Secuenciacin del ADN

La secuenciacin del ADN es un conjunto de mtodos y tcnicas bioqumicas cuya finalidad es la

determinacin del orden de los nucletidos (A, C, G y T) en un oligonucletido de ADN. La secuencia de ADN
constituye la informacin gentica heredable que forman la base de los programas de desarrollo de los seres
vivos (de procariotas, de eucariotas en el ncleo celular, y en los plsmidos, en la mitocondria y en cloroplastos
de las plantas). As pues, determinar la secuencia de ADN es til en el estudio de la investigacin bsica de los
procesos biolgicos fundamentales, as como en campos aplicados, como la investigacin forense. Adems, se
puede utilizar la secuenciacin del ADN para conocer las mutaciones somticas, como las sustituciones de
bases, generadas entre distintos organismos. El desarrollo de la secuenciacin del ADN ha acelerado
significativamente la investigacin y los descubrimientos en biologa. Las tcnicas actuales permiten realizar
esta secuenciacin a gran velocidad, lo cual ha sido de gran importancia para proyectos de secuenciacin a gran
escala como el Proyecto Genoma Humano. Otros proyectos relacionados, en ocasiones fruto de la colaboracin
investigadora a escala mundial, han establecido la secuencia completa de ADN de muchos genomas de
animales, plantas y microorganismos. A pesar de las distintas tcnicas que permiten secuenciar el ADN, no
siempre se puede llegar a conocer el genoma completo de los organismos. Esto, puede llevar a errores en la
reconstruccin de los linajes y en la estimacin del tipo de mutaciones y del nmero de mitosis generadas.

Grfico de una secuencia de ADN obtenido porelectroforesis capilar (electroferograma).

ndice
1 Los inicios
2 Secuenciacin de Maxam-Gilbert
3 Mtodos de terminacin de la cadena
3.1 Secuenciacin por terminador fluorescente
3.2 Secuenciacin alelo-especfica por bisulfito
4 Pirosecuenciacin
5 Automatizacin y preparacin de las muestras
6 Estrategias de secuenciacin a gran escala
7 Nuevos mtodos de secuenciacin
7.1 Secuenciacin de alto rendimiento o "next-generation"
7.2 Secuenciacin de una nica molcula de ADN
7.3 Otras tecnologas de secuenciacin
8 Principales hitos en la secuenciacin del ADN
9 Vase tambin
10 Referencias
11 Enlaces externos

Los inicios
Durante treinta aos la mayor parte de la secuenciacin de ADN se llev a cabo con el mtodo de terminacin
de la cadena desarrollado por Frederick Sanger y colaboradores, en 1975.1 2 Antes del desarrollo de mtodos
rpidos de secuenciacin del ADN a principios de los 70 por Sanger en Inglaterra y Walter Gilbert y Allan
34 5
Maxam en Harvard,3 4 se utilizaban varios mtodos de laboratorio. Por ejemplo, en 19735 Gilbert y Maxam
publicaron una secuencia de 24 pares de bases utilizando un mtodo conocido como "de punto corrido"
(wandering spot).

La secuenciacin del ARN, que por razones tcnicas es ms sencilla de llevar a cabo que la del ADN, se
desarroll con anterioridad a la del ADN. El mayor hito en la secuenciacin del ARN, que data de la era previa
al ADN recombinante, es la secuencia del primer gen completo y del genoma completo del Bacterifago MS2,
identificado y publicado por Walter Fiers y colaboradores de la Universidad de Gante.6 7

Secuenciacin de Maxam-Gilbert
En 1976-1977, Allan Maxam y Walter Gilbert desarrollaron un mtodo para secuenciar ADN basado en la
modificacin qumica del ADN y posterior escisin en bases especficas8 Aunque Maxam y Gilbert publicaron
su secuenciacin qumica dos aos antes del trascendental artculo de Sanger y Coulson sobre su mtodo de
secuenciacin "ms-menos",9 10 la secuenciacin de Maxam y Gilbert rpidamente se hizo ms popular hasta
que se pudo utilizar ADN directamente, mientras que el mtodo inicial de Sanger requera que cada comienzo
de lectura fuera clonado para producir un ADN de cadena simple. No obstante, con el desarrollo y mejora del
mtodo de terminacin de la cadena (ver ms adelante), la secuenciacin de Maxam y Gilbert ha quedado en
desuso debido a su complejidad tcnica, el uso extensivo de productos qumicos peligrosos y dificultades para
escalarla. Adems, a diferencia del mtodo de terminacin de la cadena, los reactivos que se usan en el mtodo
de Maxam y Gilbert no se pueden adaptar para utilizarse en un kit biolgico estndar.

En resumen, el mtodo requiere marcaje radiactivo en uno de los extremos y la purificacin del fragmento de
ADN que se desea secuenciar. El tratamiento qumico genera rupturas en una pequea proporcin de uno o dos
de los cuatro nucletidos en cada una de las cuatro reacciones (G, A+G, C, C+T). Los agentes qumicos
utilizados en cada caso son: DMS (G), cido frmico (A+G), hidrazina (C+T) e hidrazina ms sales (C).De ese
modo se genera una serie de fragmentos marcados a partir del final marcado radiactivamente hasta el primer
lugar de "corte" en cada molcula.

Los fragmentos posteriormente se separan por tamao mediante electroforesis en gel, separando los productos
de las cuatro reacciones en cuatro carreras distintas, pero una al lado de la otra. El gel utilizado presenta
condiciones desnaturalizantes, y un contenido en poliacrilamida que vara entre un 6 y un 20 %. Para visualizar
los fragmentos generados en cada reaccin, se hace una autoradiografa del mismo, lo que proporciona una
imagen de una serie de bandas oscuras correspondientes a los fragmentos marcados con el radioistopo, a partir
de las cuales se puede inferir la secuencia.

Conocido en ocasiones como "secuenciacin qumica", este mtodo se origin en el estudio de las interacciones
entre ADN y protenas (huella gentica), estructura de los cidos nucleicos y modificaciones epigenticas del
ADN, y es en estos campos donde an tiene aplicaciones importantes.

