se notaron cambios

aparentes a la hora de mezclar las sustancias. Por ello, es posible mencionar que la
albmina es una protena hidroflica. Posiblemente este hecho sea corroborado con
lo que menciona el informe generado por la UNAM (2007) en cuanto a que para
protenas hidroflicas las temperaturas estables estn entre los 20C a 30C, en
cambio para protenas hidrofbicas las temperaturas +optimas varan entre 60C y
70C. Este hecho se comprueba con la desnaturalizacin de la albmina al ser
sometida al bao mara.

2.2 Determinacin de la presencia de protenas (Reaccin de Biuret):

Como se seal se obtuvieron dos coloraciones distintas en esta experiencia. El tubo

con agua, NaOH al 40% y sulfato de sobre al 50% adquiri una coloracin celeste
(tubo 1), mientras que el otro tubo con agua destilada en lugar de albmina,
adquiri un color violeta (tubo 2).

La prueba de Biuret tiene el objetivo de identificar la presencia de enlaces

peptdicos, enlaces tpicos en cuanto a la estructura de protenas. Se basa en la
formacin de sales complejas de color violeta al aadir sulfato cprico en solucin
alcalina (Snchez & Uribe, 2008) tal como se realiz en esta experiencia, la solucin
alcalina se obtuvo al introducir NaOH en los tubos de ensayo.

El complejo mencionado se forma por enlaces de coordinacin. Donde los pares

electrnicos pertenecen a los grupos amino de los aminocidos participantes.
Teniendo en cuanta lo observado, la reaccin fue positiva para el tubo que contena
la albmina, ya que en efecto viene a ser una protena (Barroeta, 2008). En cambio,
para el caso del agua, la reaccin fue negativa ya que el agua no posee en su
composicin estructural un grupo amino y mucho menos enlaces peptdicos ya que
se trata de una molcula inorgnica binaria unidas a partir de puentes de hidrgeno.
La nica coloracin observada fue la celeste que es propia del sulfato cprico.
 COMPLEJO FORMADO EN LA REACCIN DE BIURET

2.3 Reconocimiento de la enzima catalasa

A partir de lo observado, es posible mencionarlo siguiente, en cuanto a la

actividad presentada por la enzima en cuestin:

- Muy buena actividad: trozos de hgado.

- Buena actividad: trozos de carne (tardo).
- Poca actividad: frijoles.
- Muy poca actividad: papa picada.

La enzima implicada en esta reaccin es la Catalasa. Esta enzima es una de las

ms abundantes en la naturaleza y su funcin enzimtica est relacionada a la
destruccin del H2O2 generado durante el metabolismo celular. Se caracteriza
por su gran capacidad de reaccin, hecho que se comprob con las
observaciones realizadas.

La funcin enzimtica de la catalasa se ve representada en la siguiente ecuacin:

2H2O2 + Catalasa 2H2O + O2

Tal como se seal, los tejidos animales tuvieron una reaccin mayor a los
tejidos vegetales. Por ello, es posible mencionar que los tejidos animales,
principalmente el hgado, poseen una mayor cantidad de enzimas catalasa en
comparacin a los tejidos vegetales.

Dicha situacin puede ser explicada por lo que menciona Conn (1996). En primer
lugar, los tejidos animales, contienen varias oxidasas, enzimas que pueden
oxidar H de diversas sustancias orgnicas como parte de un largo proceso
metablico principalmente digestivo. A lo largo de este, la cantidad de toxinas
eliminadas es alta. Uno de los productos intermedios de este metabolismo es el
perxido de hidrogeno (H2O2) el alcohol y otras sustancias nocivas con un alto
poder toxico, por ello la importancia de una presencia amplia de enzimas
peroxidasas y tal como se vio en la ecuacin superior finalmente se liberan
compuestos no nocivos: Oxgeno (responsable del burbujeo) y agua. Puesto que
se mencion que la principales rutas metablicas era de naturaleza digestiva y
teniendo en cuanta que los organismos vegetales son auttrofos y producen su
alimento a partir de la fotosntesis, la cantidad de enzimas peroxidasas y por
ende la catalasa debe ser menor en su composicin
2.4 Reaccin amiloltica:

Teniendo en cuanta que se observaron reacciones en todas las secciones de esta

experiencia a excepcin de la A ya que solo contena lugol, la discusin respectiva
se centrar en las secciones restantes.

A) Constituy la muestra control negativa, ya que solo se coloc el indicador en

cuestin (lugol) sin la presencia de otro tipo de sustancia.

B) Constituy la muestra control positiva de la experiencia, puesto que la

reaccin fue la esperada. Es decir, se verific la presencia de almidn gracias al
indicador utilizado y el cambio de color observado.

