TCNICAS INSTRUMENTALES ANALTICAS T5. Espectroscopia de fluorescencia molecular.

Tema 5: Espectroscopia de fluorescencia molecular.

1. Teora de la luminiscencia molecular.

La luminiscencia es un proceso de emisin de radiacin como consecuencia de la

desactivacin de una molcula. Existen diferentes tipos en funcin de la energa con la cual ha
pasado al estado excitado:

Fluorescencia y fosforescencia: la molcula es activada por radicacin.

Termoluminiscencia y piroluminiscencia: calor.
Triboluminiscencia: energa mecnico.
Catodoluminiscencia: bombardeo electrnico.
Electroluminiscencia: energa elctrica.
Quimioluminiscencia: reaccin qumica.

Fundamento.

La multiplicidad de una molcula se define como M = 2S + 1, donde S es la suma de

espines de los electrones individales. Un estado electrnico molecular en el cual todos los
espines de los electrones estn apareados se llama singlete:S = 0 y M = 0.

Cuando uno de los electrones de una molcula es

excitado a un nivel de energa superior, se forma un estado
singlete excitado, o bien se forma un estado triplete excitado
en el que los espines de los dos electrones se han
desapareado y estn paralelos: S = 1, M =3.

Las transiciones desde el estado fundamental singlete al estado triplete excitado son
muy poco probables y normalmente es necesario pasar por el estado singlete excitado.

Diagrama de niveles de energa para las

molculas fotoluminiscentes.

Las lneas gruesas superiores son los

niveles de energa de los estadis vibracionales
fundamentales de los estados electrnicos
excitados. Las lneas situadas a la izquierda
representan los estados singlete (S1 y S2) y
triplete (T1). La energa del primer estado triplete
excitado es menor que la energa del
correspondiente esyado singlete.

Procesos de desactivacin.

Una molcula excitada puede volver a su estado fundamental mediante una

combinacin de varias etapas mecansticas. La fluorescencia y fosforescencia conllevan la
emisin de un fotn de radiacin; las otras etapas son procesos no radiantes.

Una molcula puede promocionarse a cualquiera de los diversos niveles vibracionales

durante el proceso de excitacin. En disolucin, el exceso de energa vibracional se pierde
inmediatamente como consecuencia de las colisiones entre las moleculas excitadas y las del
disolvente; se transfiere energa y la fluoresencia, cuando tiene lugar, se produce desde el nivel
vibracional ms bajo del estado electrnico excitado. Este proceso se conoce como relajacin
vibracional.

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Profesora: Concepcin Parrado Quintela
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La conversin interna describe los procesos intermoleculares por los cuales la

molcula pasa a un estado electrnico de ms baja energa sin emisin de radiacin. El cruce
entre sistemas es un proceso en el cual se invierte el espn de un electrn excitado.

Una molcula en su estado electrnico excitado normalmente pasa a su estado

excitado ms bajo mediante una serie de relajaciones vibracionales rpidas y conversiones
internas que no producen emisin de radiacin. De esta manera, la fluorescencia surge,
generalmente, de una transicin desde el nivel vibracional ms bajo del primer estado
electrnico excitado a uno de los niveles vibraciones del estado electrnico fundamental.

La fluorescencia, por tanto, implica una

transicin desde un estado excitado de singlete hasta el
fundamental de singlete. Esta transicin es muy probable
y el tiempo de vida media de un estado de singlete
excitado es muy breve. Por otra parte, la fosforescencia
molecular implica una transicin de un estado de triplete
excitado al estado fundamental de singlete. Esta
transicin produce un cambio en el espn del electrn, por
lo que es mucho menos probable y el tiempo de vida
media de un estado triplete es mucho ms largo.

Probabilidad de los procesos.

La probabilidad de la desactivacin en forma de energa no radiante es mayor que la

probabilidad de emisin fluorescente, y mucho mayor que la probabilidad de emisin
fosforescente, ya que este ltimo es el proceso ms complejo. En cuanto al nmero de
mtodos, el que ms tiene es la absorcin, seguido de la emisin fluorescente y fosforescente.

2. Variables que afectan a la fluorescencia y a la fosforescencia.

Rigidez estructural.

Empricamente se encuentra que la fluorescencia se

ve particularmente favorecida en molculas que poseen
estructuras rgidas.

Efecto del disolvente.

En molculas polares el estado excitado es ms polar que el estado fundamental; al

aumentar la polaridad del disolvente se tiende a una estabilizacin del estado excitado en
mayor grado que el fundamental, esto rebaja la energa y aumenta la longitud de onda. En
disolventes con tomos pesados, aumenta la fosforescencia a expensas de la fluorescencia.

Influencia del pH.

La fluorescencia de un compuesto aromtico con

sustituyentes cidos o bsicos en el anillo depende normalmente del
pH. Los cambios en la emisin provienen del nmero de espectros
resontantes distintos que pueden asociarse a la molcula en su
forma cida o bsica. La variacin de la fluorescencia en funcin del pH puede emplearse para
evaluar el punto final en volumetras cido-base. Los cambios en los niveles energticos hacen
que vara la probabilidad de las transiciones * .

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3. Relacin entre intensidad y concentracin.

La potencia de emisin fluorescente es proporcional a la potencia radiante del haz de

excitacin absorbido por el sistema. La fraccin de radiacin transmitida es:

P
T = = 10 bc
P0

La fraccin de radicacin absorbida se escribe:

P
1 = 1 10 bc ;P0 P = P0 (1 10 bc )
P0

Finalmente, la relacin entre la intensidad y la concentracin resulta,

I F = k f (P0 P)

donde f es el rendimiento cunto de la fluorescencia o nmero de fotones emitidos entre

nmero de fotones absorbidos por unidad de tiempo, y k es la constante de proporcionailidad
que depende de parmetros instrumentales como la eficacia del detector y la geometra.

