SANTIAGO ANTUNEZ DE

MAYOLO
Facultad De ciencias del Ambiente
ING. AMBIENTAL
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Alumnos: BAEZ GAMARRA Tania

JARA LEON Pedro
MEJIA GOMEZ Jheder
MONTAEZ BENITO Yover
SOLIS SOLIS Mirna
TRUJILLO ALVARADO Andrei

Curso: Bioqumica Ambiental

Tema: Trabajo De Investigacin.

Biotecnologa Enzimtica

Docente: Irma Mandujano

HUARAZ ANCASH
 DEDICATORIA

A nuestros padres y hermanos, docentes y

compaeros, por cooperar en nuestra formacin

profesional. Gracias por todo el apoyo incondicional y

permanente en esta etapa de nuestras vidas.

 SUMARIO

1. Dedicatoria

2. Presentacin .

3. Introduccin .

4. Biotecnologa .

5. Enzimas .

5.1 Antecedentes .....

5.2 Propiedades .....

5.2.1 Poder cataltico ..

5.2.2 Especificidad de las enzimas .

5.2.3 Regulacin de la Actividad enzimtica

5.3 Caractersticas generales .

5.3.1 Cofactores .

5.3.2 Isoenzimas .

5.4 Clasificacin de las enzimas

5.5 Fuentes de Enzimas .

5.5.1 Enzimas de origen animal ..

5.5.2 Clulas y tejidos vegetales .

5.5.3 Clulas microbianas

6 Inmovilizacin de enzimas.

6.1. Aspectos generales sobre la inmovilizacin de enzimas:

6.2. Mtodos de inmovilizacin de enzimas por retencin fsica.

6.3. Mtodos de inmovilizacin de enzimas por unin qumica.
 6.4. Usos prcticos de las enzimas
6.1.1 En la fabricacin de alimentos .
6.1.2 En la industria textil
6.1.3 En la industria de detergentes .
6.1.4 En la industria del papel
6.1.5 Aplicacin de las enzimas en anlisis clnicos .
6.1.6 Como productos mdicos y farmacuticos
6.1.7 Para la generacin de energa ..

7 Conclusiones .

8 Sugerencias .

9 Recomendaciones .

10 Bibliografa .

11 Anexos .
 PRESENTACIN

Los alumnos del tercer y cuarto ciclo de la escuela

profesional de Ingeniera Ambiental de la Facultad de Ciencias del

Ambiente, tienen el agrado de presentar la siguiente investigacin,

bajo el ttulo: Biotecnologa Ambiental.

Esperamos que la informacin, sea til para el desarrollo

humano y profesional de cada uno de los lectores.

 INTRODUCCIN

La biotecnologa no es, en s misma, una ciencia; es un enfoque multidisciplinario que

involucra varias disciplinas y ciencias (biologa, bioqumica, gentica, virologa,
agronoma, ingeniera, qumica, medicina y veterinaria entre otras).

Hay muchas definiciones para describir la biotecnologa. En trminos generales

biotecnologa es el uso de organismos vivos o de compuestos obtenidos de organismos
vivos para obtener productos de valor para el hombre.

Como tal, la biotecnologa ha sido utilizada por el hombre desde los comienzos de
la historia en actividades tales como la preparacin del pan y de bebidas alcohlicas o el
mejoramiento de cultivos y de animales domsticos. Histricamente, biotecnologa
implicaba el uso de organismos para realizar una tarea o funcin. Si se acepta esta
definicin, la biotecnologa ha estado presente por mucho tiempo.

La biotecnologa moderna est compuesta por una variedad de tcnicas derivadas de

la investigacin en biologa celular y molecular, las cuales pueden ser utilizadas en
cualquier industria que utilice microorganismos o clulas vegetales y animales.
Esta tecnologa permite la transformacin de la agricultura. Tambin tiene importancia
para otras industrias basadas en el carbono, como energa, productos qumicos y
farmacuticos y manejo de residuos o desechos. Tiene un enorme impacto potencial,
porque la investigacin en ciencias biolgicas est efectuando avances vertiginosos y los
resultados no solamente afectan una amplitud de sectores sino que tambin facilitan
enlace entre ellos.