La coloracin observada es atribuida a la conocida prueba del yodo, una

reaccin qumica que se usa para determinar la presencia o alteracin de
almidn u otros polisacridos. Esta reaccin es el resultado de la formacin de
cadenas de poliyoduro a partir de la reaccin del almidn con el yodo presente
en el lugol. La amilosa, el componente del almidn forma hlices y es
exactamente en estos hlices donde se depositan y juntan las molculas de
yodo, dotando a la mezcla del color azul caracterstico (Morrison & Boyd, 1998).

C) Lo observado en esta seccin es que el color final adoptado con la mezcla

guard una clara similitud con la muestra control negativa. El porqu de tal
suceso se debe a que esta vez se aadi amilasa al almidn antes de agregar las
gotas de lugol. La amilasa, segn Garrido (2008) a condiciones ambiente y bajo
un pH casi neutro, tal como se encuentra en la saliva humana degrada el almidn
hasta disacridos como sacarosa. De esta forma, los componentes del lugol,
especficamente el yodo, ya no ingresan a las cadenas de amilosa ya que estas
fueron previamente degradadas. Por tanto, la coloracin que adquiere la
mezcla, tal como se observ, es muy similar a la del propio lugol.

D) Esta vez, el resultado obtenido coincidi con la muestra control positiva. La

coloracin final de la mezcla fue de azul oscuro, tal como se vio en la seccin de
resultados. Se hubiera esperado un resultado similar a lo apreciado en la seccin
anterior. Sin embargo, esta vez la amilasa fue previamente desnaturalizada con
cido sulfhdrico (H2S) antes de entrar en contacto con el almidn. Es sabido que
la amilasa desempaa una labor optima a pH neutro (Garrido, 2008), entonces,
al entrar en contacto con el H2S el pH vara drsticamente desnaturalizando a
la enzima en cuestin.

De esta manera, no fue posible que cumpla su funcin biolgica de degradacin

del almidn permitiendo que el lugol reaccion de forma positiva con este
ltimo.
III. CONCLUSIONES:

Las experimentaciones y observaciones realizadas permitieron cumplir los objetivos

propuestos al inicio de la sesin. Gracias a la segunda, tercera y cuarta actividad, se
logr identificar las protenas presentes en una muestra:

- A partir de lo observado en la actividad N 2 y teniendo en cuenta la

Reaccin de Biuret, se comprob la presencia de enlaces peptdicos en la
albmina.
- La reaccin observada entre el agua oxigenada y la catalasa, evidenci la
clara presencia de dicha enzima en tejidos vegetales y animales.
- A partir de las distintas observaciones realizadas con lugol, se comprob la
presencia clara de almidn evidenciada en la coloracin azul oscuro de la
muestra.

La observacin experimental de la desnaturalizacin fue lograda a partir de los

registros realizados para cada tubo de ensayo en la primera actividad donde la
albumina era sometida a distintos factores que modificaban el pH del medio, carga
electrosttica y solubilidad.

Para finalizar, la observacin de la actividad enzimtica y los factores que la afectan,

fue lograda con las observaciones respectivas a la tercera actividad. En el caso de la
cuarta actividad se evidenci la degradacin del almidn y por ende su no reaccin
con el lugol bajo la presencia de amilasas presentes en la saliva.

IV. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS:

Snchez, S. & Uribe, S. (2008) Manual de Prcticas BIOQUMICA. Mxico: McGraw-

Hill Interamericana

Seeley, R. (2007) Essentials of Anatomy and Physiology, 6/e. Idaho: Phoenix College

Pena, A. (1998) Bioqumica. Editorial Limsusa

Morrison & Boyd (1998) Qumica orgnica. Quinta edicin. Mxico: Fondo educativo
interamericano

Arzeni, C. (2014) Modificacin molecular y funcional de protenas de clara de huevo

mediante ultrasonidos de alta intensidad: aplicacin de esta tecnologa al
diseo de nanovehculos para cido flico. Recuperado de
http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_5480_Arzeni.pdf

Nava, J. (2010) Tema 4. Protenas: funciones biolgicas y estructura primaria.

Recuperado de http://ocw.unican.es/ciencias-de-la-
salud/bioqumica/material-de-clase-1/Tema4_proteinas.pdf

Gmez, A. & Del Olmo, L. (2011) Bioqumica general. Recuperado de

http://es.slideshare.net/Barboutf/bioqumica-general
Estabilidad y desnaturalizacin de protenas UNAM (2007) Recuperado el 25 de
marzo de 2016, de
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Proteinas2-
Desnaturalizacion_25708.pdf

Barroeta, A. (2008) El huevo y sus componentes como alimento funcional.

Recuperado de
proteinahttp://www.institutohuevo.com/images/archivos/ana_barroeta._
el_huevo_alimento_funcional08_13135328.pdf