Enzimologa Cintica enzimtica 1

Cintica enzimtica

Una reaccin qumica A B ocurre cuando una cierta poblacin de A

alcanza un estado de activacin que la permite transformarse en B
estableciendo un nuevo enlace qumico.
La diferencia entre la energa
del estado basal y la mxima
energa alcanzada se denomina
energa de activacin. Un
catalizador disminuye la energa de

Energa
activacin (Ea en la figura) y Ea
permite incrementar la velocidad
con que cursa la reaccin a una A
Ea

temperatura constante. Los

catalizadores no cambian sin G
B
embargo el cambio de energa que
acompaa la transformacin de A
en B.
Cuando un sistema se deja Coordenada de reaccin
reaccionar, la concentracin de los componentes alcanza un valor fijo que
depende de la naturaleza de los reactantes. Esa situacin se conoce como
equilibrio qumico.
En el equilibrio, la variacin de energa libre es 0.
Para un sistema de reaccin A + B C + D, el contenido de energa libre
viene dado por:
G = G 0 + RTln
[C][D]
[A ][B]
y est definido por una constante de equilibrio

K eq =
[C][D]
[A ][B]
Se puede definir la energa libre estndar de una reaccin como

G = -2,3 RT log Keq

Cuando la reaccin tienda a ir en el sentido de los productos C y D,

entonces [C] x [D] > [A] x [B], ([C] x [D] / [A] x [B]) > 1, log Keq > 0 y G < 0, se
est en presencia de una reaccin exergnica, que libera energa, est
favorecida termodinmicamente. Si es a la inversa, G > 0, es endergnica,
no se da espontneamente.
Enzimologa Cintica enzimtica 2

Enzimas

Las enzimas son catalizadores biolgicos que permiten que ocurran

reacciones qumicas necesarias para la vida. Las enzimas no slo permiten
que reacciones favorecidas ocurran, sino que catalizan procesos que requieren
de un influjo de energa para realizarse.
Qumicamente son, en su gran mayora, protenas, pero hay tambin ARN
con actividad cataltica.
Las enzimas no afectan la G ni la Keq de la reaccin, pero aumentan la
velocidad con la que el equilibrio se alcanza. A veces, in vivo, el equilibrio no es
alcanzado, sino que se llega a concentraciones ms o menos constantes de
productos y reactivos. Esto ocurre debido a que hay otras reacciones que
involucran a los reactivos y productos de una reaccin catalizada
enzimticamente, puede haer una produccin continua de reactivos y un
consumo constante de productos. A esta situacin se la conoce como estado
estacionario y es frecuente en reacciones intermedias de caminos metablicos.
Una de las caractersticas de las enzimas es su especificidad. Las
enzimas poseen sitios de unin para los reactivos, llamados sustratos, y
productos, a los que generalmente no se unen otros compuestos, a menos que
sean muy parecidos estructuralmente.
Las enzimas se denominan en general con el nombre de la reccin que
catalizan con el agregado de la terminacin asa.
A modo de ejemplo se pueden citar:
Deshidrogenasas: participan en la transferencia de equivalentes de
reduccin
Kinasas: participan en la transferencia de un grupo fosfato desde el
ATP
Transferasas: transferencia de grupos
Oxidasas: reacciones de oxidacin
Hidrolasas: hidrlisis de enlaces
Fosfatasas: remocin de grupos fosfato
Aldolasas: catlisis de una condensacin aldlica
Carboxilasas. Carboxilacin de un sustrato

Se identifican adems por un nmero asignado por la Enzyme

Commission, que consta de 4 elementos, por ejemplo 2.7.1.11.

