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DOSSIER

Techniques de lIngnieur
lexpertise technique et scientifique de rfrence

j2786
lectrophorse prparative

Par :
Hlne ROUX DE BALMANN
Charge de recherches

Victor SANCHEZ
Universit Paul-Sabatier, Toulouse, Laboratoire de gnie chimique, CNRS-UMR 55-03, Directeur de
recherches

Ce dossier fait partie de la base documentaire


Oprations unitaires - Extractions fluide/fluide et fluide/solide
dans le thme Oprations unitaires. Gnie de la raction chimique
et dans lunivers Procds chimie - bio - agro

Document dlivr le 04/07/2012


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lectrophorse prparative

par Hlne ROUX de BALMANN


Charge de recherches
et Victor SANCHEZ
Directeur de recherches
CNRS-UMR 55-03
Laboratoire de gnie chimique
Universit Paul-Sabatier, Toulouse

1. Phnomnes de transport ..................................................................... J 2 786 - 3


1.1 Mobilit lectrophortique ......................................................................... 3
1.2 Effet sparatif ............................................................................................... 3
1.3 Effets dispersifs............................................................................................ 3
1.3.1 lectro-osmose ................................................................................... 4
1.3.2 Convection .......................................................................................... 4
1.3.3 Diffusion .............................................................................................. 4
1.3.4 lectrohydrodynamique..................................................................... 4
1.3.5 Transfert thermique ............................................................................ 4
2. De lanalytique au prparatif :
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problme de changement dchelle.................................................... 5


3. Procds prparatifs directement
drivs des techniques analytiques.................................................... 5
3.1 lectrophorse sur gel avec rcupration des produits........................... 5
3.1.1 Principe................................................................................................ 5
3.1.2 tape de sparation............................................................................ 5
3.1.3 Rcupration des produits................................................................. 6
3.2 lectrophorse capillaire (EC)..................................................................... 6
3.2.1 Principe................................................................................................ 6
3.2.2 Problmes lis au changement dchelle ......................................... 6
3.3 Autres procds........................................................................................... 6
3.3.1 lectrophorse en colonne ................................................................ 6
3.3.2 lectrophorse en lit granulaire horizontal ...................................... 6
4. Procds conus pour leur aspect prparatif.................................. 7
4.1 Principes gnraux de fonctionnement..................................................... 7
4.2 Problmes rencontrs ................................................................................. 7
4.3 Procds fonctionnant en rgime discontinu ........................................... 7
4.3.1 Procds de focalisation isolectrique (IEF) avec recyclage........... 7
4.3.2 Procds de focalisation isolectrique avec recirculation .............. 8
4.4 Procds fonctionnant en rgime continu ................................................ 9
4.4.1 lectrophorse de zone en coulement continu (EZEC) ................. 9
4.4.2 Focalisation isolectrique en coulement continu .......................... 9
3 - 1997

5. Domaines dapplication ......................................................................... 9


6. Perspectives de dveloppement.......................................................... 10
Pour en savoir plus........................................................................................... Doc. J 2 786
J 2 786

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LECTROPHORSE PRPARATIVE _________________________________________________________________________________________________________

e principe de llectrophorse, qui est la migration de substances charges


L sous linfluence dun champ lectrique continu, a t dcrit il y a un sicle
par Kohlrausch. Il a fallu attendre jusquen 1937 pour que Tiselius montre luti-
lit de la mthode frontire mobile pour sparer les protines du srum
sanguin. lheure actuelle, llectrophorse est devenue la mthode analytique
la plus employe dans le domaine de la biologie en raison de ses performances
et de sa relative simplicit de mise en uvre. Elle a contribu, ainsi dailleurs
que la chromatographie, de grands progrs raliss en biochimie et en bio-
technologie, grce la dtection et lanalyse des diffrents constituants dun
milieu biologique complexe. L o Tiselius sparait 5 constituants, plus de
1 000 peuvent maintenant tre identifis par lectrophorse bidimensionnelle
sur gel.
Ces progrs considrables ont t accomplis grce une avance scientifique
tant exprimentale que thorique, mais aussi grce une instrumentation de
plus en plus sophistique.
Les thories sur la mobilit lectrophortique, la migration et la dissociation
des lectrolytes ont t tendues tous les types dlectrophorse (lectro-
phorse de zone, focalisation isolectrique, isotachophorse...). Elles ont permis
de simuler le dplacement des produits. Les effets dispersifs, inhrents tout
procd de sparation, ont t mieux perus et pris en compte dans les quations
de transport. Un effet important, llectrohydrodynamique, a mme t rcem-
ment dcouvert.
Au plan exprimental, des matriaux de plus en plus performants, utiliss
pour constituer des gels ou pour revtir les parois des chambres dlectro-
phorse, ont permis de limiter ladsorption et llectro-osmose, et damliorer
leur dure de vie. De nouvelles mthodes ont t proposes pour caractriser
les produits, les dsorber et les recueillir. De nouveaux procds ont t conus
et dvelopps, comme llectrophorse capillaire qui connat actuellement un
essor important.
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Trs performante dans le domaine de lanalyse, llectrophorse a donc tout


naturellement suscit un intrt en tant que mthode prparative. Comment pas-
ser de lanalyse de quelques nanogrammes ou microgrammes la production
de quelques milligrammes, voire de grammes, tout en conservant la mme
finesse de sparation ? Pour apporter des rponses cette question, des cher-
cheurs ont essay dextrapoler et damliorer les procds existant dans le
domaine analytique ou de dvelopper de nouvelles techniques plus spcialement
adaptes aux domaines prparatifs.

Notations et Symboles Notations et Symboles

Symbole Unit Dsignation Symbole Unit Dsignation

a m rayon de lion, double couche P W puissance


comprise
Q C charge lectrique
d m paisseur
t s temps
C kg m3 concentration
R,r m rayons
D m2 s1 coefficient de diffusion
T K temprature
e C charge dun proton (1,6 1019)
u m2 V1 s1 mobilit
E V m1 champ lectrique
V V diffrence de potentiel
I A intensit du courant
v m s1 vitesse
K0 W K1 m1 conductivit thermique
Zi ....................... valence de lion i
k J K1 constance de Boltzmann
(1,38 1023) x,y,z ....................... coordonnes despace
ni ...................... nombre de molcules de lion i C V1 m1 permittivit

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Cette charge peut tre diffrente de celle de lion lui-mme, telle


Notations et Symboles quelle peut tre obtenue par exemple par titration. La mobilit est
alors donne par les relations :
Symbole Unit Dsignation
0
u i = ----------- f ( a ) (5)
0 C V1 m1 permittivit du vide 6