Mtodos de terminacin de la cadena

Mientras que el mtodo de secuenciacin qumica de Maxam y Gilbert y el mtodo ms-menos de Sanger y
Coulson eran rdenes de magnitud ms rpidos que los mtodos previos, el mtodo de terminacin de la cadena
desarrollado por Sanger era incluso ms eficiente y rpidamente se convirti en el mtodo de eleccin. La
Tcnica de Maxam-Gilbert requiere el uso de productos qumicos altamente txicos y grandes cantidades de
ADN marcado radiactivamente, mientras que el mtodo de terminacin de la cadena utiliza pocos reactivos
txicos y cantidades menores de radiactividad. El principio clave del mtodo de Sanger es el uso de
didesoxinucletidos trifosfato (ddNTPs) como terminadores de la cadena de ADN.

El mtodo clsico de terminacin de la cadena o mtodo de Sanger necesita una hebra molde de ADN de
cadena sencilla, un cebador de ADN, una ADN polimerasa con nucletidos marcados radiactivamente o
mediante fluorescencia y nucletidos modificados que terminan la elongacin de la cadena de ADN. La
muestra de ADN se divide en cuatro reacciones de secuenciacin separadas que contienen los cuatro
desoxinucletidos estndar (dATP, dGTP, dCTP and dTTP) y una ADN polimerasa. En
cada reaccin se aade solo uno de los cuatro didesoxinucletidos (ddATP, ddGTP,
ddCTP, o ddTTP). Estos didesoxinucletidos terminan la elongacin de la cadena al
carecer un grupo 3'-OH que se necesita para la formacin del enlace fosfodister entre
dos nucletidos durante la elongacin de la cadena de ADN. La incorporacin de un
didesoxinucletido en la cadena naciente de ADN termina su extensin, lo que
produce varios fragmentos de ADN de longitud variable. Los didesoxinucletidos se
aaden a concentraciones lo suficientemente bajas como para que produzcan todas las
posibilidades de fragmentos y al mismo tiempo sean suficientes para realizar la
secuenciacin.

Los fragmentos de ADN sintetizados y marcados de nuevo son desnaturalizados por

calor y separados por tamao (con una resolucin de un solo nucletido) mediante
electroforesis en gel de poliacrilamida - urea. Cada una de las cuatro reacciones de
sntesis se corre en carriles individuales (Carril A, T, G y C) y se visualizan las bandas
Parte de un gel de
de ADN mediante autoradiografa o luz ultravioleta, y la secuencia de ADN se puede
secuenciacin con
leer directamente a partir de la placa de rayos X o de la imagen del gel. En la imagen marcaje radiactivo.
de la derecha, la pelcula de rayos-X se expuso directamente al gel de modo que las
bandas oscuras corresponden a los fragmentos de ADN de diferentes longitudes. Una
banda oscura en un carril indica un fragmento de ADN que es el resultado de una terminacin de la cadena tras
la incorporacin de un didesoxinucletido (ddATP, ddGTP, ddCTP, or ddTTP). El nucletido terminal puede ser
identificado de acuerdo al didesoxinucletido que se aadi en la reaccin que dio lugar a esa banda. Las
posiciones relativas entre las cuatro calles se utilizan entonces para leer (de abajo a arriba) la secuencia de ADN
como se indica.

Existen algunas variaciones tcnicas del mtodo de secuenciacin

de terminacin de la cadena. En un mtodo, los fragmentos de
ADN son marcados con nucletidos marcados con fsforo
radiactivo. Como alternativa se puede utilizar un cebador marcado
en el extremo 5' mediante un colorante fluorescente.

Se siguen necesitando cuatro reacciones, pero los fragmentos de

ADN marcados con colorantes se pueden leer utilizando un sistema
ptico, lo que facilita un anlisis ms rpido y econmico y su
automatizacin. Esta variante se conoce como "secuenciacin
mediante colorantes acoplados al cebador" (dye-primer
sequencing). El ltimo avance de L Hood y colaboradores11 12
desarrollando ddNTPs y cebadores con marcaje fluorescente seala
el marco para una secuenciacin de ADN automatizada y de alto
rendimiento.

Los diferentes mtodos de terminacin de la cadena han

simplificado en gran medida la cantidad de trabajo y planificacin
necesaria para la secuenciacin de ADN. Por ejemplo, el kit
Los fragmentos de ADN se pueden marcar
"Sequenase" de la casa USB Biochemicals, basado en el mtodo de
utilizando radiactividad o fluorescencia en el
cebador (1), en la nueva cadena de ADN con
terminacin de la cadena contiene la mayora de los reactivos
dNTP marcado, o con un ddNTP marcado. necesarios para la secuenciacin, pre-divididos en alcuotas y listos
para usar. Se pueden dar algunos problemas de secuenciacin con
el mtodo de Sanger, como uniones no especficas del cebador al
ADN, que afectan a la correcta interpretacin de la secuencia de ADN. Adems tambin puede afectar a la
fidelidad de la secuencia obtenida estructuras secundarias internas de la cadena de ADN molde o ARN que
pueda actuar de cebador al azar. Otros contaminantes que pueden afectar a la reaccin son el ADN exgeno o
inhibidores de la ADN polimerasa.