El primer elemento designa a la clase:

1. oxidorreductasas
2. transferasas
3. hidrolasas
4. liasas
5. isomerasas
6. ligasas
El segundo elemento sita a la enzima en una subclase. Por ejemplo en
una oxidoreductasa indica el tipo de dador de electrones, o el grupo transferido
por una transferasa, o el enlace cortado por una liasa.
El tercer elemento identifica a la sus-subclase a que pertenece la enzima,
y se refiere por ejemplo al tipo de aceptor para un determinado dador de
Enzimologa Cintica enzimtica 3

electrones, el tipo de grupo transferido con ms especificidad (por ejemplo si un

grupo de 1 carbono transferido es un metilo o un carbonilo).
El cuarto y ltimo elemento le asigna a la enzima un nmero de serie
dentro de la sub-subclase.
Tomemos como ejemplo estas dos reacciones catalizadas
enzimticamente:

ATP + fructosa-6-P ADP + fructosa-1,6-bisP

PPi + fructosa-6-P Pi + fructosa-1,6-bisP

Ambas compartirn los tres primeros elementos 2.7.1, ya que pertenecen

a la clase de las transferasas (2), y dentro de estas a las que transfieren grupos
fosfato (7), siendo un grupo alcohlico el aceptor (1). Los nmeros de serie son
el 56 para la primera y el 90 para la segunda.
En ambas se transfiere un grupo fosfato al grupo OH situado en C1 de la
fructosa-6-P.
La primera enzima se denomina comnmente fosfofructoquinasa
dependiente de ATP, la segunda fosfofructoquinasa dependiente de PPi o
pirofosfato:fructosa-6-fosfato 1-fosfotransferasa.
Enzimologa Cintica enzimtica 4

Cintica enzimtica

Las reacciones enzimticas no escapan a las reglas generales de la

cintica qumica. Como se dijo antes, las enzimas no alteran la Keq ni la G.
Sin embargo, las reacciones presentan caractersticas particulares. As,
cuando se determina la actividad en funcin de la concentracin de sustrato se
obtienen cinticas de saturacin. Este tipo de cintica se observa para la unin
de pequeos ligandos a macromolculas, e implica una saturacin de los sitios
disponibles para la unin a medida que se incrementa la concentracin del
ligando. En forma anloga, lo que se observa en una reaccin catalizada
enzimticamente, es que la velocidad con que transcurre la reaccin aumenta
con la concentracin de sustrato pero tendiendo a alcanzar un valor mximo.
Este tipo de grficos se puede describir matemticamente mediante una
hiprbola, en la cual hay dos parmetros, el valor mximo al que tiende la
variable dependiente (en este caso v, la velocidad de la reaccin, tiende a un
valor de Vmax), y el valor de la concentracin de sustrato o ligando que produce
una velocidad semimxima (en el grfico KM).

Esta particularidad condujo al concepto de que la enzima interactuaba con

el S para formar un complejo.
Esta situacin fue analizada por Leonor Michaelis y Maud Menten, con
base en postulados previos de Brown y Henri, para formar la primera teora de
la cintica enzimtica, perfeccionada luego por Briggs y Haldane.

Aproximacin al equilibrio rpido de Michaelis y Menten

Consideremos la reaccin sencilla:

SP
Catalizada por E. Segn la teora, E se une a S para formar un complejo
previo a la catlisis.
Enzimologa Cintica enzimtica 5

k+1 k+2 k+3

E + S ES EP E + P (1)
k-1 k-2 k-3
ES y EP se denominan complejos centrales, y las constantes k son las
constantes de velocidad para cada reaccin.

Para simplificar, se considera como una slo y se considera a la velocidad

inversa de descomposicin del complejo EP (k-2) insignificante. Queda
entonces:
k+1 kp
E + S ES E + P (2)
k-1

La ecuacin de velocidad se puede deducir de dos formas. La ms

sencilla supone que la interconversin de E + S y ES es muy rpida comparada
con la velocidad con que se descompone en E + P, o sea que k+1 y k-1 >> kp. Al
asumir esta situacin, se considera entonces que las concentraciones de E, S y
ES son las del equilibrio, hay una situacin de equilibrio qumico debido a que
ES se descompone muy lentamente en E + P.

De esta manera, la velocidad depende directamente de cuanto haya de

ES:

v = kp [ES] (3)

kp se denomina constante cataltica de velocidad.