1 m paisseur de Debye
Q
1 m1 u i = ------------------------------------- f ( a ) (6)
conductivit lectrique 6 a ( 1 + a )
Pa s viscosit
o f (a ) est la fonction de Henry [5], qui varie entre 1 pour des
rsistance lectrique forces ioniques faibles et 1,5 pour des forces ioniques leves. La
V potentiel zta ou potentiel relation (6) montre que la mobilit dpend du rayon, de la charge,
lectrocintique de la force ionique de la solution et des ions prsents, ainsi que de
...................... taux de vide la viscosit, donc de la temprature. Pour de faibles carts de
temprature T = T 2 T 1, la variation de mobilit peut tre repr-
V potentiel sente par une relation du type :
uT 2 = uT1 (1 + T ) (7)
avec = 0,02 (K1) pour les solutions aqueuses.
1. Phnomnes de transport La mobilit dune macromolcule est caractristique de celle-ci.
Les macromolcules biologiques sont des composs amphotres
dont la charge varie avec le pH et il existe un pH, appel point iso-
lectrique (pI), pour lequel la charge est globalement nulle. Cette
Se reporter au tableau de symboles ci-contre pour la dfini- particularit a t exploite pour mettre au point des techniques de
tion des symboles et leurs units. purification de molcules biologiques. Dans un milieu pH constant,
elles sont spares suivant leur charge : cest llectrophorse de
zone. Dans un gradient de pH, la sparation sopre en fonction
du pI : cest la focalisation isolectrique.
1.1 Mobilit lectrophortique

Considrons un ion sphrique i de rayon ri immerg dans un 1.2 Effet sparatif


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volume infini de liquide. Cet ion, qui possde une charge de sur-
face Qi donne naissance une distribution symtrique de charges
dans le liquide. En linarisant lquation de Poisson-Boltzmann, Le systme daxes utilis est schmatis sur la figure 1. Consi-
Debye et Hckel ont calcul la distribution de potentiel en tout drons un chantillon de largeur caractristique  c contenant deux
point extrieur lion, situ une distance x [3] [4] : espces de mobilits u1 et u2 . Aprs un temps t pass dans un champ
lectrique E, la distance Y sparant les deux espces sera :
(x ) = (ri )exp( x ) (1)
2 Y = uEt = (u 2 u1) Et (8)
4e
= ----------------- n i z i
2 2
avec (2)
0 kT i
Les deux espces seront totalement spares (rsolues) si
Y >  c .
Dans un champ lectrique E, lion charg se dplace et sa vitesse
tend vers une limite vi pour laquelle la somme des forces coulom-
biennes et de frottement est nulle. La mobilit ui de lion est alors
dfinie par la relation : 1.3 Effets dispersifs
v
u i = -----i (3)
E Conjointement la migration, qui est leffet sparatif, de nombreux
phnomnes dispersifs apparaissent, la plupart tant lis lappli-
Lorsquun ion sphrique se dplace dans un liquide, on considre cation mme du champ lectrique. Pour obtenir des sparations effi-
en gnral quune fine couche adjacente de liquide (couche de Stern), caces, il convient den matriser et den minimiser les effets.
est fixe sur lui de manire telle que le rayon effectif de lion en mou-
vement est alors a > r. Le potentiel (a ) la surface de contact avec
le solvant est appel potentiel zta ou potentiel lectrocintique .
Il est reli la charge Q de la couche liquide par la relation :
Qi = 4 0 a (1 + a ) (4)

Figure 1 Dfinition des axes utiliss dans le paragraphe 2

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LECTROPHORSE PRPARATIVE _________________________________________________________________________________________________________

1.3.1 lectro-osmose 1.3.3 Diffusion

Llectro-osmose peut tre dcrite comme le mouvement dun Quel que soit le milieu utilis, il existe un gradient de concentration
liquide par rapport des charges fixes de surface. Dans la double entre lchantillon et le tampon, qui peut tre lorigine du phno-
couche, llectrolyte a une charge globale de signe oppos aux mne de diffusion. En focalisation isolectrique sur gel, la diffusion
charges de surface. Sous leffet du champ lectrique, ce liquide se est compense par la migration lectrophortique qui tend rame-
dplace en entranant des molcules deau. La vitesse lectro-osmo- ner le produit vers son pI. En lectrophorse de zone sur gel, leffet
tique vos est dfinie par : de la diffusion se traduit par un largissement des bandes qui dpend
des temps de migration et des concentrations des produits. En veine
u os liquide, la diffusion tale lchantillon qui se dilue. La concentration
vos = --------
- (9)
E une distance r du centre est donne par :

  + erf  ---------------
2 Dt 
la valeur de la mobilit lectro-osmotique uos dpendant du poten- R0 r R0 + r
tiel zta selon : C ( r ) = C 0 erf ---------------- - (15)
2 Dt


u os = ----------- (10) y
4 2 2
avec erf ( y ) = -------- exp ( x ) dx
0
Linfluence de llectro-osmose sur la sparation lectropho-
rtique dpend du milieu utilis pour effectuer la sparation. et C0 concentration linstant initial t = 0
Selon la loi dEinstein, ltalement est donn par la relation :
Cas du gel : la vitesse lectro-osmotique est constante sur toute
la section. La vitesse de dplacement dun ion i est alors :
X i = 4 2Dt (16)
vti = (ui + uos ) E (11)

Ainsi, si le gel est homogne, llectro-osmose provoque un dca-


lage de la position des bandes, mais ne modifie pas la distance de 1.3.4 lectrohydrodynamique
sparation entre deux bandes.
Ce phnomne est li la diffrence de conductivit entre lchan-
Cas de membranes poreuses : si le transfert est effectu travers tillon et le milieu de sparation [9]. La variation locale des lignes de
des membranes poreuses, llectro-osmose joue un rle important champ au voisinage de lchantillon provoque une dformation de
[6]. En effet, selon le sens respectif des vitesses lectrophortique et la section de celui-ci. En gel, la viscosit tant trs leve, ce ph-
lectro-osmotique, le transport peut tre acclr ou diminu, voire nomne est ngligeable. En veine liquide, dans le cas le plus courant
annul. o la conductivit de lchantillon est suprieure celle du tampon,
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Cas de la veine liquide : lorsque llectrophorse est ralise au un signal circulaire de rayon initial R stale sous la forme dune
sein dun coulement de liquide, dans une cellule dpaisseur 2d bande parallle au champ dont la longueur est donne par la
close, dans un plan orthogonal lcoulement, la vitesse lectro- relation [10] :
osmotique la cote z est donne par la relation [7] : 2
X i = 2R 0 1 + ----------------------------------------- g (S )E t (17)
2 12 0 ( i + e )
 
1 z
v x (z ) = --- v os 3 -------
-1 (12)
2 d
2 2
(S + S 2)
avec - et S = ------i
g (S ) = -------------------------------
(S + 1)
2 e

1.3.2 Convection
1.3.5 Transfert thermique
Dans les cellules coulement forc, la vitesse du liquide suit un
profil de Poiseuille : La puissance P ncessaire llectrophorse est :
2 P = V I = I2 (18)

d
z

v x (z ) = v max 1 ------2-
 avec v max = v x (z = 0 ) (13)
Lnergie lectrique fournie au systme est partiellement dgra-
de en chaleur par effet Joule, la puissance dissipe par unit de
En combinant les quations (12) et (13), on peut calculer ltale- volume PV (en W/m3) tant donne par la relation :
ment Xi du pic despce i de rayon initial R0 la sortie dune cellule
de longueur L [8] : PV = E 2 (19)

2 2 1 o est le taux de vide du milieu.