Secuenciacin por terminador fluor escente

 Una alternativa al marcado
del cebador es el marcado
de los terminadores de la
cadena, un mtodo
conocido como
"secuenciacin por
terminador fluorescente".
La mayor ventaja de este
mtodo es que la
Electroforesis capilar. secuenciacin se puede
llevar a cabo en una sola
reaccin, en lugar de en
cuatro reacciones como en el mtodo del cebador marcado. En una
secuenciacin por terminador fluorescente se marcan cada uno de los
cuatro didesoxinucletidos que terminan la cadena con un colorante
fluorescente diferente, con fluorescencias a diferentes longitudes de
onda. Este mtodo es atractivo por su gran capacidad y rapidez y
actualmente es el mtodo de referencia en la secuenciacin Escala de secuencia mediante
automatizada con analizadores de secuencia controlados por secuenciacin radiactiva comparada con
computadora (ver ms abajo). Entre sus limitaciones potenciales estn mximos de fluorescencia.
los efectos de los terminadores fluorescentes en el fragmento de ADN,
que produce alturas y formas de picos desiguales en los registros de
secuencia de ADN del cromatograma tras la electroforesis capilar (ver ilustracin de la derecha) Este problema
se ha solventado en gran medida con la introduccin de nuevos sistemas enzimticos de polimerasas de ADN y
colorantes que minimizan la variabilidad de la incorporacin, as como mtodos para eliminar los "pegotes de
colorante" producidos por ciertas caractersticas qumicas de los colorantes que pueden dar lugar a artefactos en
los registros de secuencia de ADN. El mtodo de secuenciado por terminador fluorescente junto con
analizadores de secuencia de ADN de alto rendimiento se utiliza ahora para la inmensa mayora de los
proyectos de secuenciacin, puesto que es ms fcil de llevar a cabo y tiene un coste menor que los anteriores
mtodos de secuenciacin.

Secuenciacin alelo-especfica por bisulfito

La secuenciacin por bisulfito es una variante de la secuenciacin Sanger utilizada para el mapeo de
metilaciones alelo-especficas en los sitios CpG. Se extrae el ADN a secuenciar y se fragmenta con el fin de
facilitar la posterior desnaturalizacin a la que se va a someter para separar las dos hebras de ADN. A
continuacin se incuba en presencia de bisulfito entre 15 y 20 horas. Dicho compuesto acta desaminando las
citosinas del ADN convirtindolas en uracilo. Sin embargo, es incapaz de actuar sobre aquellas que se
encuentren metiladas. El siguiente paso consiste en la amplificacin de la regin que queremos mapear por
PCR y su posterior secuenciacin. Finalmente, se compara la secuencia obtenida con la de un control que no ha
sido sometido a la accin del bisulfito: aquellas citosinas que no estuviesen metiladas aparecern como tales en
el control, mientras que en la muestra tratada sern sustituidas por una timina.

La secuenciacin alelo-especfica por bisulfito presenta algunas

limitaciones, entre las cuales se encuentran las siguientes:

-Conversin incompleta: La secuenciacin mediante bisulfito depende

de la conversin de cada uno de los residuos de citosina no metilados a
uracilo. Si la conversin es incompleta, los posteriores anlisis que se
realicen interpretarn incorrectamente las citosinas no metiladas no
convertidas en uracilo como citosinas metiladas, dando lugar a falsos
positivos para la metilacin.Slo las citosinas que se encuentren en
cadenas simples de ADN sern susceptibles de ser atacadas por Secuenciacin con bisulfito
bisulfito por lo que el paso de desnaturalizacin del ADN es crtico en
este anlisis.Es importante por tanto optimizar parmetros como la
temperatura y la concentracin de sales para mantener el ADN desnaturalizado y as permitir una conversin
completa por bisulfito. Por otra parte tambin se ha propuesto que embebiendo el ADN en gel de agarosa se
incrementa el grado de separacin debido a que se mantienen las cadenas separadas.

-Degradacin del ADN durante el tratamiento con bisulfito: Es una de las limitaciones ms importantes de
este mtodo y tiene lugar paralelamente a la conversin. Para que se produzca una total conversin son
necesarias una serie de condiciones tales como largos tiempos de incubacin, temperatura elevada y altas
concentraciones de bisulfito. Estas condiciones en su conjunto pueden promover la degradacin del ADN en
una proporcin elevada. Esto puede suponer un grave problema si partimos de muestras con una baja
concentracin de ADN o de muestras tomadas post-mortem, adems dicha degradacin dar lugar a pequeas
roturas al azar a lo largo de la cadena de ADN lo que puede dar lugar a errores durante la amplificacin por
PCR.

-Desulfonacin incompleta de los residuos de pirimidina: Una inadecuada alcalinizacin de la solucin

puede tener como consecuencia una incompleta desulfonacin de los residuos de pirimidina, lo cual a su vez
puede afectar negativamente a las polimerasas de ADN, las cuales sern incapaces de replicar la cadena
molde.Esta situacin se puede evitar monitorizando el pH de la solucin asegurando as que se produzca una
desulfonacin completa.

Pirosecuenciacin
La pirosecuenciacin es un mtodo de secuenciacin de ADN en tiempo real basado en la liberacin de los
pirofosfatos (PPi) que tiene lugar en la reaccin de polimerizacin del ADN a partir de sus dNTPs.
Inicialmente, esta metodologa se empleaba para monitorizar de forma continua la actividad de la ADN-
polimerasa. Frente a otras tcnicas de secuenciacin, esta variante no requiere correr en un gel los fragmentos
de ADN generados en la reaccin de polimerizacin, ni marcadores fluorescentes o ddNTPs
(dideoxinucletidos). Este mtodo requiere de la preparacin de una molcula monocatenaria de ADN a la cual
se hbrida un pequeo cebador. Igualmente, la pirosecuenciacin requiere de los 4 dNTPs, la polimerasa de
ADN, as como tres enzimas: sulfurilasa (y el sustrato adenosina 5'- fosfosulfato o APS), luciferasa (y el
sustrato luciferina) y apirasa. A medida que la reaccin transcurra, se ir sintetizando la cadena complementaria
e iremos obteniendo una serie de picos de seal en el pirograma que nos permitirn determinar la secuencia. El
proceso ocurre en ciclos sucesivos de tres pasos:

En el primero de ellos, se aade al medio de reaccin uno de los 4 dNTPs el cual, si es el complementario a la
base de la hebra molde que toca copiar, ser procesado en la reaccin de polimerizacin e incorporado a la
cadena en extensin por la ADN-polimerasa, liberando un PPi.

Dicho PPi es posteriormente convertido a ATP al reaccionar con una molcula de adenosina 5-fosfosulfato por
medio de la ATP-sulforilasa.

Finalmente, tiene lugar la emisin de radiacin como consecuencia de la oxidacin de la luciferina a

oxiluciferina catalizada por la luciferasa de lucirnaga, consumiendo el ATP generado en la reaccin anterior.