El grupo.
 BIOTECNOLOGIA ENZIMATICA

OBJETIVO:

Describir conceptos importantes, los xitos y algunos problemas de biotecnologa con

aplicacin de enzimas. Tratar de describir los temas que abarcan los conceptos de manejo
de enzimas, fuentes y obtencin de enzimas, principales mtodos de extraccin y
purificacin de enzimas, ventajas y desventajas de las enzimas en comparacin con los
catalizadores qumicos, determinacin de actividad y aplicaciones industriales de enzimas.

LA BIOTECNOLOGA:

Suele definirse como un conjunto de tcnicas en las que se utilizan organismos vivos o
molculas derivadas de ellos para fabricar y modificar productos. Por ejemplo, se emplean
tcnicas de modificacin gentica en variedades de plantas, animales y microorganismos
para propsitos muy variados.

Ms concretamente, la biotecnologa de alimentos investiga los procedimientos de

elaboracin de productos alimenticios mediante la utilizacin de procesos biolgicos y
enzimticos. La demanda de alimento global ha contribuido adems a que aumente la
necesidad de cultivos mejorados. En este sentido la biotecnologa permite producir
alimentos ms nutritivos y de mejor sabor, rendimientos ms altos de cosechas, as
como plantas que se protegen naturalmente contra enfermedades, insectos y condiciones
adversas. Estos alimentos genticamente modificados (transgnicos) permiten seleccionar
un rasgo gentico especfico de un organismo e introducir ese rasgo en el genoma del
organismo fuente del alimento, mediante ingeniera gentica. De esta manera se han
desarrollado gran cantidad de cultivos para alimentacin con rasgos beneficiosos
especficos (vitaminas, resistencias a enfermedades), sin evidencia de rasgos
indeseables.
El rea de la biotecnologa llamada biotecnologa enzimtica trabaja en el campo de las
fermentaciones en el procesamiento de alimentos, as como en la mejora gentica de
microorganismos para su aplicacin a la produccin de protenas y enzimas de uso
alimentario. Veamos un ejemplo tpico.

El yogurt

Nos centraremos en la fabricacin del yogurt. Se trata de un derivado lcteo obtenido

mediante la fermentacin bacteriana de la leche. Esta clase de biotecnologa existe desde
tiempos remotos, tenemos pruebas de la elaboracin de estos productos lcteos en
culturas que existieron hace 4500 aos, en los comienzos de la Edad del Bronce. Los
primeros yogures surgieron probablemente a partir de la fermentacin espontnea debido
a la accin de alguna bacteria del interior de las bolsas de piel de cabra usadas como
recipiente de transporte.
Sealemos que la fermentacin es la transformacin de una sustancia orgnica
(generalmente un carbohidrato) en otra utilizable, mediante un proceso metablico
mediado por la accin de microorganismos o enzimas que provocan reacciones de
oxidacin-reduccin. Las fermentaciones pueden clasificarse en: anaerbicas, si se
producen en ausencia de aire, o aerbicas, en presencia de oxgeno. Actualmente, en la
industria fermentativa se utilizan tanques de fermentacin en condiciones perfectamente
controladas de temperatura y presin que permiten regular constantemente la entrada y
salida de productos.

Aparte de las fermentaciones lcticas que acabamos de mencionar, en la industria de

alimentos es tambin importante la del azcar (formacin de alcohol etlico) para la
elaboracin de vino, cerveza y sidra, y la del alcohol, (produccin de cido actico) en la
elaboracin del vinagre.

ENZIMA.