LE R 0
  
R0
X i = -------------- -------- 1 -------- u ( x ) + u os + R 0 (14) La temprature T0 aux parois du systme peut tre calcule par
v max d 2 d
2
intgration de lquation de transfert :

Cette dispersion est connue sous le nom d effet croissant [7] 2


T 2
puisquelle conduit, partir dun chantillon de contour circulaire, K 0 ---------2- + E = 0 (20)
un signal en forme de croissant. Dans le cas de llectrophorse z
de zone, u (x ) est une constante et llargissement du pic dpend
donc directement de la valeur de u ( x ) + u os . Dans le cas de la foca- avec K0 conductivit thermique (en W m1 K1).
lisation isolectrique, u varie avec x puisque le pH varie lui-mme Puisque la mobilit dpend de la temprature et pour maintenir
avec x. des conditions de migration homognes, la chaleur dissipe est
vacue grce un systme de rfrigration. Cependant, quel que

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soit lappareillage utilis, il existe toujours un gradient thermique


suivant lpaisseur du milieu, la temprature au centre (Tm) tant 3. Procds prparatifs
relie celle la paroi, suppose constante (T0 ), par lquation : directement drivs
E d
T m = T 0 + -----------------------
2 2
(21)
des techniques analytiques
2K 0
3.1 lectrophorse sur gel avec rcupration
Cette relation montre que le gradient de temprature varie comme
le carr de la dimension du systme. En veine liquide, ce gradient, des produits
sil devient trop important par rapport la vitesse dcoulement,
cest--dire pour des champs lectriques levs, peut provoquer une 3.1.1 Principe
convection naturelle qui dstabilise le systme [11].
Lexcellente rsolution et la relative simplicit de mise en uvre
de llectrophorse sur gel des fins danalyse a naturellement
conduit essayer de lutiliser en tant que mthode prparative. Le
2. De lanalytique au prparatif : principe en est simple (figure 2). Il consiste raliser un processus
comprenant une sparation (lectrophorse) et une rcupration
problme de changement des produits spars (lution).

dchelle
3.1.2 tape de sparation
La dfinition de llectrophorse prparative et la frontire de Plusieurs modes de sparation peuvent tre mis en uvre. Les
celle-ci avec le domaine analytique sont trs dlicates tablir. Des deux principaux sont llectrophorse de zone [12], dans laquelle les
expriences qui taient il y a quelques dcennies considres constituants sont spars suivant leur mobilit lectrophortique, et
comme relevant de lanalyse peuvent maintenant parfois tre qua- la focalisation isolectrique IEF [13] dans laquelle les produits sont
lifies de prparatives , ds lors que les produits spars sont spars suivant leur point isolectrique pI. La premire ide a t
rcuprs pour tre utiliss lors doprations ultrieures. En effet, naturellement demployer pour cette tape les gels et les solutions
dnormes progrs ont rendu la dtection de plus en plus sensible, tampons qui fournissent les meilleurs rsultats lchelle
la rcupration de plus en plus efficace, ce qui permet des dosages analytique : gels de polyacrylamide PAA et dagarose, avec une pr-
quantitatifs. Ainsi, de trs faibles quantits (de lordre du micro- frence pour le PAA qui offre, dans bien des cas, une meilleure rso-
gramme) sont suffisantes pour dterminer la squence dune lution puisquil limite llectro-osmose. Il permet, par ailleurs, de
protine. La cristallisation des protines ou des substances, ne prparer des gels de diffrentes porosits donnant un effet tamis.
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requiert galement que quelques milligrammes. Enfin, des essais En lectrophorse de zone, la sparation est alors le rsultat dun
plus spcifiquement lis lactivit biologique peuvent tre raliss couplage entre la migration lectrophortique et leffet tamis (fonc-
avec des quantits de produit infrieures au gramme. Pour toutes tion de la taille des molcules) : cette technique est connue sous le
ces applications, llectrophorse est un excellent outil de purifica- nom de PAGE (de langlais Poly Acrylamide Gel Electrophoresis ).
tion. Cependant, le passage de lanalyse la prparation, quelle que On peut galement fabriquer des gels prsentant un gradient de
soit lchelle de quantit concerne, pose des problmes divers porosit (gradient PAGE). Enfin, cette lectrophorse peut tre ra-
niveaux. Il faut en effet pouvoir dune part augmenter les quantits lise en conditions dnaturantes, lagent dnaturant le plus cou-
de produits spars et dautre part les rcuprer, ce qui peut tre ramment employ tant le SDS (dodcylsulfate de sodium) : on parle
fait, selon les cas, en une ou plusieurs oprations. alors de SDS-PAGE. Dans cette variante, tous les complexes pro-
Pour augmenter les quantits traites, on peut soit accrotre les tine/SDS ont la mme mobilit en phase liquide et la sparation
dimensions du systme soit travailler avec des chantillons plus est due essentiellement leffet tamis. On peut alors, par compa-
concentrs. Dans le premier cas, le principal problme rside dans raison avec des molcules talons, dterminer la taille des consti-
le contrle de leffet Joule. En effet, lquation (21) montre que le tuants contenus dans un chantillon.
gradient thermique au sein dun gel, par exemple, varie sensiblement
avec son paisseur dont laugmentation peut donc provoquer des
distorsions des bandes en faisant varier la mobilit. La rcupration
des produits devient alors trs dlicate et la probabilit de
contamination est accrue, bien que llectro-lution soit de plus en
plus performante. Dans le cas de lIEF (cf. 3.1.2), lobtention de gra-
dients de pH linaires est de plus en plus difficile lorsque la dimen-
sion des gels augmente.
De mme, laugmentation de la concentration conduit un risque
accru de prcipitation, surtout en IEF, et un accroissement de la
diffusion [quations (15) et (16)], qui provoque galement un tale-
ment des bandes. Llectrophorse, telle quelle est conduite des
fins purement analytiques, ne peut donc pas tre directement extra-
pole de faon satisfaisante pour traiter des quantits excdant le
milligramme. Des techniques particulires, dans lesquelles la spa-
ration est effectue en veine liquide, ont donc t envisages pour
produire des constituants hautement purifis. De nombreux appa-
reils ont ainsi t imagins, le principal problme rsidant alors dans
la minimisation des consquences de leffet Joule, de la sdimen-
tation et de la convection naturelle. Ainsi, comme dans le cas des
gels, les dimensions des systmes ne sont pas extrapolables
linfini. Des quantits de produits trs purs, pouvant atteindre
quelques milligrammes par heure en rgime continu ou quelques
grammes en rgime discontinu, peuvent cependant tre obtenues.
Figure 2 lectrophorse sur gel avec rcupration des produits

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LECTROPHORSE PRPARATIVE _________________________________________________________________________________________________________