Vale la pena destacar que para todo este tipo de anlisis, se debe
considerar que se trabaja en condiciones iniciales, es decir que el tiempo
transcurrido es tal que la [S] permanece en el valor inicial, y adems que la [P]
es = 0 cercana a 0, de modo que la conversin de ES en P es irreversible. Por
otra parte, estando en condiciones de equilibrio, la [ES] permanece constante y
v es constante (para una determinada concentracin de sustrato).

La concentracin de enzima total es:

[E]t = [E] + [ES] (4)

Dividiendo ambos trminos de la ecuacin de velocidad (3) por [E]t

tenemos que:

v k [ES ]
= p
[E]t [E] + [ES ] (5)

Deberamos reemplazar [ES], que es una cantidad difcil de medir. Si

tenemos que el equilibrio qumico est definido por una constante de
disociacin Ks
El reemplazo se realiza
teniendo en cuenta que:
v+1 = k+1 [E][S]
Ks =
[E][S] = k 1 [ES ] = [S] [E] (6) y
[ES ] k + 1 Ks
v-1 = k-1 [ES]
Enzimologa Cintica enzimtica 6

Sustituyendo en (5) [ES] por su equivalente segn (6):

kp
[S] [E]
v Ks (7)
=
[E]t [S]
[E] + [E]
Ks
Eliminando [E] por simplificacin y pasando kp al primer miembro

[S]
v Ks
=
kp [E ]t
1+
[S] (8)
Ks

Si v = kp [ES] (Ec. 3), es decir que la velocidad est limitada por [ES],
entonces el lmite mximo de velocidad se encontrar cuando toda la enzima
est formando parte del complejo ES ([ES] = [E]t), por tanto
kp [E]t = Vmax
[S]
v
= Ks
Vmax
1+
[S] (9)
Ks
Reordenando

v
=
[S] (10)
Vmax Ks + [S ]

Para reacciones bimoleculares o ms complejas que se desarrollen de

acuerdo al sistema de equilibrio rpido, se obtienen ecuaciones similares. La
ecuacin nos da la velocidad instantnea para una concentracin de S
determinada, y es vlida dentro de un lapso de tiempo determinado en que no
vara significativamente [S], a esto llamamos condiciones iniciales.
Esta ecuacin de velocidad, o su forma modificada

v=
[S] * Vmax
(11)
Ks + [S ]
al ser graficada tiene la forma de una hiprbola y explica por tanto la cintica de
saturacin.

Aproximacin al estado estacionario (Briggs y Haldane)

En este caso se analiza la situacin en que la descomposicin de ES es
rpida en comparacin con la de interconversin entre E + S y ES, de forma tal
que no se alcanza un equilibrio qumico. Si la enzima est presente en
Enzimologa Cintica enzimtica 7

cantidades catalticas, es decir que [S] >> [E]t, al combinar E y S se alcanza el

estado estacionario, en que ES permanece constante en el tiempo, aunque ni
las concentraciones de de E, S ni ES sean las del equilibrio. En este caso, si
bien se llega a una ecuacin parecida, la deduccin de la ecuacin de
velocidad es diferente.
Consideremos entonces la ecuacin (2)

kp
E + S ES E + P (2)
k-1

al igual que antes,

v = kp [ES] (3)

v k [ES ]
= p
[E]t [E] + [ES ] (5)

Si [ES] es constante, entonces las velocidades de descomposicin y

formacin son iguales.
La formacin est dad por:
k+1
E + S ES (12)

Y la descomposicin por:
k-1
ES E + S (13)
y
kp
ES E + P (14)

Por lo tanto la velocidad de formacin de ES es:

vf = k+1 [E][S] (15)
vd = k-1 [ES] + kp [ES] (16)
= (k-1 + kp)[ES]

En el estado estacionario, esta velocidad es:

[ES ]
=0
t
o bien

k+1 [E][S] = (k-1 + kp)[ES] (17)

despejando

[ES] = k + 1[E][S] (18)

(k + 1 + kp)
Enzimologa Cintica enzimtica 8

Las tres constantes se renen en una nica constante llamada de

Michaelis:

1 k +1 k 1 + kp
= Km = (19)
Km k 1 + kp k +1

sustituyendo en 18

[ES] = [E][S]
Km

sustituyendo en la ecuacin de velocidad 5:

v k [ES ]
= p (5)
[E]t [E] + [ES ]
queda

kp
[S] [E]
v Ks (20)
=
[E]t [E] + [S] [E]
Ks

simplificando [E] y sustituyendo kp*[E]t = VMAX

VMAX
[S]
v= Km
1+
[S]
Km
Reordenando

v=
[S] * Vmax
Km + [S ]
Hay que notar que Km es una constante de seudoequilibrio, dado que ac
no hay equilibrio sino una concentracin estacionaria de E, S y ES. Km refleja la
relacin entre esas concentraciones.