Enzima es cualquiera de las numerosas sustancias orgnicas especializadas compuestas

por polmeros de aminocidos, que actan como catalizadores en el metabolismo de los
seres vivos. Con su accin, regulan la velocidad de muchas reacciones qumicas
implicadas en este proceso.
Una enzima es un catalizador biolgico y, como todos los catalizadores, las enzimas
aumentan la rapidez de una reaccin qumica sin sufrir un cambio qumico permanente en
s mismas. Un catalizador influye en la rapidez de una reaccin qumica pero no afecta el
equilibrio de esta.

1. ANTECEDENTES.

El primer informe publicado acerca de la capacidad de los extractos celulares (malta)

para llevar a cabo una reaccin caracterstica de las clulas vivas (la hidrlisis del
almidn a glucosa) fue escrito inicialmente en 1833 por Payen y Persoz.

Se crea que este fenmeno y otros similares eran reacciones espontneas hasta que
en 1857 el qumico francs Louis Pasteur comprob que la fermentacin slo ocurre
en presencia de clulas vivas.

El nombre de enzima, que fue propuesto en 1867 por el fisilogo alemn Wilhelm
Khne (1837-1900), deriva de la frase griega en zym, que significa en fermento.

Emil Fischer (1894) demostr la especificidad de las enzimas para su substrato.

Eduard Buchner (1897) demostr la capacidad de los extractos de levadura para

catalizar la conversin de azcar a alcohol.

En 1926, el bioqumico estadounidense James B. Sumner consigui aislar y

cristalizar la ureasa. Cuatro aos despus su colega John Howard Northrop aisl y
cristaliz la pepsina y la tripsina. Northrop demostr tambin la naturaleza proteica de
las enzimas.

La ribonucleasa, una enzima descubierta en 1938 por el bacterilogo estadounidense

Ren Jules Dubos y aislada en 1946 por el qumico estadounidense MosesKunitz, fue
sintetizada por cientficos estadounidenses en 1969.

2. PROPIEDADES DE LAS ENZIMAS.

Como propuso el qumico sueco Jns Jakob Berzelius en 1823, las enzimas son
catalizadores tpicos: son capaces de acelerar la velocidad de reaccin sin ser
consumidas en el proceso.

La especificidad entre el sustrato y la enzima se ha concebido como la relacin de

una llave y su cerradura. La molcula del sustrato constituye la llave y la protena
constituye la cerradura; en la superficie de la protena existe una zona especfica,
denominada sitio activo o cataltico, a la cual se une la molcula del sustrato para
experimentar la transformacin cataltica.

La cintica de las reacciones enzimticas difiere de las reacciones inorgnicas

simples. Cada enzima es especfica de forma selectiva para la sustancia sobre la que
causa la reaccin, y es ms eficaz a una temperatura determinada. Aunque un
aumento de la temperatura puede acelerar una reaccin, las enzimas son inestables
cuando se calientan.

2.1. PODER CATALTICO.

Una caracterstica importante de las enzimas es su capacidad para funcionar

como catalizadores en un intervalo moderado de temperatura (~ 300 K), pH (2-
10) y presin (~ 1 atm).
Un ejemplo es la fijacin de nitrgeno catalizada por el complejo de la enzima
nitrogenasa, la cual se realiza ptimamente a 300 K, pH neutro y presin
atmosfrica. En contraste, la sntesis industrial de amoniaco a partir de nitrgeno
requiere una temperatura de 700-900 K, presiones de 100-900 atm y la
presencia de fierro como catalizador.

Alto poder cataltico; se logra un aumento de hasta 109 a 1012 en la rapidez

sobre la actividad no enzimtica.

2.2. ESPECIFICIDAD DE LAS ENZIMAS.

La mayora de las enzimas, a diferencia de los catalizadores qumicos, son

altamente especficas en cuanto a la naturaleza del substrato (s) que utilizan y al
tipo de reaccin que catalizan.