LIEF, quant elle, ncessite la formation au sein du gel dun gra- pour luer des constituants. La matrise et le contrle des phno-
dient de pH. LIEF classique utilise pour cela des solutions mnes dispersifs mis en jeu ont permis de mettre au point des outils
dampholytes contenant un grand nombre despces amphotres trs efficaces sur le plan analytique. Cette technique a connu un dve-
de diffrents pI. Plus rcemment, une autre mthode a t pro- loppement trs rapide, tant en ce qui concerne linstrumentation que
pose, qui consiste incorporer dans le gel, avant sa polymrisa- les applications, et tous les types dlectrophorse peuvent main-
tion, des immobilines qui sont alors fixes sur lui par des liaisons tenant tre raliss [18]. Les quantits de produits mises en jeu
covalentes. Cette technique est appele IEF en gradient de pH nexcdent pas lordre du nanogramme et les capillaires ont des dia-
immobilis. Elle offre lavantage de saffranchir de lutilisation des mtres variant entre 10 et 100 m. Certains appareils commerciaux
ampholytes dont llimination nest pas toujours aise. disposent dun systme de collecte (voir [Doc. J 2 786]). Cette col-
lissue de ltape de sparation, le gel est rvl pour localiser lecte peut tre effectue soit en phase liquide, ce qui provoque une
la position des produits. Suivant le matriau du gel et les produits dilution dun facteur denviron 100 1 000, soit directement sur un
concerns, diffrentes techniques sont disponibles (coloration au support (membrane), technique qui sapparente alors au blotting.
bleu de Coomassie, au nitrate dargent...) [14]. On peut alors passer
ltape suivante.
3.2.2 Problmes lis au changement dchelle

3.1.3 Rcupration des produits Laugmentation des quantits traites pose des problmes
dordres divers. Sur le plan de linstrumentation, il faut concevoir
Deux types de mthodes existent : llution et le transfert, plus et raliser un systme de collecte permettant de rcuprer les
connu sous le terme anglais de blotting. produits sans perturber la sparation. En outre, laugmentation des
dimensions du capillaire ou de la concentration des chantillons
Llution permet de rcuprer les produits en phase liquide au sein accentue les gradients thermiques dus leffet Joule ainsi que la
dune solution [15] [16]. Elle peut tre effectue selon deux diffusion, ce qui dtriore sensiblement la rsolution. Pour toutes
processus : la diffusion ou llectro-lution. Dans llution par diffu- ces raisons, lEC en est encore ses balbutiements en tant que tech-
sion, la pice de gel contenant le produit rcuprer est place, soit nique micro-prparative. Il semble peu probable quelle puisse deve-
en ltat soit aprs broyage, dans une solution saline, le plus souvent nir un jour, du moins dans sa conception actuelle, une relle
dans une petite colonne. Le processus est trs lent et a un faible ren- technique dlectrophorse prparative.
dement. En outre, le produit obtenu est trs dilu et contient des
contaminants provenant de relargages des matriaux constitutifs
des gels ou des solutions. Llectro-lution est donc prfre dans la
plupart des cas. Elle permet en effet dacclrer llution grce luti-
3.3 Autres procds
lisation dun champ lectrique. Diffrents matriels sont disponibles.
Dans certains cas, plusieurs morceaux de gel peuvent tre lus De nombreux autres dispositifs ont t dcrits dans la littrature.
simultanment. Citons simplement deux exemples. Le premier uti- Il est difficile, voire irraliste, den dresser une liste exhaustive. Les
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lise un matriel particulier : le gel est plac dans un tube en verre exemples cits ici ont t, ou sont encore, parmi les plus utiliss.
comportant sa base un fritt et une capsule revtue dune mem-
brane de dialyse. Les produits lus par lectrophorse travers le
fritt sont collects dans la capsule, dont le volume est de 500 L 3.3.1 lectrophorse en colonne
environ. Le deuxime type de systme utilise un matriel classique
dlectrophorse sur gel horizontal : les morceaux de gel sont placs La sparation est effectue dans un espace annulaire dlimit par
en sandwich entre deux membranes permables. Les produits sont deux cylindres coaxiaux (figure 3). Cet espace contient un garnis-
lus par un champ lectrique travers la membrane et rcuprs sage qui dpend du type dlectrophorse choisi :
dans un compartiment lui-mme clos par une membrane de faible gel de PAA pour llectrophorse PAGE ;
porosit impermable aux produits. liquide visqueux pour lIEF en gradient ;
Le transfert (ou blotting ) une autre technique, trs couramment ou milieu poreux pour les deux cas.
employe [16] [17], mrite dtre mentionne, bien quelle ne per- La stabilit thermique du systme, qui est un point crucial, est
mette pas rellement de rcuprer les produits. Elle consiste les assure par la circulation dun fluide rfrigr la fois dans le
transfrer lectrophortiquement du gel vers un autre support dans cylindre interne et dans une double enveloppe. Sous leffet du
lequel le profil lectrophortique est prserv et les molcules sont champ lectrique, les produits se sparent en donnant naissance
plus facilement accessibles et plus concentres pour ragir plus sp- des anneaux situs diffrentes hauteurs dans la colonne.
cifiquement avec divers produits. Diffrents types de supports sont Llution est ralise soit en continu (au cours de llectrophorse),
utiliss comme des membranes en nitrocellulose, en polyamide ou soit en discontinu (une fois llectrophorse termine) grce une
en tissu de fibres de verre. Cette mthode permet galement de rena- pompe, la valeur du dbit dlution tant dterminante. En continu,
turer les protines pour quelles retrouvent leurs proprits spci- celui-ci doit tre ajust en fonction des vitesses de migration des
fiques. Lquipement, de technologie simple, est commercialis par produits. En discontinu, une valeur trop faible peut provoquer une
divers constructeurs (voir [Doc. J 2 786]) qui proposent deux types diffusion et donc un recouvrement des anneaux. Le problme
de systmes dlectrotransfert : principal rencontr dans ce type dappareillage est li une ven-
soit en phase liquide ; tuelle prsence de particules solides qui peuvent modifier les cou-
soit semi-sec , ce dernier tant plus performant. lements, voire obstruer le garnissage. partir dune quantit allant
de 100 mg 1 g de produit, on peut obtenir jusqu quelques
dizaines de mg dune espce cible purifie, la dure de lopration
tant denviron 15 20 heures.
3.2 lectrophorse capillaire (EC)
3.2.1 Principe 3.3.2 lectrophorse en lit granulaire horizontal
Bien que son principe soit connu depuis plus de 20 ans, llec- Il sagit l dune extrapolation de llectrophorse analytique sur
trophorse capillaire, dans sa conception actuelle, est une technique gel. Dans cette mthode, surtout utilise en IEF, la sparation est
rcente. Lide originale a t dutiliser lcoulement d effectue au sein dun matriau granulaire (gel de chromatographie)
llectro-osmose dans des tubes capillaires de diamtre trs faible prsentant une faible lectro-osmose. Des lits, dont la taille peut

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temprature parfaitement uniforme [voir quation (21)]. Par ailleurs,


la prsence des membranes dlimitant la chambre de sparation des
compartiments dlectrodes modifie localement le transport des ions
et donc leur concentration. Les conditions de fonctionnement
doivent donc imprativement tre choisies, en relation avec les
dimensions de lappareillage, afin dassurer une bonne stabilit de
lcoulement. De la mme faon, les dimensions de lappareil ne sont
pas extrapolables linfini [19] [20].