En las ecuaciones de velocidad obtenidas por cualquiera de los dos

mtodos, se aprecia que cuando la [S] es alta, v tiende a kp [E]t, es decir a una
constante. Es lo que se observa en los ltimos tramos de la curva, cuando por
ms que se incremente la [S] la velocidad prcticamente no se modifica, est
en un mximo. A esto se denomina condiciones saturantes. Cuando [S] es
baja, v tiende a V/Kx[S], es decir a una recta con pendiente V/K, son los
primeros tranos de la hiprbola.
Ks en especial pero tambin Km, dan una idea de la afinidad de la enzima
por el sustrato.
Enzimologa Cintica enzimtica 9

Determinacin de Km y VMAX

La ecuacin de Michaelis y Menten permite predecir el comportamiento de

una enzima, pero la representacin de v en funcin de [S] no permite mucha
certeza en la determinacin de estos parmetros.
Se recurre a transformaciones.
Una de ellas es la de Lineweaver y Burke.

1
=
[S] + Km = 1 + Km * 1
v Vmax * [S ] Vmax Vmax [S ]

Graficando 1/v versus 1/[S] el grfico se linealiza y los parmetros

cinticos se determinan por extrapolacin a los ejes.

1/v

1/Vmax
pendiente: Km/Vmax

1/[S]
-1/Km
Otra transformacin es la de Eadie-Hofstee. Multiplicando la ec. anterior
por VMAX y rearreglando los trminos queda:
v

Vmax
v
v = Km + Vmax
[S] pendiente: -Km

Vmax/Km

v/[S]
Enzimologa Cintica enzimtica 10

Tanto la abcisa como la coordenada no son independientes, dependen de

v, el error se distribuye en ambos ejes. Dicho de otra manera, se asigna el
mismo peso a los puntos obtenidos a distintas concentraciones de S y por tanto
con distinta v.

La transformacin de Woolf y Hanes propone la utilizacin de la siguiente

ecuacin:

[S] = [S]/v
1
[S] + Km
v Vmax Vmax

Km/Vmax
-Km

[S]
A valores extremos de [S] la recta se desva de la siguiente forma:

[S]/v [S] muy alta

[S] muy baja

[S]
Por lo que se toman valores intermedios de [S] para determinar los
parmetros cinticos.

El desarrollo de los diferentes mtodos para la estimacin de Km y VMAX

se debi a la necesidad de encontrar el mtodo que presentara el menor error
en la determinacin de estos parmetros. La transformacin de Lineweaver-
Burke es en este sentido la menos confiable. A bajas [S], habr mayor error en
la medida de la velocidad ya que esta ser baja y los errores introducidos por el
instrumental y el propio mtodo adquieren mayor relevancia. En los otros dos,
los datos son pesados contra la [S] o la velocidad, y de esa manera el error se
distribuye mejor entre los datos.
Por supuesto que la mejor manera de obtener los parmetros cinticos
sigue siendo el uso de mtodos estadsticos de ajuste no lineal a la ecuacin
de Michaelis Menten.
En cualquier caso, la eleccin del rango de la [S] a usar para esta tarea es
de suma importancia. Los valores de [S] usados deben estar distribuidos
alrededor de la Km de la enzima, para lo cual puede ser necesario un
Enzimologa Cintica enzimtica 11