Las enzimas muestran especificidad absoluta en cuyo caso pueden utilizar un

solo substrato o un par de substratos, si la reaccin es biomolecular, a una
rapidez apreciable. Ejemplos de estas son las L- y D-lactato deshidrogenasas
que catalizan la reduccin de piruvato a L- o D-lactato, respectivamente, pero no
la mezcla de los dos estereoismeros. Adems, estas enzimas son
absolutamente especficas en relacin con el compuesto a reducir en la
reaccin. Por lo tanto, como muchas enzimas deshidrogenasas, son especficas
para NAD o NADP, pero no para ambos.

En tanto que las enzimas individuales tienen una alta especificidad por
su substrato, las enzimas, como un todo, tienen un intervalo amplio de actividad.

2.3. REGULACIN DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA.

Otra propiedad importante de las enzimas es que, a diferencia de la catlisis

qumica, su actividad cataltica a menudo puede regularse mediante iones o
molculas pequeas. As, el Ca2+ estimula a la enzima glucgeno fosforilasa,
 responsable del rompimiento del glucgeno a glucosa durante la contraccin
muscular.

Un mecanismo regulatorio que ocurre comnmente es la inhibicin

retroalimentada de las enzimas participantes en vas biosintticas.

3. CARACTERSTICAS GENERALES.

3.1 COFACTORES.

Coenzima, molculas orgnicas complejas que necesitan algunas enzimas para

realizar su actividad. Las coenzimas pueden estar ntima y permanentemente
unidas a las protenas, o bien unirse de forma dbil y transitoria.

Las enzimas son protenas con longitudes de cadena de 100 a 2500 residuos
aminocidos. Algunas enzimas como la quimotripsina (que cataliza la hidrlisis
de protenas) y la triosafosfatoisomerasa (que cataliza la interconversin de
gliceraldehdo-3-fosfato y dihidroxiacetona fosfato), no requieren de ningn
componente adems del substrato para su actividad. Sin embargo, muchas
enzimas requieren de un componente no proteico llamado cofactor para su
actividad.

Un grupo de cofactores son los iones metlicos. As, la piruvatocinasa necesita

K+ (y Mg2+) para su actividad; la carboxipeptidasa (que hidroliza protenas a partir
del extremo C-terminal) necesita Zn2+, el cual forma parte integral de la
estructura de la enzima. La eliminacin del zinc por quelacin con EDTA
desactiva la enzima.

Las cinasas necesitan Mg2+ para su actividad, aunque en este caso el ion
metlico se une al substrato en lugar de la enzima, as, el verdadero substrato
es Mg-ATP2- en vez de ATP.
 La segunda clase principal de cofactores son compuestos orgnicos que con
frecuencia se derivan del grupo de las vitaminas B. Por lo tanto, las carboxilasas
(que incorporan CO2) necesitan la biotina que esta covalentemente unida a la
enzima; las transaminasas requieren fosfato de piridoxal unido a la enzima.

Los cofactores que se encuentran fuertemente unidos a la enzima a menudo se

denominan grupos prostticos. La enzima que contiene el cofactor o grupo
prosttico se cono-ce como holoenzima(activa), en tanto que la enzima que
carece del cofactor se denomina apoenzima(inactiva). Compuestos orgnicos
tales como NAD, NADP, FAD, Coenzima A (CoASH) y ATP pueden unirse en
forma lbil a la enzima, un equilibrio entre la enzima, la apoenzima y el cofactor.
Estos cofactores se denominan coenzimas.

3.2. ISOENZIMAS.

Las isoenzimas son protenas que difieren en la secuencia de aminocidos pero

que catalizan la misma reaccin, estando presentes en la misma especie. Estas
enzimas poseen diferentes propiedades fsicas y qumicas determinadas
genticamente (punto isoelctrico, especificidad de sustrato y cofactor, etc),
suelen mostrar diferentes parmetros cinticos (i.e. diferentes valores de KM), o
propiedades de regulacin diferentes. La existencia de las isoenzimas permite el
ajuste del metabolismo para satisfacer las necesidades particulares de un
determinado tejido o etapa del desarrollo.