4.3 Procds fonctionnant


en rgime discontinu
La focalisation isolectrique est un processus lent qui volue vers
un tat stationnaire. Des temps de sjour dans le champ lectrique
Figure 3 lectrophorse en colonne avec lution en continu assez levs sont ncessaires pour atteindre la focalisation. Pour
focaliser les produits en un seul passage dans la chambre de spa-
ration, il faut donc utiliser des vitesses dcoulement trs faibles,
atteindre (en cm) 20 20 1, peuvent tre utiliss avec un systme
pour lesquelles la stabilit hydrodynamique nest pas toujours satis-
de refroidissement adapt. Les ampholytes sont incorpors au gel
faisante. Diffrents modes de fonctionnement ont t proposs pour
avant son coulage. Lchantillon peut tre introduit de diffrentes
accrotre le temps de sjour tout en assurant une bonne stabilit des
faons : soit directement dans le gel avant son coulage, soit dans
coulements.
le lit avant ou aprs la formation du gradient de pH. Aprs la foca-
lisation, qui dure en moyenne 15 heures, un filtre en papier est appli-
qu sur le gel afin dabsorber une faible quantit de liquide. Ce papier
4.3.1 Procds de focalisation isolectrique (IEF)
est ensuite rvl pour localiser les produits. La portion du gel
contenant lespce cible est alors excise et lue. La capacit maxi- avec recyclage
male de ces systmes est denviron 5 10 mg de protines totales
par millilitre de gel, pour un rendement variant entre 30 et 80 %. 4.3.1.1 Gradient de pH impos par un liquide
Bier et ses collaborateurs [21] ont t les premiers proposer un
appareil, le RIEF (Recycling IsoElectric Focusing ) dIEF avec recy-
clage (figure 4). Le sparateur est une cellule paralllpipdique de
4. Procds conus 25 mL constitue de plusieurs compartiments (10) aliments en
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parallle et dlimits par des filtres en polyamide de 10 m de dia-


pour leur aspect prparatif mtre de pores. Ces filtres permettent dviter la convection entre
les compartiments tout en assurant le passage des espces qui
migrent dans le champ. Les lectrodes sont situes de part et dautre
4.1 Principes gnraux de fonctionnement des filtres dans des compartiments dlimits par des membranes
changeuses dions. la sortie de chaque canal, le liquide est collect
Pour permettre la sparation de quantits plus importantes de pro- dans un rservoir avant dtre recycl lentre du sparateur grce
duits, il sest avr ncessaire de dvelopper des procds de une pompe pristaltique multicanal. La chaleur dissipe par effet
conception diffrente de ceux existant lchelle de lanalyse. Lide Joule est vacue de deux faons : grce un changeur en ligne
a alors t retenue de raliser llectrophorse au sein dun liquide sur chaque canal, pour les plus faibles puissances, ou grce la cir-
en coulement. Outre laugmentation des quantits traites, ces pro- culation dun fluide froid dans des compartiments adjacents la cel-
cds permettent de rcuprer directement les produits en phase lule, pour les puissances plus leves, afin de limiter laugmentation
liquide sans recourir des techniques dlution. Plusieurs appareils de temprature qui pourrait dnaturer les produits. LIEF est ralise
ont t proposs, qui fonctionnent soit en rgime continu soit en en deux tapes. Dans un premier temps, une solution dampholytes
rgime discontinu, et qui prsentent certaines caractristiques est mise en circulation en prsence dun champ lectrique afin de
communes. Ils disposent tous dun systme de rfrigration plus ou former un gradient de pH. Lorsque ce gradient est tabli, on introduit
moins perfectionn selon les cas. Par ailleurs, les lectrodes sont lchantillon. Diffrents modes dintroduction peuvent tre utiliss.
disposes dans des compartiments spars de la chambre dlec- Lchantillon peut tre mlang dans chacun des rservoirs la solu-
trophorse par des membranes afin dviter que les gaz produits par tion dampholytes prsente. Une autre variante consiste introduire
lectrolyse ne viennent perturber lcoulement. lchantillon dans un seul rservoir, qui correspond celui dans
lequel le pI est le plus proche de celui de lespce cible focaliser.
Chaque mode a ses avantages et ses inconvnients. Le premier per-
4.2 Problmes rencontrs met de traiter une quantit plus importante de produit sans avoir
une connaissance prcise des pI des diffrents constituants, sous
Les vitesses de migration en phase liquide sont trs faibles, la rserve videmment quils se situent dans le domaine du gradient
mobilit dune espce tant de lordre de 108 m2 V 1 s1. Par de pH form. Cependant, le temps ncessaire pour atteindre la foca-
exemple, lcart de dplacement entre deux produits dont la diff- lisation est suprieur. Lvolution de la focalisation est suivie au cours
rence de mobilit vaut 3 109 m2 V 1 s1, soumise un champ du temps grce un photomtre situ sur le circuit liquide et lop-
lectrique de 3 300 V m1 pendant 200 s, est seulement de 2 mm. ration est arrte lorsque les produits ont atteint les compartiments
Pour pouvoir sparer des espces proches, il faut alors oprer avec dans lesquels le pH est proche de leur pI. Les produits purifis sont
des vitesses dcoulement trs faibles, de lordre de 1 mm/s, et/ou ensuite rcuprs par simple vidange des compartiments et des
des champs lectriques levs. Le problme rside donc, en premier rservoirs. Cet appareil permet de traiter jusqu 10 voire 100 mg/h
lieu, dans la stabilit hydrodynamique du systme. Cette stabilit de protine, la rsolution pouvant atteindre 0,2 units pH.
repose sur la minimisation des gradients locaux de masse volu- Cependant, si la prsence de filtres sparateurs augmente la sta-
mique, quils proviennent de variations de temprature ou de bilit hydrodynamique du systme, elle est galement lorigine
concentration. Or, quelle que soit lefficacit du systme de rfrig- dun certain nombre deffets secondaires qui peuvent perturber la
ration, il est impossible dobtenir en tout point du liquide une focalisation : discontinuit du gradient de pH (gradient en

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LECTROPHORSE PRPARATIVE _________________________________________________________________________________________________________

escalier ), apparition de flux lectro-osmotiques. Par ailleurs, le


traitement de molcules de masse molculaire leve ou de
cellules nest pas possible. Une autre gnration dappareils RF3
(cf. [Doc. J 2 786]), exempts de filtres sparateurs, a donc t
conue pour remdier ces inconvnients [22]. Dans ces types
dappareils, la stabilit hydrodynamique est assure par lutilisa-
tion dune chambre de plus faible paisseur, de 0,5 1 mm, et de
dbits de circulation levs, de 5 15 mL/min par canal. titre
dexemple dordre de grandeur, 100 mL de solution peuvent tre
focaliss en 90 120 min pour une puissance dissipe de 100
200 W et un volume collect de quelques millilitres.

