La envoltura celular de Thermoproteus tenax:

estructura tridimensional de la capa

superficial y su papel en el mantenimiento de
la forma
Wildhaber y W. Baumeister
Instituto Max Planck de Bioqumica, D-8033 Martinsried cerca de Mnich, RFA
Comunicado por R. Henderson

El archaebacterium dependiente de azufre Thermoproteus tenax tiene una forma de clula cilndrica
variable en longitud, pero constante en dimetro. Toda su superficie est cubierta por una capa de
protena regular (capa S). La red tiene una simetra p6 y una constante de retcula de 32,8 nm. La
reconstruccin tridimensional de una serie de inclinacin de la capa S aislada y negativamente teida
muestra una distribucin de masa compleja de la protena: una prominente protrusin en forma de
pilar se encuentra en el eje cristalogrfico de 6 veces con brazos radiales que conectan hexmeros
vecinos en la cerca del eje de 3 plegados. Los vectores de base de la rejilla de la capa S tienen una
orientacin preferida con respecto al eje longitudinal de la clula. La capa puede ser vista como una
estructura helicoidal que consiste en una hlice de dos hilos de la mano derecha, con las cadenas
individuales en paralelo. Suponiendo que la nueva protena de la capa S se inserte en las fallas de la
red (divulgaciones de la cua) cerca de los polos, el crecimiento de la capa procedera entonces
moviendo una discinacin al final de la hlice. La forma constante de la clula, as como la estructura
particular de la capa, sugieren fuertemente que esta capa S tiene una funcin de mantenimiento de
la forma.

Introduccin
Thermoproteus tenax es un archaebacterium extremadamente termfilo (crecimiento ptimo cerca
de 90 C), aislado originalmente de una fuente solfatrica islandesa (Zilling et al., 1981). Pertenece a
los Thermoproteales, un orden novedoso que forma una rama de las arqueobacterias dependientes
del azufre que tambin comprende los Sulfolobales.
T. tenax presenta una arquitectura sobresalientemente simple de la envoltura celular, prototpica
para el tipo de bacterias "Gram negativas" (Kandler y Konig, 1985). Es tentador verlo como un testigo
vivo de una etapa temprana en la evolucin de las envolturas celulares. Una matriz regular de dos
glicoprotenas, que est ntimamente asociada con la membrana plasmtica, es el nico componente
de la envoltura celular (Konig y Stetter, 1986). La rejilla que cubre la superficie de las barras delgadas
y largas - longitudes de clulas de hasta 80 um ha sido reportado - es de regularidad excepcional; no
hay fallas visibles aparte de las revelaciones en las cubiertas de los polos. Hasta el momento, la capa
S de T. tenax ha resistido todos los intentos de disociarlo en los protmeros constituyentes, lo que
constituye un serio obstculo para la caracterizacin qumica de la protena de la capa S.
Recientemente Messner et al. (1986) han dado cuenta de un anlisis bidimensional y, en este
contexto, expresaron la suposicin de que la capa S de T. tenax tiene una funcin determinante de la
forma; no intentaron elaborar posibles mecanismos morfogenticos. En este reporte les presentamos
un modelo tridimensional de la capa S, revelando una estructura de protenas de forma extravagante
y analizamos su papel en el mantenimiento de la forma y en la determinacin de la forma.