4. CLASIFICACIN DE LAS ENZIMAS.

La clasificacin de las enzimas se realiza de acuerdo con el tipo de reaccin de

transferencia, el grupo dador y el grupo aceptor, y se reconocen 6 grupos principales:
oxidorreductasas (transferencia de electrones), transferasas (transferencia de
grupos), hidrolasas (reacciones de hidrlisis o transferencia de grupos funcionales al
agua), liasas (adicin de grupos a dobles enlaces), isomerasas (transferencia de
grupos en el interior de la molcula para originar formar isomricas) y ligasas (forman
diversos enlaces acoplados a la ruptura de ATP).
Es comn dar a las enzimas nombres triviales que describen la reaccin que
catalizan, por ejemplo ureasa (cataliza la hidrolisis de la urea), lactato
deshidrogenasa (cataliza la oxidacin del cido lctico). En estos casos comnmente
se agrega el sufijo "-asa" al nombre del substrato o de la reaccin catalizada por la
enzima. Sin embargo, con frecuencia los nombres triviales no reflejan la reaccin en
la que participa la enzima, por ejemplo, renina, tripsina, enzima mlica, papana, etc.
Como resultado, la European Commission (Comisin Europea) dio a conocer una
nomenclatura para las enzimas aceptada internacionalmente.

El nombre sistemtico de un enzima consta actualmente de 3 partes:

El sustrato preferente
El tipo de reaccin realizado
Terminacin "asa"

Hay seis tipos principales de reacciones catalizadas por enzimas:

Reacciones de xido-reduccin catalizadas por xido-reductasas; Ej.Lactato

deshidrogenasa. Nombre sistemtico, L-Lactato: NAD+oxidoreductasa EC 1.1.1.27

reacciones de transferencia de grupo catalizadas por transferasas; Ej.

Hexocinasa. Nombre sistemtico, ATP: D-hexosa 6-fosfotransferasa EC 2.7.1.1

reacciones hidroliticas catalizadas por hidrolasas; Ej. Adenosintrifosfatasa

(ATPasa). Nombre sistemtico, ATP fosfohidrolasa EC 3.6.1.3

reacciones de eliminacin con formacin de un enlace doble, catalizadas por

liasas; Ej. Fructuosa-difosfatoaldolasa. Nombre sistemtico, D-fructuosa 1,6
difosfato D-gliceraldehdo 3-fosfato-liasa EC 4.2.1.13

reacciones de isomeracin catalizadas por isomerasas; Ej.

Triosafosfatoisomerasa. Nombre sistemtico, D-gliceraldehdo 3-fosfato ceto-
isomerasa EC 5.3.1.1
 reacciones donde se unen dos molculas a expensas de una fuente de energa,
generalmente ATP, catalizadas por ligasas (o sintetasas).Ej. Isoeucil-
tRNAsintetasa. Nombre sistemtico, L-isoleucina: tRNAIleligasa (formadora de
AMP) EC 6.1.1.5

El nombre de cada enzima puede ser identificado por un cdigo numrico,

encabezado por las letras EC (enzymecommission), seguidas de cuatro nmeros
separados por puntos. El primer nmero indica a cul de las seis clases pertenece el
enzima, el segundo se refiere a distintas subclases dentro de cada grupo, el tercero y
el cuarto se refieren a los grupos qumicos especficos que intervienen en la reaccin.

5. FUENTES DE ENZIMAS.

Es obvio que hay tres fuentes de enzimas: clulas animales, vegetales y microbianas.
En aos pasados, las plantas y los animales fueron las fuentes tradicionales de
enzimas, pero dados los avances recientes de la biotecnologa, probablemente el
futuro est en los sistemas microbianos.

1.1. ENZIMAS DE ORIGEN ANIMAL.

Las enzimas obtenidas a partir de tejidos animales, por lo general, se preparan de

animales recin sacrificados. Inmediatamente despus del sacrificio, se quitan los
tejidos y se congelan para evitar la degradacin bioqumica y de sulfuracin. Se
remueven los tejidos extraos, particularmente cuerpos grasosos, y a continuacin
el tejido es cortado en rebanadas o se pasa a travs de un molino de martillos. En
algunos casos la preparacin resultante se pasa tambin por un mezclador para
obtener un pur fino.