4.3.1.2 Gradient de pH impos par des membranes


Faupel et Righetti [23] ont propos un systme dans lequel le spa-
rateur est constitu dun assemblage de compartiments de section
circulaire, dlimits par des membranes (figure 5). Loriginalit
rside dans le caractre amphotre de ces membranes, fabriques Figure 4 Chambre de focalisation isolectrique avec recyclage
en fixant sur un support en fibres de verre une matrice en PAA en gradient de pH impos par un liquide (daprs [21] [22])
comportant des sites acides et basiques leur confrant un point iso-
lectrique, procd de fabrication driv de celui utilis pour pr-
parer des gels gradient de pH immobilis (cf. 3.1.2). Dans
chaque compartiment, le gradient de pH est donc impos par les
pI des deux membranes qui le dlimitent, sans recourir lutilisation
dampholytes. Une pompe pristaltique permet de recycler le liquide
dans chaque compartiment. Le droulement de lopration est iden-
tique celui dcrit au paragraphe prcdent : mise en rgime, injec-
tion de lchantillon, focalisation, rcupration des produits
directement dans les rservoirs. Ici aussi, les deux modes dintro-
duction de lchantillon sont possibles, avec les mmes avantages
et les mmes inconvnients. Dans sa version commerciale (Isoprime,
cf. tableau A [Doc. J 2 786]), lappareil comprend jusqu
8 compartiments de 8 mL chacun, spars par des membranes de
4,7 cm de diamtre et connects des rservoirs de 30 mL. La rfri-
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gration est effectue par simple ventilation dair froid. Des quantits
variant de 50 300 mg de protine peuvent tre spares en 10 Figure 5 Chambre de focalisation isolectrique avec recyclage
20 heures. La dure et la rsolution de la sparation sont troitement en gradient de pH impos par des membranes (daprs [23])
lies au choix des membranes, dont les pI doivent encadrer ceux
des produits sparer. Un choix adquat peut permettre de sparer
en petites quantits (quelques milligrammes) les isoformes dune
mme protine. Outre le problme de la fabrication faon de
membranes isolectriques, qui est en grande partie rsolu lheure
actuelle, cet appareil prsente un certain nombre de limitations inh-
rentes son principe. Si la force ionique leve des membranes
limite les risques de prcipitation en leur sein, la prcipitation des
protines peut se produire dans les compartiments o la force
ionique est trs faible. Ainsi, des additifs traditionnellement
employs pour lIEF analytique (ure, dtergents non ioniques) sont
la plupart du temps ncessaires pour augmenter la solubilit des
produits. Tout comme dans le cas de lIEF en prsence dampholytes,
les additifs doivent alors tre limins du produit purifi, ce qui peut,
Figure 6 Chambre de focalisation isolectrique avec recirculation :
dans certains cas, conduire une dnaturation de la protine. Par
schma de principe du Rotofor (daprs [24])
ailleurs, le pouvoir tampon des membranes interdit lutilisation de
produits trop concentrs ou contenant des quantits trop leves
de sels, qui peuvent modifier les conditions de pH dans les
compartiments. lcoulement. De plus, le risque de bouchage des filtres par des par-
ticules en suspension se trouve ainsi rduit. La chambre de spa-
ration est remplie avec une solution dampholytes contenant
4.3.2 Procds de focalisation isolectrique lchantillon purifier. Sous leffet du champ lectrique, un gradient
avec recirculation de pH stablit et chaque constituant de lchantillon migre progres-
sivement vers le compartiment dont le pH est le plus proche de
son pI. Lorsque ltat stationnaire est atteint, les compartiments sont
Un appareil, considr comme driv du RIEF bien que fonction-
vidangs pour rcuprer des fractions de liquide qui renferment des
nant suivant un principe diffrent, a t propos par Biers [24]. La
produits de diffrents pI. Un appareil fonctionnant suivant ce prin-
chambre de sparation est constitue, dans ce cas, dun cylindre
cipe, le Rotofor (cf. [Doc. J 2 786]), est commercialis. La chambre
comprenant plusieurs compartiments dlimits par des filtres spa-
de sparation est compose de 20 compartiments dlimits par des
rateurs (figure 6). Pour la focalisation, ce cylindre est anim dun
filtres en polyester de 10 m dpaisseur. La rfrigration est assure
mouvement de rotation suivant son axe. Cette rotation et la prsence
au moyen dun cylindre en cramique, dispos le long de laxe central
de filtres assurent, lintrieur de chaque compartiment, une recir-
de la chambre. Deux appareils de taille diffrente sont disponibles :
culation du liquide qui permet dviter la sdimentation en stabilisant

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une chambre de 18 mL permettant de traiter des quantits allant de 4.4.1.2 Problmes spcifiques
1 g 1 mg et de rcuprer des fractions de 0,5 ml environ, et une
La premire condition satisfaire est davoir un pH constant sur
chambre de 60 mL permettant de traiter des quantits allant de 1 mg
la plus grande largeur de la chambre. La prsence des membranes
500 mg et de rcuprer des fractions de 3 mL environ. Le dispositif
changeuses dions qui dlimitent la chambre entrane un transport
de collecte comprend 20 tubes relis dune part chaque
slectif des ions. Selon la charge des ions prsents et la position
compartiment et dautre part un botier hermtique contenant
des membranes, on assiste soit un accroissement soit une dimi-
20 tubes de collecte. Une fois la focalisation termine, ce qui requiert
nution de la concentration ionique prs des membranes. Ce transfert
des dures de lordre de 4 6 h pour une puissance de lordre de
de matire est coupl un transfert de chaleur puisque la conduc-
12 W, la mise sous vide du botier de collecte permet de rcuprer
tivit locale varie avec la composition, de mme que la masse volu-
le liquide prsent dans chaque compartiment tout en minimisant les
mique et le pH. Ces couches dpendent de lintensit du courant et
risques de remlange. Ici encore, dans la plupart des cas, lutilisation
de la vitesse de convection. Leur paisseur peut atteindre 0,5 1 cm.
dadditifs est ncessaire pour accrotre la solubilit des produits. En
Le choix des tampons dlectrodes et de leur vitesse dcoulement
outre, la qualit de la sparation effectue est trs sensible ltat
est ici trs important puisquil conditionne la stabilit du pH et la
initial de lchantillon et certaines tapes pralables la focalisation,
concentration au niveau de la membrane. Le deuxime problme
telles que filtration, dcantation, dialyse..., sont souvent ncessaires.
concerne la stabilit hydrodynamique du systme. On peut laug-
menter en travaillant avec des chambres de faible paisseur [cf.
relation (21)] de lordre de 0,5 mm. Cependant, dans ce cas, linjec-
4.4 Procds fonctionnant en rgime continu tion ne peut tre faite que sur toute lpaisseur et certains autres
phnomnes dispersifs sont accentus [cf. quations (14) et (17)]. Par
contre, si lon utilise des chambres plus paisses (quelques milli-
Pour augmenter encore les quantits traites, des procds fonc- mtres), lchantillon peut tre inject dans une zone situe au centre
tionnant en rgime continu, cest--dire en boucle ouverte, ont t de la veine de telle faon que les phnomnes dispersifs sont rduits.
dvelopps. Dans ces procds, lchantillon purifier est aliment Cependant, en contrepartie de cette amlioration de la rsolution,
en continu dans une chambre de sparation lintrieur de laquelle les conditions de mise en uvre sont beaucoup plus dlicates afin
scoule un liquide. la sortie de la chambre, un dispositif de collecte de prserver la stabilit des coulements. De nombreux travaux
permet de rcuprer, en continu, des fractions de liquide contenant ddis ltude du fonctionnement de ces chambres ont t publis.
les diffrents constituants spars. Diffrentes gomtries dappa- Ils permettent, par exemple, dtudier la faisabilit dune sparation
reils ont t proposes, mais la chambre de sparation la plus cou- connaissant les caractristiques du mlange. La quantit de produit
ramment utilise est de gomtrie paralllpipdique. qui peut tre purifie dpend de lcart de mobilit entre les consti-
tuants. Pour des constituants assez proches, on peut atteindre
quelques milligrammes de produit trs pur par heure tout en main-
4.4.1 lectrophorse de zone en coulement continu tenant lactivit spcifique de celui-ci.
(EZEC)
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4.4.2 Focalisation isolectrique en coulement continu