Se puede desarrollar la expresin como serie de McLaren y se llega a:

(
I F = k f P0 2,3bc +
2,3bc )2 + (2,3bc)3 + ...
2! 3!

Cuando bc = A< 0.05, el primer trmino entre corchetes es mucho mayor que los siguientes, y
as es posible escribir

I F = k f P0 2,3bc I F = Kc

La grfica de la energa radiante fluorescente de una solucin en funcin de la

concentracin de la especie fluorescente debe ser lineal si las concentraciones son bajas.
Cuando la concentracin aumenta lo suficiente la relacin pierde la linealidad. Este efecto es
consecuencia de los siguientes fenmenos:

Atenuacin: se produce debido al choque entre molculas excitadas y lleva a

la desactivacin en forma de energa no radiante. A mayor concentracin,
aumenta la probabilidad de las colisiones.
Autoabsorcin: la fluorescencia de una molcula es absorbida por otra del
mismo soluto en estado fundamental y disminuye, salvo que f=1.
Efecto de filtro interno: si la absorbancia y la concentracin son altas, la
porcin de la disolucin ms prxima a la fuente luminosa absorbe mucha
radiacin y queda poca disponible para el resto.
Formacin de dmeros u otros agregados cuyas caractersticas de emisin
sean distintas a las de la especie inicial. La asociacin de la especie excitada
en el estado singlete con molculas de la misma especie en el estado
fundamental produce que el espectro de emisin se desplace a mayores
longitudes de onda (al detector no le llega toda la energa que corresponde con
la emisin).

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4. Instrumentacin.

La figura muestra una configuracin caracterstica de los componentes en los

fluormetros y espectrofluormetros.

En la mayora de las aplicaciones se necesitan

fuentes ms intensas que las lmparas de wolframio o
hidrgeno utilizadas en la medida de absorcin. La
lmpara ms comn para los fluormetros de filtro es la
lmpara de arco de mercurio. En los espectrofluormetros
se utliza una lmpara de arco de xenn de alta presin que
proporcionan radiacin UV-vis intensa. Tambin se utilizan
lmparas pulsadas de xenn (0.1-10 Hz).

Tanto los filtros de interferencia como los de

absorcin se han utilizado en los flurmetros para la
seleccin de la longitud de onda. La mayora de los espectrofluormetros estn equipados con
al menos uno y a veces dos monocromadores de red.

Los tubos fotomultiplicadores son los detectores ms utilizados en instrumentos de

fluorescencia sensibles.
exc37exc
En funcin de la absorbancia, existen dos
posiciones del portamuestras. La posicin A, para
em em
muestras con absorbancias pequeas, y la posicin B, A B
para absorbancias elevadas.

5. Espectros de excitacin y de emisin.

Antes del calibrado tenemos que fijar dos longitudes de onda; la correspondiente a la
exictacin y la de emisin. El espectro de excitacin mide la intensidad de fluorescencia en
funcin de la longitud de onda de excitacin a una determinada longitud de onda de emisin; es
equivalente al espectro de absorcin si no se producen reacciones fotoqumicas o procesos
fotofsicos desde niveles excitados, y siempre que est corregido. El espectro de emisin
mide la intensidad de emisin fluorescente en funcin de la longitud de onda de emision a una
longitud de onda de excitacin fija. Ambos espectros son una imagen especular uno del otro.

La fotoluminiscencia normalmente tiene lugar a longitudes de onda ms largas que las

longitudes de onda de excitacin. Adems, las bandas fosforescentes se encuentran, en
general, a longitudes de onda ms largas que las bandas de fluorescencia, ya que, en la
mayora de los casos, el estado triplete excitado tiene menor energa que el correspondiente
estado singlete. Esto permite medir la diferencia de energa entre estados singlete y triplete. En
caso de que se emita a la misma longitud de onda, tenemos fluorescencia de resonancia.

5. Caracteristicas y aplicaciones de las tcnicas fluorescentes.

La espectroscopia de fluorescencia presenta las siguientes ventajas:

Tcnica muy sensible, 10-100 veces mayor que la absorcin UV-vis.

Altamente selectiva; la muestra tiene que tener unas determinadas condiciones
para que se fluorescente y slo algunas molculas emiten fluorescencia,
adems, hay que fijar dos longitudes de onda que es dificil que coincidan.

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Amplio intervalo lineal (mayor que en absorcin UV-vis).

Rpida y precisa para el anlisis de concentraciones bajas de analito.

Por el contrario, presenta los siguientes inconvenientes:

Tiene un campo de aplicacin restringido.

No es aplicable al anlisis de macroconstituyentes.
La exactitud y la precisin es menor que en absorcin UV-vis.
La fotodegradacin de las muestras puede daar la muestra.

Anlisis de compuestos inorgnicos.

Anlisis directo: pocas especies qumicas emiten fluorescencia, son los compuestos
de uranilo y algunas tierras raras como Ce (III), En (III), Tb (III) o Tl (I).
Formacin de quelatos fluorescentes: mtodo muy sensible y selectivo de aplicacin
en metales no de transicin porque se forman complejos fluorescentes.
Determinaciones indirectas: las medidas estn basadas en la desactivacin o
disminucin de la intensidad de emisin, como la determinacin de fluoruro por la
disminucin de fluorescencia que ejerce sobre el complejo aluminio-morina.

Anlisis de compuestos orgnicos.

Los compuestos organicos son especies altamente absorbentes a niveles de ppb o

ppm. Los tipos de compuestos que se pueden determinar son: vitaminas, qumica clnica,
anlisis forense, frmacos y drogas, contaminacin ambienal, qumica agroalimentaria

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