Resultados
T. tenax es una bacteria en forma de varilla, de longitud variable, pero con un dimetro de celda
notablemente constante de 412 30 nm. La clula est completamente cubierta con una capa de
protena regular (Figura 1). La superficie exterior de la capa S es relativamente lisa y sin rasgos
caractersticos; en las preparaciones profundamente grabadas slo se pueden ver pozos poco
profundos dispuestos en una red hexagonal (Figura 1c). Los cuadros de clulas congeladas o de
seccin delgada indican que el volumen principal de la capa S se localiza ~ 25 nm por encima de la
membrana plasmtica; las protrusiones delgadas parecen interconectar la capa con la membrana
(Figura 1). Ocasionalmente, la capa S es totalmente oscurecida por una capa de carbohidratos.
No es inusual que, en una poblacin bacteriana, coexistan individuos con capas de carbohidratos de
espesor variable.
Las figuras 1a, b y d muestran clulas en proceso de divisin. La Figura 1b representa una etapa
particularmente temprana: la capa S y la membrana plasmtica empiezan a separarse unas de otras
y la membrana se inclina hacia dentro. En la mayora de los casos, la divisin parece desarrollarse
asimtricamente, es decir, se origina en una ubicacin de superficie discreta, aunque tambin se han
encontrado secciones en las que las invaginaciones se originan a partir de dos posiciones opuestas.
Poco despus del inicio de la divisin, nuevos parches de la capa S son visibles en la superficie
exoplasmtica de la membrana de injerto.
La divisin prosigue ms a travs de la fusin de membrana y la formacin de cubiertas de capa S
completas en los dos polos celulares. La antigua capa S persiste durante todo el proceso de divisin,
eventualmente interconectando dos clulas completamente separadas; en ninguna etapa de la
divisin celular est la membrana plasmtica desnuda expuesta al medio ambiente. Este modo de
divisin es claramente distinto de la formacin de septo como se conoce de las eubacterias.
Una mirada ms cercana a la capa S revela una estructura sin precedentes en su disposicin masiva,
casi filiforme, de masa. El retculo p6 tiene una constante de retcula inusualmente grande de 32,8
0,7 nm. Las micrografas de los cilindros de capa S aislados sombreados muestran una superficie
exoplasmtica lisa y una superficie plasmtica rugosa (Figura 2d). Las reconstrucciones de relieve en
superficie de la superficie plasmtica (Figura 2c) muestran una protrusin prominente centrada en
el eje de 6 ejes con brazos radiales que se unen para conectar hexmeros vecinos en la superficie
cerca del eje de 3 plegados. No se puede esperar que la reconstruccin del relieve represente la
dimensin de la protrusin en el eje de 6 veces correctamente, porque una caracterstica que se
extiende 30 nm en la direccin z (como lo sugieren las micrografas de las secciones delgadas y las
preparaciones fracturadas por congelacin) es propenso a colapsar en el curso del secado al aire. La
liofilizacin, que en principio debera proporcionar una mejor conservacin de la estructura
(Wildhaber et al., 1985), fue en gran medida un fracaso debido a que los cilindros de capa S retenan
su curvatura y, por consiguiente, no se adheran a la pelcula de soporte.
Las reconstrucciones tridimensionales de una serie de las muestras negativamente teidas dan una
visin ms detallada de la organizacin molecular de la capa S. La resolucin es de aproximadamente
2 nm segn el criterio de funcin de correlacin radial, y es casi isotrpica debido a la disponibilidad
de datos de ngulo de inclinacin alto (ver Materiales y Mtodos). La figura 3 muestra cortes
horizontales a travs de la estructura, partiendo de la superficie exoplasmtica (a) y continuando
hacia el interior con un espaciado equidistante de 0,65 nm. Por lo tanto, las nueve rebanadas
representadas en la figura 3 cubren slo una "profundidad" de 6 nm; una representacin completa
de la estructura requerira otros 30 cortes todos congruentes con la Figura 3i. La orientacin de la
capa sobre la rejilla, tal como se deduce de la desviacin y del patrn de acumulacin de manchas, es
tal que la superficie externa (exoplasmtica) descansa sobre la pelcula de carbono; capas en la
orientacin opuesta tienden a mostrar una preservacin ms pobre de la estructura. Es evidente a
partir de la reconstruccin que el cuerpo principal de la capa S tiene un espesor de slo 3 - 4 nm. En
la superficie exterior, la mayor parte de la masa se encuentra cerca del eje de 3 plegados, rodeando
una amplia abertura en forma de crter alrededor del eje de 6 plegados. Aproximadamente 2,5 nm
por debajo del nivel de superficie exterior (Figura 3d), la protena adopta la forma de un tringulo un
tanto sesgado con sus esquinas dirigidas hacia el eje de 6 plegados. Una o dos rebanadas ms abajo
(Figura 3e, f), los monmeros toman una curva aguda de 90 fuera del plano de la capa. Seis barras
densas diferentes ahora encierran un agujero central manchado, ~ 5 nm de ancho (Figura 3f). Se
funden en una estructura de anillo continuo (Figura 3g) y el agujero central eventualmente
desaparece (Figura 3h, i). La protrusin aparece ahora como un pilar slido, con un dimetro
aparente de 8 nm. De nuevo, las dimensiones y los detalles estructurales como el poro y su
continuacin en la direccin z no pueden considerarse concluyentes, ya que es poco probable que
una caracterstica que sobresalga de 25 - 30 nm en la direccin z permanezca sin distorsin en la
prueba de la preparacin; incluso las fluctuaciones relativamente pequeas en torno a una posicin
ideal implicarn inevitablemente borrosidad. Las vistas (Figura 4) creadas por el sombreado
superficial transmiten una impresin visual de la organizacin espacial global de la capa superficial
de T. tenax. Se ha utilizado una pila de 64 rebanadas separadas 0,3 nm para producir la figura 4a, b;
obviamente esta pila no puede contener la estructura completa y por tanto las protrusiones estn
truncadas. La capa misma aparece como una red filamentosa bastante complicada con la mayor parte
de la masa acumulada alrededor el eje de 3 y 6 plegados.
En la vista exterior (Figura 4a) que muestra algunas indicaciones de aplanamiento, una depresin es
visible en el eje de 6 plegados que probablemente representa el orificio de un poro que contina a lo
largo de la protrusin en forma de apilaciones (vase ms arriba). Las grandes aberturas en forma
de paralelogramo subdivididas por la masa que sobresale del eje de 3 plegados se encuentran en la
proximidad del eje de 2 plegados. La representacin de la vista puede ser algo engaosa en cuanto al
tamao de estas aberturas porque no es llenado de espacio. Ya que la mol. peso de la clula unitaria
y de los monmeros son desconocidos, no se puede ajustar el umbral para dar el volumen correcto,
ni se puede especificar la proporcin de este volumen representada por el modelo. A partir de mapas
de proyeccin se puede estimar que las aberturas ms grandes son probablemente de 7 x 2,5 nm;
esto significa que la capa S de T. tenax es una barrera eficaz para las protenas ms grandes (> 10 000
daltons) y permite la difusin libre de molculas de soluto ms pequeas.
La figura 4c muestra una vista con ngulo en direccin hacia interior de la capa; utilizando intervalos
de apilamiento mayores (0,65 nm) - a expensas de una apariencia menos lisa - se muestra la
estructura completa. Las protrusiones aparecen como estructuras en forma de apilamiento con una
altura aparente de 22 nm, que est prxima a la separacin entre la capa apropiada y la membrana
plasmtica.
La anchura de las envolventes aisladas, adsorbidas sobre una rejilla y manchadas negativamente,
vara slo dentro de un intervalo relativamente estrecho (Figura 5). Adems, los cilindros aplanados
muestran casi invariablemente un tipo de patrn de Moir. Esto implica que los vectores de base de
la capa S tienen una orientacin preferida con respecto al eje longitudinal de la clula. Las figuras 5b
y c muestran las posiciones moleculares mostradas separadamente para la capa superior e inferior
del cilindro aplanado (figura 5a); la asignacin correcta se demuestra por superposicin de los dos
mapas (Figura 5d) que produce el patrn de Moir de la imagen fuente (Figura 5a). Los mapas de las
posiciones de los picos (Figura 5b - e) se pueden ver como una representacin de red superficial que
visualiza la relacin geomtrica entre la rejilla superficial y el cuerpo celular. Los mapas revelan que
los vectores base de la red estn orientados casi pero no completamente normales al eje longitudinal
de la clula indicada por la lnea con punta de flecha. Constantemente encontramos un
desplazamiento de 3 - 4 . Observando el patrn de superposicin en la Figura 5d en una direccin
normal al eje longitudinal y con un ngulo de visualizacin, se evidencia que la capa S puede de hecho
ser concebida como una estructura helicoidal. Para facilitar esta manera de ver a la estructura, una
vista bajo un ngulo oblicuo ha sido creada rotando el patrn de superposicin (Figura 5d) en sentido
antihorario alrededor del eje longitudinal por 80. La hlice de la mano derecha puede describirse
como de dos cadenas con las cadenas individuales en paralelo; el paso helicoidal es de 58 nm y,
dependiendo del dimetro de la clula (o del radio de la hlice) se requieren 39 2,8 unidades de
clulas por vuelta.