4.4.1.1 Principe et domaines dapplication
Le principe de lEZEC, introduit par Hannig [25], est schmatis Le mme type de systme peut tre utilis pour raliser une foca-
sur la figure 7. La sparation est effectue dans un tampon pH lisation isolectrique en continu. Outre les problmes inventoris
constant au sein dune veine liquide de faible paisseur en coule- pour llectrophorse de zone, il faut, dans le cas de lIEF, obtenir
ment. Lchantillon purifier est inject en continu dans la veine un gradient de pH stable au cours du temps. La position choisie pour
liquide. Sous leffet dune diffrence de potentiel applique dans une lintroduction du produit est ici primordiale pour que celui-ci puisse
direction perpendiculaire lcoulement du liquide vecteur, chaque tre focalis dans un temps rduit, le temps de focalisation tant
molcule contenue dans lalimentation se dplace avec une vitesse limit par lhydrodynamique du systme.
directement proportionnelle sa mobilit lectrophortique. En sor-
Un appareil fonctionnant en coulement continu est commer-
tie de chambre, lcoulement est fractionn suivant la largeur. Un
cialis sous le nom Octopus CHIEF (voir [Doc. J 2 786].
collecteur permet ensuite de recueillir les fractions de liquide qui
contiennent les produits spars, la distance sparant deux produits
tant donne par la relation (8). Puisque la sparation est effectue
dans une veine liquide, ce procd est utilisable pour traiter tout pro-
duit, y compris des chantillons contenant des particules en sus- 5. Domaines dapplication
pension ou des cellules. Diffrents tampons peuvent tre employs
comme milieu de sparation.
Pour les procds drivs des techniques analytiques, les
domaines sont videmment ceux de lanalyse, la seule distinction
concernant la quantit de produit et la possibilit de le rcuprer.
Nota : pour plus de dtails, se reporter [28].

Pour ce qui est des procds spcifiquement conus pour leur


aspect prparatif, les domaines dutilisation sont beaucoup plus
vastes. En effet, la sparation ayant lieu en veine liquide, leur emploi
nest plus restreint aux seuls produits solubles dans le milieu.
Il est par consquent illusoire de dresser une liste exhaustive de
toutes les molcules ou particules qui peuvent tre concernes. On
peut par contre citer quelques exemples qui ont t rapports dans
la littrature. Il sagit des purifications de particules de latex, de
cellules vivantes (lymphocytes, globules, plaquettes du sang), de
vsicules ou de fragments membranaires, de bactries, de virus,
denzymes (-amylase, SuperOxydeDismutase ), de glycopeptides,
Figure 7 lectrophorse de zone en coulement continu de liposomes, danticorps monoclonaux ou dhormones de
croissance.

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6. Perspectives llectrophorse est, dans la plupart des cas, ralise au sein dun
liquide en coulement. Diffrents appareils ont t mis au point, dont
de dveloppement le fonctionnement est maintenant relativement bien matris sur le
plan thorique et exprimental. Ils permettent dobtenir des quan-
tits de lordre de 1 g de produit trs pur. Des quantits suprieures
peuvent tre obtenues, la puret tant alors lgrement moindre.
lchelle prparative et, a fortiori, industrielle, la chromato-
graphie a bien souvent largement pris le pas sur llectrophorse Les principaux avantages de ces mthodes lectrophortiques
pour la purification des peptides et des petites protines. La raison tiennent au fait que la dnaturation des produits est rduite au
majeure tient ce que la plupart des types de chromatographie sont minimum, que le rendement est trs lev et que certaines de ces
extrapolables dans une large proportion. Ainsi les techniques utili- mthodes peuvent tre employes aussi bien dans le domaine de
ses lchelle analytique peuvent tre employes des fins pr- la purification de produits en solution que de particules ou collodes
paratives en augmentant les dimensions de la colonne. Dans le cas en suspension. Ainsi, bien que ces procds soient relativement peu
de llectrophorse, au contraire, lextrapolation simple des tech- connus dans le domaine des biosparations, ils ont trs certainement
niques analytiques ne permet pas de dpasser, tout en conservant une place tenir ds lors quon ne les considre plus simplement
une rsolution leve, lchelle microprparative (de quelques comme des techniques concurrentes ou alternatives, mais comme
milligrammes en une dizaine dheures) cause de problmes inh- des outils capables dapporter des solutions des problmes diffi-
rents aux systmes utiliss. Des procds spcifiques, fonctionnant ciles rsoudre par des techniques plus classiques.
en rgime continu ou discontinu, ont donc t conus, dans lesquels
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P
O
U
lectrophorse prparative R