experimento exploratorio para confirmar el rango aproximado de [S] en que se

encuentra la Km y luego elegir [S] que la flanqueen.
En esta figura se describen tres situaciones en un intento de determinar
Km y VMAX de una enzima hipottica con un Km aproximado de 10 mM y una
VMAX de 100. En el panel 1, se utilizaron concentraciones de S que estn por
debajo de la Km real, y el valor obtenido en consecuencia para este parmetro y
para VMAX est afectado por un error considerable y se desva adems del valor
real. Si hubieramos hecho este experimento, veramos que al obtener un valor
de Km de 15.8 mM y habiendo usado una concentracin mxima de S de 20
mM deberamos agregar medidas de actividad con concentraciones superiores.
En el panel 2 se hace evidente 100
que las concentraciones elegidas
son muy altas. Se obtiene una Km de 1
10. 42 mM pero se empieza a medir 80
recin en 10 mM, se deben agregar
puntos con concentraciones 60
menores de sustrato. Km = 15.8 4.24 (error del 26%)
v
El tercer panel ilustra el Vmax = 136 24.5 (error del 18 %)
40
experimento ejecutado en forma
correcta, con valores de [S] que
rodean a la Km. Se observa que el 20
error en la medicin de ambos Km
parmetros es mucho menor que en 0
los otros dos casos. En el ltimo 0 20 40 60 80 100

panel se han incluido tambin las barras de [S]

error que ilustran sobre el mayor 100
error que tienen los puntos obtenidos
a bajas concentraciones de sustrato. 80 2
60
v Km = 10.42 0,91 (error del 8%)
Vmax = 100.9 1.71 (error del 1.7 %)
40

20

Km
0
0 20 40 60 80 100
[S]
100

80
3
60

v Km = 9.96 0,53 (error del 5.3%)

v

40 Vmax = 100 1.44 (error del 1.43 %)

20
Km
0
0 20 40 60 80 100

[S]
[S]
Enzimologa Cintica enzimtica 12

Forma integrada de la ecuacin de Michaelis y Menten.

En muchos casos la determinacin de Km y VMAX es difcil debido a que la

actividad presentada a bajas [S] incrementa mucho el error o hace imposible la
medida. En el caso de una enzima que posea una Km para el sustrato muy baja
con una alta actividad especfica, va a ser muy difcil mantener las condiciones
iniciales al medir actividad, dado que cuando se mida actividad con [S]
menores a la Km, se partir de una concentracin baja que ir disminuyendo a
medida que pase el tiempo. Al no ser la actividad constante se pierden las
condiciones iniciales y el anlisis segn Michaelis y Menten no puede
realizarse.
Si se dispone de un buen
mtodo para medir ya sea S o P Activ
y la reaccin es irreversible,
entonces al medir actividad en
funcin del tiempo en una
cubeta se obtiene un grfico
como el que se muestra. Al
avanzar la reaccin, la actividad
disminuye al agotarse el
sustrato.
Dado que la actividad es la
tiempo
variacin de la concentracin de
sustrato o del producto con el tiempo, si se integra la ecuacin de actividad con
respecto al tiempo se podra obtener una forma de calcular los parmetros
cinticos midiendo la v en funcin de t.

[S ] [S ] * Vmax
v= =
t Km + [S ]

Km + [S ]
Vmax * t = [S ]
[S]
Integrando:

Km + [S]
[S]
t S
Vmax t =
to S0 [S]

[S]
Vmax t = Km [S]
[S]

Vmax * t = Km * ln
[S] ([S] [S ])
[S o ] o

Reordenando y tomando logaritmo decimal:

Enzimologa Cintica enzimtica 13

[S] [S o ] = 2.3 Km * log [S 0 ] + V

t t [S] max
Reordenando nuevamente:

2 .3 [S ]
log 0 =
1 [S 0 ] [S] Vmax
+
t [S] Km t Km

Se grafica ahora
2 .3 [S ] [S ] [S]
log 0 vs. 0
t [S] t

Vmax/Km

2.3 log [S0]/[S]

t
pendiente: -1/Km

Vmax

[S0]-[S]
t

La ventaja de este ensayo es que en una sola cubeta se pueden obtener

tanto Km como VMAX usando todas las concentraciones desde la concentracin
inicial (S0), que es conocida, hasta la final, en que es 0.