Discusin
La arquitectura global de la capa S de T. tenax [con la excepcin de la especie estrechamente
relacionada T. neutrophilus (Messner et al., 1986)] aparece radicalmente diferente de todas las capas
eu - y arqueobacterias S descritas hasta ahora, incluyendo los de los relativamente muy relacionados
Sulfolobales (Deatherage et al., 1983). Las nicas estructuras que rememoran remotamente la capa
S de T. tenax son las jaulas de clatrinas (Vigers et al., 1986). La capa S de T. tenax se puede representar
como un techo, descansando sobre apilaciones, 25-30 nm por encima del nivel de la membrana
plasmtica. El techo es perforado y semipermeable; sin embargo, slo una estimacin muy cruda
puede derivarse del modelo tridimensional para el corte de la difusin libre a travs de l. Una faceta
de una barrera semipermeable, a cierta distancia de la membrana, es la retencin de protenas
endgenas ms grandes. Por tanto, el espacio intermedio puede ser visto como anlogo al espacio
periplsmico de las eubacterias gram - negativas, es decir, un compartimento celular que alberga un
consorcio distinto de enzimas catablicas y de transporte.
Los pilares sirven indudablemente para anclar la capa S a la membrana plasmtica, ya sea penetrando
con sus extremos distales en la bicapa o usando una protena unida a la membrana como un
mediador. Nuestros datos actuales no son concluyentes en cuanto a la estructura fina de los pilares;
su propensin a desviarse de un posicionamiento recto y erguido inevitablemente causar alguna
confusin. Los seis monmeros que (al menos) contribuyen a los pilares podran de hecho forman un
cilindro slido, pero tambin es una posibilidad distinta que los pilares sean tubos huecos sobre toda
su longitud y no slo en sus extremos prximos, como sugiere la reconstruccin.
Aunque en la presente resolucin es imposible establecer una delimitacin sin ambigedad de los
lmites de las subunidades, puede obtenerse informacin sobre la arquitectura molecular del modelo.
El monmero debe tener una forma inusualmente alargada, casi forma filiforme. La distancia desde
el extremo distal de los pilares al eje de 3 plegados a travs del giro cerca del eje de 6 plegados mide
40 nm. Probablemente el monmero contina ms en el apndice, subdividiendo la abertura en
forma de paralelogramo cerca del eje de 2 plegados; esto aumenta su longitud total a 52 nm. El nico
dominio globular de un tamao apreciable est en la articulacin cerca del eje de 3 plegados. El
volumen molecular incluido en nuestro modelo de la clula unitaria es 2.5 103 3 . Suponiendo
que seis monmeros estn contenidos en la clula unitaria y una densidad de protena de 1.3 3 ,
la relacin mol en peso del monmero es 325 000 daltons. Sin embargo, esto es muy probable que
sea una subestimacin; la experiencia con otras protenas nos ensea que el umbral es usualmente
demasiado restrictivo, es decir, los modelos utilizados para la presentacin de una estructura tienden
a incluir slo el 50 - 80% del volumen molecular verdadero (Baumeister y Engelhardt, 1987).
Se est trabajando en el uso de la determinacin de masa de STEM (Langmore y Wooley, 1975; Engel,
1982) y en el mapeo de masas (Engel et al., 1982) para obtener datos de mol en peso.