Enzimas que por lo comn se obtienen de tejidos animales

Enzima Nmero EC Fuente
-amilasa 3.2.1.1 Pncreas
Lipasa/esterasa de cidos grasos 3.1.1.3 Pncreas bovino/porcino
Lisozima 3.2.1.17 Albumina de huevo de bovino
Fosfolipasa A 3.1.1.4 Pncreas de porcino
Tripsina 3.4.21.4 Pncreas bovino/porcino
Quimotripsina 3.4.21.1 Pncreas bovino/porcino
Pepsina 3.4.23.1 Mucosa porcina
Renina 3.4.23.4 Bovino

Varios tejidos animales se usan como fuente de enzimas, incluyendo el

pncreas, bazo, hgado y varias porciones del tracto intestinal. Por supuesto, la
extraccin de la enzima va acompaada por varios pasos de purificacin, los
cuales sern tratados con enzimas microbianas.

1.2. CLULAS Y TEJIDOS VEGETALES.

Por muchos aos se han hecho preparaciones rudimentarias de enzimas

vegetales. Sin embargo, la extraccin de enzimas a partir de plantas es a
menudo difcil y requiere equipo pesado para macerar y moler el material
tpicamente fibroso. Los sistemas de molienda comunes por lo general son
insuficientes, excepto en los casos donde la fuente de materia es tejido de las
hojas y es posible usar molinos de martillos de uso rudo modificados.

Enzimas que por lo comn se obtienen de tejidos animales

Enzima Nmero EC Fuente
-amilasa 3.2.1.2 Grano de cebada
Peroxidasa 1.11.7.7 Raz de rbano
Papana 3.4.22.4 Ltex del rbol de papaya
Bromelana 3.4.22.4 Bromussp.
Ficina 3.4.22.3 Higuera
 1.3. CLULAS MICROBIANAS.

Se acepta generalmente que la fuente principal de enzimas a escala industrial

sern, en el futuro, los microorganismos. Las razones son:

Enzimas microbianas y sus aplicaciones

Enzima Fuente Aplicacin
Amilasa Bacillus subtilis Desaprestado de textiles, licuefaccin de almidn,
Asperyillusoryzae produccin de glucosa.
Penicillumroqueforti
Aspergillusniger
Pnicinilasa Bacillus subtilis Degradacon de penicilina.
Invertasa Asperyillusoryzae Industria de la confitera
Saccharomyces
cerevisiae
Celulasa Aspergillusniger Disminucin de la viscosidad, auxiliares en la
Trichoderma sp. digestin
Pectinasa Aspergillusniger Clasificacin de vinos y jugos de fruta
Proteasa Clostridumsp. Suavizante, auxiliar en la digestin

Los sistemas de produccin microbianos pueden mantenerse bajo

estrecho control.
Las concentraciones de enzimas y, por lo tanto, la productividad, se
pueden manipular en forma gentica y ambiental.
El aumento progresivo y la alimentacin del sistema no presentan el
mismo problema logstico que una fuente derivada de la agricultura.
Hay un grado inherente de flexibilidad en el proceso a travs de la
eleccin de varias enzimas.
Los mtodos de tamizado para sistemas microbianos son
comparativamente simples.
 La mayora de las enzimas microbianas usadas comercialmente son
extracelulares, esto es, se producen en el interior de las clulas y luego se
excretan o difunden en el medio de cultivo, del cual pueden ser operados. Esto
reduce el problema que se presenta a menudo con plantas y, algunas veces,
con tejidos animales, de tener que romper las clulas individuales.

Obviamente, la seleccin de los organismos productores es la clave de los

resultados satisfactorios de un proceso de enzimas microbianas. Es necesario
tener en cuenta las siguientes caractersticas:

Se requiere un organismo productor estable.