Si el dNTP que ha sido aadido al medio de reaccin no es el complementario al que ocupa la posicin que toca
copiar, ste es degradado por una enzima llamada apirasa antes de que se aada el siguiente dNTP. Esto ltimo
permite eliminar el exceso de dNTP, ya que de no ser ste complementario y permanecer en el medio, al aadir
posteriormente la base complementaria a la cadena en extensin, no sera posible discenir si la emisin de luz
detectada se debe a la incorporacin de uno u otro nucletido.

El nmero medio de fotones emitidos por cadena molde es proporcional al nmero de nucletidos incorporados
a la cadena, siendo esta relacin lineal nicamente para un nmero bajo de incorporaciones. La radiacin
emitida es captada por una cmara acoplada a un sistema de cargas, el cual representa la seal en forma de pico
en el pirograma.
As vemos que la informacin de la secuencia se representa en el pirograma en la que la altura de los picos
refleja la cantidad de nucletidos incorporada: picos de mayor altura indicarn que se ha incorporado el mismo
nucletido varias veces, esto es, que en la cadena de ADN dicho nucletido se encuentra varias veces repetido
de manera seguida.

Automatizacin y preparacin de las muestras

Los instrumentos modernos
automticos de
secuenciacin del ADN
(secuenciadores de ADN)
pueden secuenciar ms de
384 muestras marcadas por
fluoresciencia de una sola
vez y llevar a cabo 24 ciclos Vista del comienzo de un ejemplo de lectura con le terminador (fondo coloreado).
de secuenciacin al da. No
obstante, los secuenciadores
automticos de ADN llevan a cabo solamente separacin del ADN basada en el tamao (por electroforesis
capilar), deteccin y registro de la coloracin fluorescente, y los datos resultantes se dan como cromatogramas
que registran los picos de fluorescencia. Se efectan por separado las reacciones de secuenciacin mediante una
termocicladora, lavado y resuspensin en una solucin tamponada antes de pasar las muestras al secuenciador.
En el pasado los operadores tenan que arreglar los extremos terminales de baja calidad (ver imagen de la
derecha) de cada secuencia manualmente para eliminar los errores de secuenciacin. Sin embargo, hoy se
puede realizar mediante software como "Fast Chromatogram Viewer" el arreglo automtico de los extremos
terminales en grandes cantidades.13

Estrategias de secuenciacin a gran escala

Los procedimientos actuales solo pueden secuenciar directamente fragmentos relativamente cortos (de entre
300-1000 nucletidos de longitud) en una sola reaccin.14 El principal obstculo para secuenciar fragmentos
de ADN de una longitud superior a este lmite es la capacidad insuficiente de separacin para resolver grandes
fragmentos de ADN cuyo tamao difiere en un slo nucletido. En cambio, las limitaciones impuestas por la
incorporacin de ddNTPs fueron resueltas en gran medida por Tabor, de la Harvard Medical, Carl Fueller, de
USB biochemicals, y colaboradores.15

La secuenciacin a gran escala persigue la secuenciacin de fragmentos muy grandes de ADN. Incluso los
genomas bacterianos relativamente pequeos constan de miles de nucletidos y slo el Cromosoma 1 humano
consta de 246 millones de bases. As pues, algunos enfoques abordan el problema cortando (con enzimas de
restriccin) o cizallando (mediante fuerzas mecnicas) fragmentos grandes para obtener otros ms pequeos. El
ADN fragmentado se clona en un Vector de ADN, normalmente un cromosoma artificial bacteriano (BAC) y
amplificado en Escherichia coli. El ADN amplificado se puede purificar entonces a partir de las clulas
bacterianas (Una desventaja de los clones bacterianos para el secuenciado es que algunas secuencias de ADN
pueden ser inherentemente inclonables en todas las lneas bacterianas disponibles debido al efecto deletreo de
la secuencia clonada en la bacteria hospedadora u otros efectos). Estos fragmentos cortos de ADN purificados a
partir de colonias bacterianas individuales se secuencian completamente y se ensamblan computacionalmente
en una secuencia larga y contigua identificando las secuencias que se solapan entre ellas (por secuenciacin por
fuerza bruta o "shotgun"). Este mtodo no requiere informacin preexistente sobre la secuencia de ADN y a
menudo se la conoce como secuenciacin de novo. Los intervalos entre las secuencias ensambladas se pueden
rellenar mediante paseos de cebadores, a menudo mediante pasos de sub-clonado (o secuenciacin a base de
transposones dependiendo del tamao del resto de regin que quede por secuenciar). Todas estas estrategias
implican efectuar muchas lecturas menores del ADN por alguno de los mtodos anteriores y posteriormente
ensamblarlos en secuencias contiguas. Las diferentes estrategias tienen diferentes inconvenientes en cuanto a
velocidad y exactitud. El mtodo de secuenciacin por fuerza bruta es el ms prctico para secuenciar genomas
 grandes, pero su proceso de ensamblaje es complejo y
potencialmente proclive al error -en particular en presencia de
repeticin de secuencias. Debido a esto, el ensamblaje del genoma
humano no est literalmente completo las secuencias repetitivas
de los centrmeros, telmeros y otras partes del cromosoma
quedan como huecos en el ensamblaje del genoma. A pesar de
contar con solo el 93 % del genoma ensamblado, el Proyecto
Genoma Humano se declar completado porque la definicin de
secuencia del genoma humano se limit a la secuencia eucromtica
(completa al 99 % en aquel momento), para excluir esas regiones
repetitivas intratables.16