E
par Hlne ROUX de BALMANN
N
Charge de recherches
et Victor SANCHEZ
Directeur de recherches
CNRS-UMR 55-03 S
Laboratoire de gnie chimique
Universit Paul-Sabatier, Toulouse A
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Geigy Corp. USA Isoelectric focusing pro-
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sed particles. I. The equation of cataphoresis.
[14] MERRIL (C.R.). Detection of proteins sepa-
rated by electrophoresis dans :
CHRAMBACH (A.), DUNN (M.J.) et RADOLA
cess and a means for carrying out said
process. US Patent 4.971.670 du 20 nov. 1990
et GB Patent 87-28 289 du 3 dc. 1987.
U
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focusing : stabilization, segmentation and
S
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Continuous flow zone electrophoresis : a reso- Part III : Electrophoresis, p. 455-468, VCH (G.O.). Electrohydrodynamic distorsion of
lution criterion applied to the case of model Weinheim (1989). sample streams in continuous flow electro-
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electric field. Proc. Roy. Soc. London, 291, [18] KUHN (R.) et HOEFFSTETTER-KUHN (S.). conditions for preparative separation of pro-
p. 159-166 (1966). Capillary electrophoresis : principles and teins by continuous flow zone electro-
[10] ROUX de BALMANN (H.), BURGAUD (C.) et practice, Springler Verlag, Berlin Heidelberg phoresis. Bioseparation, 5, p. 125-139 (1995).
SANCHEZ (V.). Study of electrohydrodyna- (1993). [28] GAREIL (P.) et PELTRE (G.). lectrophorse.
mic phenomena during purification of pro- [19] SAVILLE (D.A.). The fluid mechanics of P 1 815, Doc. P 1 815, trait Analyse et carac-
Doc. J 2 786

teins by continuous flow electrophoresis. continuous flow electrophoresis in perspec- trisation, Techniques de lIngnieur,
oct. 1995.

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P LECTROPHORSE PRPARATIVE _________________________________________________________________________________________________________


O
U Fournisseurs
R Appareils commercialiss Pour chaque appareil, le constructeur dispose en gnral dun grand nombre
Divers appareils dont le principe et le fonctionnement ont t dcrits dans de fiches dapplication qui peuvent tre utiles pour orienter un choix en fonc-
les paragraphes prcdents sont disponibles sur le march. Le tableau A four- tion dun objectif de purification.
nit une liste non exhaustive des fournisseurs et des matriels quils proposent. (0)

E
N Tableau A Principaux fournisseurs dappareils commercialiss

lectrophorse
lectrophorse sur gel avec
Socit capillaire Autres appareils
avec collecte lution ou

S Beckman
transfert

Instruments
A France
Bio-Rad S.A.
X
X Rotofor

V (cf. [J 2 786] 4.3.2)


491 Prep Cell
(cf. [J 2 786] 3.3.1)

O Gibco BRL
Hoefer
X
IsoPrime
(cf. [J 2 786]
I Kontron Instruments
4.3.1.2)
RF3 (cf. [J 2 786]

R S.A.
Perkin Elmer S.A. X
4.3.1.1)

Pharmacia Biotech X
Sigma Aldrich
Chimie
P S.A.R.L. X
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Touzart et Matignon
S.A. X
L Waters S.A. X
Octopus CHIEF
U Weber GmbH (Dr)
(cf. [J 2 786] 4.4.2)

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P
O
U
lectrophorse prparative R

E
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[5] HENRY (D.C.). The cataphoresis of suspen- rated by electrophoresis dans : process. US Patent 4.971.670 du 20 nov. 1990
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osmosis at microporous membranes and the
determination of zeta potential. J. of Colloid
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from gels dans : DEUTSCHER (M.P.)
focusing : stabilization, segmentation and
rotation combined. US Patent 4.588.492
(1986).
U
[7]
and Interface Science, 97, p. 401-409 (1984).
STRICKLER (A.) et SACHS (T.). Focusing in
Methods in Enzymology, 182, p. 488-495, Aca-
demic Press, San Diego, CA (1990). [25] HANNIG (K.). Preparative electrophoresis
dans : BIER (M.). Electrophoresis : theory, S
continuous flow electrophoresis by electrical [16] JOHANSSON (K.E.). Protein recovery and methods and applications, vol. II, chap. 9,
control of cell wall zeta potential. Ann. N.Y., blotting techniques dans : JANSON (J.C.) et p. 423-465, Academic Press New York London
Acad. Sci., 209, p. 497-514 (1973). RYDEN (L.). Protein Purification : principles, (1967).
high resolution methods and applications,
[8] ROUX de BALMANN (H.) et SANCHEZ (V.). Part III : Electrophoresis, p. 455-468, VCH [26] RHODES (P.H.), SNYDER (R.S.) et ROBERTS
Continuous flow zone electrophoresis : a reso- Weinheim (1989). (G.O.). Electrohydrodynamic distorsion of
lution criterion applied to the case of model sample streams in continuous flow electro-
proteins. J. Chromatography, 594, p. 351-359 [17] GERSHONI (M.). Protein blotting dans : phoresis. Journal of Colloid and Interface
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[9] TAYLOR (G.I.). Studies in electrohydrodyna- p. 141-171, VCH Weinheim (1987). [27] DALENS (F.), ROUX de BALMANN (H.) et
mic-I-the circulation produced in a drop by an SANCHEZ (V.). Improved operating
electric field. Proc. Roy. Soc. London, 291, [18] KUHN (R.) et HOEFFSTETTER-KUHN (S.). conditions for preparative separation of pro-
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mic phenomena during purification of pro- [19] SAVILLE (D.A.). The fluid mechanics of P 1 815, Doc. P 1 815. ditions T.I. Techniques
teins by continuous flow electrophoresis. continuous flow electrophoresis in perspec- de lIngnieur, oct. 1995.

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O
U Fournisseurs
R Appareils commercialiss
Divers appareils dont le principe et le fonctionnement ont t dcrits dans Pour chaque appareil, le constructeur dispose en gnral dun grand nombre
les paragraphes prcdents sont disponibles sur le march. Le tableau A four- de fiches dapplication qui peuvent tre utiles pour orienter un choix en fonc-
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E
N Tableau A Principaux fournisseurs dappareils commercialiss

lectrophorse capillaire lectrophorse sur gel


Socit Autres appareils Sites Internet
avec collecte avec lution ou transfert

Agilent ............................................. X .............................................. ...................................... www.chem.agilent.com


S Amersham Bioscience ................... .............................................. X Hoefer Isoprime www.amebioscience.com

A Beckman Coulter ............................ X ..............................................


([J 2 786] 4.3.12)

...................................... www.beckmancoulter.com

V Bio-Rad............................................ .............................................. X Rotofor


(cf. [J 2 786] 4.3.2)
www.bio-rad.com

O 491 Prep Cell


(cf. [J 2 786] 3.3.1)

I Elchrom Scientific ..........................

Hoefer..............................................
..............................................

..............................................
X

..............................................
......................................

IsoPrime
www.elchrom.com

www.hoeferinc.com

R Kontron Instruments ...................... .............................................. ..............................................


(cf. [J 2 786] 4.3.1.2)

RF3 http://kontron2004.veloce-it.net
(cf. [J 2 786] 4.3.1.1)

Perkin Elmer.................................... X .............................................. ...................................... www.perkinelmer.com


P Sigma Aldrich ................................. .............................................. X ...................................... www.sigmaaldrich.com
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L Thermo Electron............................. .............................................. X ...................................... www.thermo.com

VWR Scientific Products ................ X X ...................................... www.vwrsp.com


U Waters ............................................. X .............................................. ...................................... www.waters.com

S Weber GmbH (Dr)........................... .............................................. .............................................. Octopus CHIEF


(cf. [J 2 786] 4.4.2)

....................................

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