A pesar de la delicadeza de la red, el orden de largo alcance del enrejado de la capa S y su rigidez
mecnica son bastante notables y aptos para un mantenimiento de la forma y posiblemente tambin
toma un papel determinante en su forma. Los experimentos de liofilizacin y sombreado, que
muestran que las capas S desnudas aisladas conservan su forma cilndrica original, en lugar de
colapsar en fantasmas planos, como muchas otras capas S, pueden tomarse como una indicacin de
la capacidad de la capa S de T. tenax para conferir estabilidad a la clula.
Hasta el momento no existe un modelo fsico o marco conceptual disponible para integrar la
informacin sobre el ensamblaje de la estructura de la capa S en un modelo morfogentico coherente.
Los cristales de la superficie cerrada slo pueden crecer por "intususcepcin" de nuevas unidades, lo
que inevitablemente conduce a un alejamiento creciente de la cristalinidad perfecta (Caspar y Klug,
1962; Deatherage et al., 1983). Las revelaciones intrnsecas podran actuar como fuentes de
dislocaciones, la consecuencia natural del crecimiento intususceptivo (Harris y Scriven, 1970, 1971).
El proceso inverso, es decir, la transicin de capas superficiales multidominio a capas
monocristalinas podra ser racionalizado a lo largo de las lneas de modelos clsicos de
recristalizacin (Bragg y Nye, 1947). Tenemos cierta evidencia de que tal mecanismo prevalece entre
las eubacterias (Rasch et al., 1984). Con T. tenax, sin embargo, dislocaciones u otros tipos de defectos
de la red se han observado cerca de los polos celulares. Se encuentra un nmero distinto de
desviaciones de cua que se han visualizado elegantemente marcando la superficie celular con
ferritina policatinica (Messner et al., 1986). Nuestra nocin de la naturaleza helicoidal de la
envoltura celular T. tenax es, de alguna manera, trivial ya que cualquier red hexagonal en la superficie
del cilindro se puede describir en trminos de una hlice. Sin embargo, es til racionalizar el
mecanismo de crecimiento y el mantenimiento de la forma, y los parmetros helicoidales
encontrados son favorables a un modelo particular (Figura 6). Se considera que una revelacin cerca
de la cubierta polar es un punto de crecimiento o el inicio de la hlice. La sincronizacin del
crecimiento de los dos hilos de la hlice no plantea ningn problema, suponiendo que tienen un
comienzo comn. Esto podra lograrse mediante la insercin de unidades trimricas pre-
ensambladas en el punto de crecimiento, utilizando posiblemente la vieja capa S como molde para la
nueva, que se mueve entonces hacia delante, perpetuando as el cilindro de capa S. Este modelo, aun
cuando est de acuerdo con varios fenmenos observados, queda por probar. Se podra prever
experimentos que demuestren que la transicin entre la parte cilndrica y los casquetes polares es,
de hecho, la zona de crecimiento. Si se logra disociar la capa S en monmeros se podra tambin
estudiar la va de ensamblaje y buscar precursores oligomricos del tipo propuesto en nuestro
modelo.
Materiales y Mtodos
Las clulas de T. tenax Kra 1, DSM 2078 fueron amablemente proporcionadas por W. Zillig, Max -
Planck - Instituto de Bioqumica en Martinsried, RFA.