El genoma humano
tiene una longitud de
unos 3000 millones de
pares de bases;17 si la
longitud media de
cada fragmento es de
El ADN genmico se fragmenta en trozos al 500 bases, llevara un
azar y se clonan en una biblioteca bacteriana. mnimo de seis
El ADN de los clones bacterianos individuales millones de
se secuencia y la secuencia se ensambla fragmentos secuenciar
observando las regiones solapantes. el genoma humano
(sin tener en cuenta el
solapamiento, es decir
si fuera posible hacerlo de una sola vez). Mantener el control de un
nmero tan elevado de secuencias presenta desafos significativos
que solo se pueden abordar mediante el desarrollo y la
coordinacin de varios algoritmos de procedimiento y
computacin, tales como el desarrollo y mantenimiento eficientes
de bases de datos.
Pasos para la resecuenciacin. Preparacin de
Se utiliza la Resecuenciacin o secuenciacin marcada para la muestra:Extraccin del cido nucleico.
determinar un cambio en la secuencia de ADN a partir de la Preparacin del molde:Amplificacin y
secuencia "de referencia". A menudo se efecta utilizando la PCR preparacin de una pequea regin de la
regin objetivo. (Click para ampliar)
para amplificar la regin de inters (se necesita una secuencia de
ADN preexistente para disear los cebadores de ADN). La
resecuenciacin realiza tres pasos, la extraccin del ADN o ARN
del tejido biolgico, la amplificacin del ARN o ADN (habitualmente por PCR) y despus la secuenciacin. La
secuencia resultante se compara con la de referencia o con una muestra normal para detectar mutaciones.

Nuevos mtodos de secuenciacin

Secuenciacin de alto r endimiento o "next-generation"
La elevada demanda de secuenciacin de bajo costo ha dado lugar a las distintas tecnologas de secuenciacin
de alto rendimiento18 19 que son capaces de paralelizar muchas operaciones de secuenciacin, produciendo
miles o millones a la vez, reduciendo los costos gracias a ello. Son las llamadas tambin secuenciaciones de
nueva generacin o "next-generation sequencing" (NGS).

Estos esfuerzos han sido financiados por instituciones pblicas y privadas as como desarrolladas y
comercializadas dentro de la empresa privada por las compaas de biotecnologa. Se pretende que las
tecnologas de secuenciacin de alto rendimiento disminuyan los costes de secuenciacin de las bibliotecas de
ADN ms all de lo que se puede hacer con el mtodo corriente del terminador marcado basado en la
separacin del ADN por electroforesis capilar.

Este tipo de secuenciacin a gran escala ha permitido llevar a cabo una lectura eficiente del genoma humano
llegando a encontrar incluso regiones no definidas en el genoma de referencia hg38, como apuntan ciertos
estudios a coberturas superiores a las previamente utilizadas (30x, tambin denominada secuenciacin
profunda o "deep sequencing", con respecto a 4-20x de profundidad, cobertura media-baja), mejorando as las
representaciones existentes.20 Por otro lado, ha propiciado la identificacin de SNPs an no descritos
contribuyendo a un aumento de la tasa de descubrimiento de variantes mediante el estudio de base de un gran
nmero de genomas de diversas poblaciones humanas. Este hecho podra ser de utilidad en la identificacin de
nuevas variantes, fundamentalmente aquellas con relevancia clnica, siendo uno de los aspectos de nuevo
abordaje en la actualidad.

Algunos de estos mtodos de secuenciacin de alto rendimiento son:

Amplificacin clonal in vitro

Ya que los mtodos de deteccin molecular frecuentemente no son lo suficientemente sensibles para la
secuenciacin de una sola molcula, la mayora de los mtodos utilizan un paso con clonacin in vitro para
generar muchas copias de cada molcula individual. Uno de los mtodos es la PCR de emulsin, en la que se
aislan las molculas individuales de ADN junto con microesferas recubiertas con cebadores en burbujas
acuosas dentro de una fase oleosa. Posteriormente una PCR recubre cada microesfera con copias clonales de la
bliblioteca de molculas aisadas y seguidamente se inmovilizan para ser ms tarde secuenciadas. La PCR de
emulsin se usa en los mtodos publicados por Margulis y colaboradores (comercializado por 454 Life
Sciences, adquirido por Roche), Shendure y Porreca et al. (conocido como "secuenciacin polony ", trmino
formado por polimerasa "pol" y colonia "colony"), y la secuenciacin SOLiD (desarrollada por Agencourt y
adquirida por Applied Biosystems).21 22 23 Otro mtodo para la amplificacin clonal in vitro es la "PCR de
puente", en la que los fragmentos se amplifican a partir de los cebadores unidos a una superficie slida,
desarrollados y usados por Solexa (de la que ahora es propietaria la empresa Illumina). Estos mtodos producen
ambos muchas localizaciones fsicamente aisladas que contienen cada una muchas copias de un solo fragmento.
El mtodo con una nica molcula desarrollado por el laboratorio de Stephen Quake (y ms tarde
comercializado por Helicos) se salta este paso de amplificacin, fijando directamente las molculas de ADN a
una superficie.24

Illumina (Solexa)

En este mtodo, se usan polimerasas diseadas por la empresa y nucletidos fluorescentes y de terminador
reversible. Las hebras de ADN y los primers se pegan a un portaobjetos, y se lleva a cabo una amplificacin
por la polimerasa, de forma que se crean colonias locales de ADN o "clusters de ADN". Tras eso se usan las
cuatro tipos de bases nucleotdicas de terminador reversible (bases RT), de forma que cuando una de ellas se
una a la secuencia se pare la reaccin. Una cmara recoge la fluorescencia etiquetada de los nucletidos, y
determinar qu nucletido es el que se ha unido en esa posicin. Aquellos nucletidos que no se hayan unido
sern lavados para continuar con el ciclo: una vez que se ha identificado la primera base y se hayan lavado las
dems, se eliminar el terminal de bloqueo del extremo 3' que impeda continuar con la sntesis de la cadena. Se
vuelve a echar una nueva tanda de nucletidos y se contina la secuenciacin hasta completar toda la cadena de
ADN.

A diferencia de la pirosecuenciacin, por cada ciclo se incorpora un nico nucletido, lo que ofrece ventajas
como poder tomar las imgenes de forma retrasada y secuencialmente desde una nica cmara.