Se requiere un organismo que no presente demasiados problemas de
salud y otros relacionados.
Se requiere un organismo que no demande atencin en sus
necesidades de crecimiento, de modo que represente bajos costos de
produccin.
La productividad enzimtica debe ser alta.
El organismo no debe producir toxinas o antibiticos.
La clarificacin del medio de cultivo debe estar libre de dificultades
mayores.

De todas estas caractersticas, las ms importantes son la estabilidad de la cepa

y alta productividad enzimtica

6. INMOVILIZACIN DE ENZIMAS. FUNDAMENTOS, MTODOS Y

APLICACIONES.

6.1 ASPECTOS GENERALES SOBRE LA INMOVILIZACIN DE ENZIMAS:

La inmovilizacin de enzimas es un proceso en el que se confina o localiza a la

enzima en una regin definida del espacio, para dar lugar a formas insolubles
que retienen su actividad cataltica y
 Que pueden ser reutilizadas repetidamente. Posteriormente esta definicin se ha
ampliado a aquel proceso por el cual se restringen, completa o parcialmente, los
grados de libertad de movimiento de enzimas, orgnulos, clulas, etc. por su
unin a un soporte.

Como ventajas del empleo de enzimas inmovilizadas podemos destacar:

1. El aumento de la estabilidad de la enzima;

2. La posible reutilizacin del derivado, por lo que disminuyen los costes
del proceso.
3. La posibilidad de disear un reactor enzimtico de fcil manejo y control,
adaptado a la aplicacin de la enzima inmovilizada.

Los principales inconvenientes del proceso de inmovilizacin son:

1. La alteracin de la conformacin de la enzima respecto de su estado

nativo.
2. La gran heterogeneidad del sistema enzima-soporte donde pueden
existir distintas fracciones de protenas inmovilizadas con un diferente
nmero de uniones al soporte.
3. Siempre suele haber una prdida de actividad de la enzima durante la
movilizacin
4. El biocatalizador es ms caro que la enzima nativa.

En general, los mtodos de inmovilizacin se suelen clasificar en dos grandes

categoras: Retencin fsica y Unin qumica.

6.2. MTODOS DE INMOVILIZACIN DE ENZIMAS POR RETENCIN FSICA.

6.2.1. Atrapamiento:

Consiste en la retencin fsica de la enzima en las cavidades interiores

de una matriz slida porosa constituida generalmente por
prepolmerosfotoentrucruzables o polmeros del tipo poliacrilamida,
colgeno, alginato, carraginato o resinas de poliuretano. El proceso de
inmovilizacin se lleva a cabo mediante la suspensin de la enzima en
una solucin del monmero. Seguidamente se inicia la polimerizacin
 por un cambio de temperatura o mediante la adicin de un reactivo
qumico. El atrapamiento puede ser en geles o en fibras, que suelen ser
ms resistentes que los geles. En el primer caso, la enzima queda
atrapada en el interior de un gel, mientras que en el segundo caso la
enzima se encuentra ocluida dentro de las microcavidades de una fibra
sinttica. El atrapamiento, de gran sencillez desde el punto de vista
experimental, requiere poca cantidad de enzima para obtener derivados
activos. Como ventaja adicional, la enzima no sufre ninguna alteracin
en su estructura. De todas formas, el atrapamiento requiere un control
riguroso de las condiciones de polimerizacin, as como la
comprobacin de que la naturaleza qumica del proceso no altera los
grupos reactivos de la protena.

6.2.2. Inclusin en membranas: Dividida en dos tipos:

A. Microencapsulacin: En esta tcnica, las enzimas estn rodeadas de

membranas semipermeables que permiten el paso de molculas de
sustrato y producto, pero no de enzima. Estas membranas
semipermeables pueden ser permanentes (originadas por
polimerizacin interfacial) o no permanentes (generadas por
surfactantes, tambin llamadas micelas reversas). Las microcpsulas
obtenidas son de forma esfrica, con tamaos comprendidos entre 1 y
100 mm de dimetro. Mediante este mtodo se pueden encapsular
simultneamente una gran variedad de enzimas, clulas o
biomolculas, permitiendo que se lleven a cabo determinadas
reacciones que suceden en mltiples pasos.