Aislamiento de las capas S

Las clulas se rompieron en un molino de clulas Vibrogen. Los sobres se purificaron en 40-80% de
sacarosa y se incubaron en dodecilsulfato sdico al 2% (SDS) durante 30 min a 95C. Para obtener
capas simples, los sobres fueron expuestos a ultrasonicacin durante 10 seg con una punta
sonificadora.

Preparacin para microscopa electrnica

Para el grabado por congelacin, las clulas se sedimentaron en una centrfuga, se congelaron entre
dos plaquetas de cobre en un cryo-jet (Balzers Union, Liechtenstein) fracturado en una unidad de
grabado congelado modificada BAF 360 (Balzers AG, Liechtenstein) a 105 y grabado durante 2
min. Los especmenes fueron unidireccionalmente sombreados con a un ngulo de
elevacin de 45.
Las capas aisladas se adsorbieron en pelculas de carbn tratadas por descarga de resplandor sobre
rejillas microscpicas y se tieron negativamente con fosfotungstato de sodio o se sombrearon con
o a un ngulo de elevacin de 30 en una unidad de
evaporacin de alto vaco BAE 080T (Balzers Union, Liechtenstein).

Microscopa electrnica y procesamiento de imgenes

La microscopa electrnica se realiz utilizando un Philips EM 420 equipado con un porta-muestras
de inclinacin ilimitada (Chalcroft y Davey, 1984). Para la serie de inclinacin 14 proyecciones se
registraron con un aumento de 30 000 x con incrementos de inclinacin disminuyendo en proporcin
al cos para asegurar intervalos de muestreo de rejilla uniformes (Saxton y Baumeister, 1984). Los
ngulos de inclinacin efectivos oscilaban entre 2,2 y - 76,4.
Las matrices de 1024 por 1024 pxeles fue un densitmetro con un tamao de paso de 20 m
(equivalente a 0,67 nm a nivel de espcimen). La imagen utilizada se realiz con el sistema del
proceso de SEMPER (Saxton et al., 1979) y el sistema EM (Hegerl y Altbauer, 1982). Las proyecciones
se sometieron a un promedio de correlacin (Saxton y Baumeister, 1982) y la reconstruccin
tridimensional se realiz utilizando el enfoque espacial hbrido real/espacio de Fourier (Saxton et
al., 1984). Un algoritmo de sombreado superficial (Saxton, 1985) permiti una visualizacin en
perspectiva de la estructura reconstruida.
Los promedios de capas unidireccionalmente sombreadas se sometieron a reconstruccin de relieve
superficial siguiendo el procedimiento descrito por Guckenberger (1985).

Agradecimientos
Agradecemos a W. Zillig (Max Planck - Instituto de Bioqumica, Martinsried, RFA) por proporcionar
las clulas y la lectura crtica del manuscrito, y a D. Studer (Mikrobiologisches Institut, ETH-Zurich,
Suiza) por la seccin delgada de las bacterias.