Ion Torrent semiconductor

Este mtodo de secuenciacin se basa en la deteccin de iones de hidrgeno que se generan durante la
polimerizacin del ADN. Posee micropocillos en los que se inserta la cadena de ADN a secuenciar, y se inunda
con un nico tipo de nucletido.
La incorporacin de un nucletido en la polimerizacin de forma natural implica la formacin de un enlace
covalente, y la liberacin de un pirofosfato y una carga positiva en forma de iones de hidrgeno. Aprovechando
este hecho y la capacidad de los sensores de pH ISFET se ha desarrollado la tecnologa del Ion Torrent
semiconductor.

Si el nucletido incorporado no es complementario a la secuencia de ADN a secuenciar, no se incorporar y no

se dar ninguna reaccin. Si el nucletido es complementario a la cadena de ADN, se incorporar, provocando
la liberacin de un in hidrgeno, cuya seal ser recogido por un sensor de tipo ISFET. Tras cada ciclo, se
lavan los nucletidos para aadir un nuevo tipo, y la reaccin se volver a producir o no dependiendo de la
secuencia los nucletidos de la cadena a secuenciar. Al usar polimerasa naturales, la reaccin ocurre a tiempo
real.

En caso de que haya dos o ms bases iguales consecutivas, se incorporarn mltiples nucletidos en un nico
ciclo, se liberarn ms tomos de hidrgeno y la seal electrnica ser proporcionalmente mayor. Las ventajas
de este sistema es la tecnologa de medicin elctrica, sin necesidad del uso de medicin ptica mediante
nucletidos modificados, que permiten que el proceso sea ms barato tanto en los costes iniciales como de
operacin, as como su alta velocidad gracias a las polimerizaciones a tiempo real.

Secuenciacin paralelizada

Una vez que las secuencias clonales de ADN se localizan fsicamente en posiciones separadas de la superficie,
se pueden utilizar varios mtodos de secuenciacin para determinar las secuencias de ADN de todas las
localizaciones en paralelo. La "secuenciacin por sntesis", como en la popular secuenciacin electrofortica
con terminador marcado con colorante, usa el proceso de sntesis de ADN por ADN polimerasa para identificar
las bases presentes en la molcula complementaria de ADN. Los mtodos de terminador reversible (usados por
Illumina y Helicos) utilizan versiones reversibles de terminadores marcados con colorante, aadiendo un
nucletido cada vez, y detectando la fluorescencia correspondiente a esa posicin y removiendo posteriormente
el grupo de bloqueo para permitir la polimerizacin de otro nucletido. La pirosecuenciacin (utilizada por
454) tambin usa la polimerizacin del ADN para aadir nucletidos, aadiendo cada vez un tipo diferente y
despus detectando y cuantificando el nmero de nucletidos aadidos a una determinada localizacin a travs
de la luz emitida por la liberacin de los pirofosfatos unidos a ellos.21 25

Secuenciacin por ligacin

La "secuenciacin por ligacin" ("SOLiD sequencing") es otro mtodo enzimtico de secuenciacin que
emplea una ADN ligasa en lugar de una polimerasa para identificar la secuencia objetivo.26 22 23 Se usa en el
mtodo polony y en la tecnologa SOLiD que ofrece Applied Biosystems. Este mtodo utiliza un reservorio de
todos los oligonucletidos posibles de una longitud dada, marcados de acuerdo con la posicin secuenciada.
Los oligonucletidos se templan y ligan; el ligamiento preferente de las ADN ligasas por su secuencia
especfica produce una seal correspondiente a la secuencia complementaria en esa posicin concreta.

Secuenciacin de una nica molcula de ADN

La secuenciacin de una nica molcula de ADN se conoce con el nombre de secuenciacin "next next".

El mtodo tSMS (siglas en Ingls de True Single-Molecule Sequencing) de Helicos es uno de los ms modernos
comercializados hoy da para la secuenciacin. A diferencia de sus predecesores, no lleva a cabo ningn tipo de
amplificacin de la muestra, sino que es capaz de secuenciar a partir de una nica molcula monocatenaria de
ADN.

La muestra de ADN a analizar es troceada en fragmentos de entre 100 y 200 pares de bases. A continuacin, se
aade una cola de poli-A al extremo 3' de cada uno de estos fragmentos generados, estando el ltimo de ellos
marcado con una sonda fluorescente. Estas molculas servirn directamente de sustrato para el proceso de
secuenciacin.
El siguiente paso consiste en la hidridacin de los fragmentos sobre una micro-placa que contiene millones de
poli-T pegados en su superficie. Dicha molcula de poli-T actuar adems como cebador en el proceso de
secuenciacin.

A continuacin, la micro-placa es introducida en un dispositivo dotado de una cmara CCD capaz de captar la
fluorescencia emitida por cada uno de los fragmentos unidos a los poli-T, localizando as la posicin de cada
una de las molculas en la placa. Una vez ha sacado una foto de toda la superficie, la micro-placa es tratada con
una solucin cuyos componentes producen la escisin del fluorforo unido a la ltima adenina.

La reaccin de secuenciacin comienza mediante la adicin de una solucin con la polimerasa. A continuacin,
se aade una solucin de un nico tipo de nucletido marcado con un fluorforo (por ejemplo, la adenina).
Entonces, la polimerasa cataliza su incorporacin al cebador en aquellos casos donde corresponda, segn la
secuencia del fragmento concreto. El siguiente paso es el lavado de la solucin para eliminar aquellos
nucletidos no unidos, tras lo cual la cmara toma una nueva foto de la superficie, localizando aquellas
molculas donde s se han incorporado.

De nuevo, la placa se trata con una solucin que elimina el fluorforo de los nucletidos incorporados. A
continuacin, el proceso se repite aadiendo una nueva solucin con la polimerasa y un nucletido diferente
(por ejemplo la timina), e igualmente con la guanina y la citosina.

La magnitud de la tcnica radica en que, simultneamente se estn secuenciando millones de fragmentos

distintos de ADN; proceso que podemos seguir al mismo tiempo gracias a las imgenes captadas por la cmara.
Un software analiza dichas imgenes y reconstruye las secuencias de cada fragmento, las cuales deben ser
ensambladas posteriormente por programas informticos.

Por otra parte, la secuenciacin SMRT (del ingls single molecule real time sequencing ) de la empresa Pacific
Biosciences tambin utiliza tecnologas que permiten la secuenciacin de una molcula de El secuenciador
PacBio contiene una ADN polimerasa fijada en el fondo de los pocillos que van a contener las muestras. Se
utilizan nucletidos con bases nitrogenadas modificadas que al incorporarse a la cadena en proceso de
polimerizacin liberan fluorescencia, distinta para cada tipo de base, evitando de esta manera el lavado de
nucletidos como en el caso de la pirosecuenciacin. La marca fluorescente se encuentra en el grupo fosfato de
la base, de ah que la seal se observe cuando se produce la incorporacin de sta a la cadena incipiente. El
proceso de secuenciacin es ms rpido debido a que no es necesario lavar nucletidos ni enzimas.

Las ventajas del secuenciador PacBio es que es capaz de realizar lecturas de una longitud media de 4200-8500
pb, con lecturas mximas de 30000 pb. La precisin y la sensibilidad son extremadamente altas, adems de que
se reduce el bias evitando la amplificacin del ADN (caso de las secuenciaciones "next").

Otras tecnologas de secuenciacin

Otros mtodos de secuenciacin por ADN podan tener ventajas en trminos de eficiencia o exactitud. Al igual
que la secuenciacin por terminador marcado por tincin, estn limitadas a la secuenciacin de fragmentos
nicos aislados. La "secuenciacin por hibridacin" es un mtodo no enzimtico que usa un chip de ADN. En
este mtodo, un nico reservorio de ADN se marca mediante fluorescencia y se hbrida con un coleccin de
secuencias conocidas. Si el ADN desconocido se hbrida fuertemente en un punto dado de entre las secuencias,
hacindole que "luzca", entonces se infiere que esa secuencia existe dentro de los ADN desconocidos que son
secuenciados.27 La espectrometra de masas tambin se puede usar para secuenciar las molculas de ADN; las
reacciones convencionales de terminacin de la cadena producen molculas de ADN de diferentes longitudes y
la longitud de esos fragmentos se determina entonces por las diferencias de masa entre ellas (en lugar de
utilizar una separacin por gel).28

Hay nuevas propuestas para la secuenciacin de ADN que estn en desarrollo, pero an no han sido probadas.
Entre estas estn el marcaje de la ADN polimerasa,29 o la lectura de la secuencia a medida que la cadena de
ADN pasa por nanoporos. (secuenciacin de nanoporos).30
La secuenciacin en el sistema nanoporo se puede resumir en los siguientes pasos:

El ADN a secuenciar se rompe en fragmentos de 100 kb aproximadamente.

Se desnaturalizan para obtener fragmentos monocatenarios y se hibridan con sondas que se unen a
distintas partes del fragmento de ADN.
Los fragmentos de ADN con las sondas unidas se hacen pasar por el nanoporo, creando una curva de
corriente frente a tiempo. Los picos que se forman determinan la posicin de la sonda en cada fragmento
de genmico.
De acuerdo con una serie de reglas del apareamiento de bases, se puede determinar la secuencia de
ciertas porciones del fragmento de ADN genmico. Esto se hace para cada sonda y de manera paralela
para todos los fragmentos de la librera de ADN.
El resultado es una especie de mapa que nos detalla las posiciones de las sondas para cada fragmento de
la librera.
Por tcnicas de anlisis de los datos con un software se llega a conocer la secuencia de ADN.

Otras tcnicas de secuenciacin estn basadas en microscopas, como la microscopa de fuerza atmica o el
microscopio electrnico que se usan para identificar las posiciones de los nucletidos individuales dentro de
largos fragmentos de ADN marcando los nucletidos con elementos pesados (p.ej. halgenos) para la deteccin
visual y su registro.31 En octubre de 2006 el NIH public un boletn de noticias describiendo las nuevas
tcnicas de secuenciacin y anunciando varias concesiones de becas.32

No obstante, en 2011 se desarroll una tcnica de secuenciacin en la cual no se utilizaban medio pticos para
detectar la secuencia de bases, sino que se detectaban pequeas variaciones de pH a travs de la liberacin de
protones durante el proceso de replicacin de ADN. Se trata de la secuenciacin por Ion Torrent, con el cual se
gana en velocidad y escalabilidad.

En octubre de 2006, la Fundacin Premio X estableco el Premio Arconte X (Archon X Prize), que premia con
10 millones de dlares al "primer equipo que pueda construir un dispositivo y utilizarlo para secuenciar 100
genomas humanos en 10 das o menos, con una exactud no menor a un error por cada 100 000 bases
secuenciadas, con secuencias que cubran correctamente al menos el 98 % del genoma, y a un coste no mayor de
1000 dlares por genoma."33

Principales hitos en la secuenciacin del ADN

1953 Descubrimiento de la estructura de la doble hlice de ADN.

1972 Desarrollo de la tecnologa del ADN recombinante, que permite el aislamiento de fragmentos
definidos de ADN; antes de este descubrimiento las nicas muestras accesibles para la secuenciacin
eran de bacterifacos o virus de ADN.

1975 El primer genoma de ADN completamente secuenciado fue el del bacterifago X174.

1977 Allan Maxam y Walter Gilbert publicaron el artculo "Secuenciacin del ADN mediante
degradacin qumicas.34 Fred Sanger, independientemente, publica "Secuenciacin del ADN mediante
sntesis enzimtica".

1980 Fred Sanger y Wally Gilbert reciben el Premio Nobel de qumica.

1982 GenBank comienza su andadura como repositorio pblico de secuencias de ADN.

Andre Marion y Sam Eletr de Hewlett Packard crean Applied Biosystems en Mayo, que acaba
siendo hegemnica en la secuenciacin automatizada.
Akiyoshi Wada propone la secuenciacin automatizada y recibe apoyo para la construccin de
rebots con la ayuda de Hitachi.

1984 Los cientficos del Medical Research Council descifran la secuencia completa de ADN del virus de
Epstein-Barr, de una longitud de 170 Kbases.
1985 Kary Mullis y colaboradores desarrollan la reaccin en cadena de la polimerasa, una tcnica para
replicar pequeos fragmentos de ADN.
1986 El laboratorio de Leroy E. Hood en el Instituto de Tecnologa de California y Smith anuncian la
primera mquina semiautomtica de secuenciacin de ADN.
1987 Applied Biosystems comercializa la primera mquina de secuenciacin automatizada, el modelo
ABI 370.
Walter Gilbert abandona el panel sobre el genoma del Consejo Nacional de Investigacin de los
Estados Unidos para crear Genome Corp., cuyo objetivo es la secuenciacin y comercializacin de
los datos.

1990 El Instituto Nacional de salud de los Estados Unidos comienza ensayos a gran escala de
secuenciacin de Mycoplasma capricolum, Escherichia coli, Caenorhabditis elegans, and
Saccharomyces cerevisiae (a 75 centavos (US)/base).
Lipman y Myers publican el algoritmo BLAST para la alineamiento de secuencias.
Barry Karger (Enero35 ), Lloyd Smith (Agosto36 ), y Norman Dovichi (Septiembre37 ) hacen una
publicacin sobre la electroforesis capilar.

1991 Craig Venter desarrolla la estrategia para encontrar genes que se expresan con ESTs (Expressed
sequence tags).
Uberbacher desarrolla GRAIL, un programa de prediccin de genes.

1992 Craig Venter abandona el NIH para abrir el "The Institute for Genomic Research" (Instituto para la
investigacin genmica, El TIGR).
El Trust Wellcome comienza su participacin en el Proyecto Genoma Humano.
Simon y al. desarrollan los BACs (cromosoma artificial bacteriano) para el clonado.
Mapa fsico del primer cromosoma publicado:
Page y otros. - Cromosoma Y.38
Cohen y otros. cromosoma 21.39
Lander - mapa gentico completo del ratn.40
Weissenbach - mapa gentico humano completo.41

1993 El trust Wellcome y MRC crean el Centro Sanger, cerca de Cambridge, Reino Unido.
La base de datos GenBank se traslada de Los lamos (DOE) al NCBI (NIH).

1995 Venter, Fraser y Smith publican la primera secuencia de un organismo de vida libre, Haemophilus
influenzae (tamao del genoma: 1.8 Mbase).
Richard Mathies y colaboradores escriben un artculo sobre los marcajes colorantes en la
secuenciacin (PNAS, Mayo).42
Michael Reeve y Carl Fuller, polimerasa termoestable para la secuenciacin.15

1996 Los socios internacionales del Proyecto Genoma Humano acuerdan publicar los datos de
secuenciacin en bases de datos pblicas en 24 horas.
Un consorcio internacional publica la secuencia del genoma de la levadura S. cerevisiae (tamao
del genoma 12.1 Mbases).
Yoshihide Hayashizaki en el RIKEN completa el primer juego de cDNAs de longitud completa de
ratn.
ABI presenta un sistema de electroforesis capiar, el analizador de secuencias ABI310.

1997 Blattner, Plunkett y colaboradores. publican la secuencia de E. coli (Tamao genmico 5 Mb).43

1998 Phil Green y Brent Ewing de la Universidad de Washington publican phred para interpretar los
datos de secuenciacin(en uso desde 1995).44
Venter funda una nueva compaa, Celera; Secuenciar el genoma humano en 3 aos con un
coste de $300m.
Applied Biosystems presenta la mquina de secuenciacin capilar 3700.
Wellcome dobla su financiacin al Proyecto Genoma humano hasta $330 million para llegar a 1/3
de la secuencia.
 Objetivos del NIH y el DOE: Obtener un "borrador de trabajo" del genoma humano para 2001.
Sulston, Waterston y otros finalizan la secuencia de C. elegans (tamao del genoma de 97Mb).45

1999 El NIH cambia la fecha de finalizacin del borrador a la primavera de 2000.

NIH lanza el proyecto de secuenciacin del genoma del ratn.
Primera secuencia del cromosoma humano 22 publicada.46

2000 Celera y colaboradores secuencian la mosca de la fruta Drosophila melanogaster (Tamao del
genoma 180Mb) - lo que supone la validacin del mtodo de Venter de secuenciacin por fuerza bruta. El
consorcio Proyecto Genoma Humano y Celera debaten sobre aspectos relacionados a la publicacin de
datos.
El consorcio Proyecto Genoma Humano publica la secuencia del cromosoma 21.47
HGP y Celera anuncian conjuntamente los borradores de trabajo de la secuencia del genoma
humano y prometen una publicacin conjunta.
Las estimaciones del nmero de genes del genoma humano se sitan entre 35 000 y 120 000. El
consorcio internacional completa la primera secuencia de una planta, Arabidopsis thaliana
(Tamao del genoma 125 Mb).

2001 El Proyecto Genoma Humano publica el borrador de la secuencia del genoma humano en Nature el
15 de febrero.48
Celera publica la secuencia del genoma humano.49

2005 420,000 secuencias VariantSEQr de cebadores de resecuenciacin humanas publicadas en la nueva

base de datos NCBI Probe.

2007 Por primera vez se secuencia un grupo de especies estrechamente relacionadas. Se secuencian 12
Drosoflidos (mosca de la fruta), haciendo despegar la era de la filogenmica.
Craig Venter publica su genoma diploide completo: el primer genoma humano en ser
completamente secuenciado.50

Vase tambin
Anlisis moleculares de ADN
Secuenciacin 454
Proyecto Genoma Humano
Medicina genmica
Transistor de ADN de efecto de campo

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Enlaces externos
Tecnologa bsica para el marcaje del ADN con tomos pesados para imgenes directas usando la
microscopa electrnica de transmisin y la secuenciacin de cadenas de ms de 10 000 pares de bases
por imagen capturada: Tecnologa de marcaje con nmero Z alto.
Plataforma de secuenciacin de ADN Millegen
Secuenciacin de ADN: Animacin de una reaccin por terminador marcado por tincin

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