B. Reactores de membrana: El desarrollo de reactores o sistemas que

contengan enzimas atrapadas ha despertado gran inters en la
industria. Estos reactores emplean membranas permeables al producto
final, permeables o no al sustrato inicial y obviamente impermeables a
 la enzima. Mediante una bomba se establece un flujo lquido de
sustrato que atraviesa el reactor.

En general, en esta metodologa, se procede inicialmente a la adsorcin

de la enzima sobre la membrana que formar el reactor. Esta adsorcin
se puede realizar de dos formas:

1. Mediante el paso de una solucin tamponada de enzima a travs de

la membrana;
2. Por contacto continuo de una solucin de enzima con la membrana.

6.3. MTODOS DE INMOVILIZACIN DE ENZIMAS POR UNIN QUMICA.

6.3.1. Unin a soportes.

Son los mtodos de inmovilizacin ms utilizados y de los que se

dispone de una mayor informacin. La eleccin del soporte y del tipo de
enlace resultan determinantes en el comportamiento posterior del
biocatalizador. Se debe procurar que la inmovilizacin incremente la
afinidad por el sustrato, disminuya la inhibicin, ampli el intervalo de pH
ptimo y reduzca las posibles contaminaciones microbianas. Adems el
soporte debe tener resistencia mecnica adecuada a las condiciones de
operacin del reactor y ser fcilmente separable del medio lquido para
que pueda ser reutilizado. Se han utilizado una gran variedad de
materiales como soportes para la inmovilizacin de numerosas enzimas.
Estos materiales difieren en tamao, densidad, porosidad y forma,
aunque generalmente nos los encontramos en forma de cilindro, hojas,
fibras y ms corrientemente en forma de esferas. Los soportes pueden
clasificarse en dos grandes grupos:

Soportes inorgnicos. Dentro de este grupo tenemos una gran variedad

de soportes, que pueden ser naturales (arcillas como la bentonita, piedra
pmez, slice, etc.) o materiales manufacturados (xidos de metales y
vidrio de tamao de poro controlado, vidrio no poroso, almina,
cermicas, gel de slice, etc.)

Soportes orgnicos. Se pueden clasificar en:

Polmeros naturales: a su vez divididos en:

Polisacridos (celulosa, almidn, dextranos, agar-agar,

agarosa, alginatos, quitina, chitosan, etc).
Protenas fibrosas (colgeno, queratina, etc). Polmeros
sintticos: divididos en: Poliolefinas (como el poliestireno)
Polmeros acrlicos (poliacrilatos, poliacrilamidas,
polimetacrilatos, etc.) Otros tipos (alcohol polivinlico,
poliamidas, etc).

Adsorcin.

En la adsorcin, la enzima se une a un soporte sin funcionalizar

mediante interacciones inicas, fuerzas de Van der Waals y por puentes
de hidrgeno. Los principales factores que influyen en la adsorcin, son:

1. El pH del medio: controla el nmero y la naturaleza de las

cargas que presenta la superficie de la protena y del slido;
2. La fuerza inica: al aumentar la fuerza inica se produce la
desorcin de la enzima, ya que los iones inorgnicos se unen
con ms fuerza al soporte que la protena;
 3. El dimetro de poro: debe ser aproximadamente dos veces el
tamao del eje mayor de la enzima;
4. La presencia de iones que acten como cofactores de la
enzima, ya que pueden incrementar la carga enzimtica del
derivado.

Como principales ventajas de este mtodo destacan:

1. Su preparacin sencilla,
2. Su bajo coste,
3. No hay cambios de especificidad enzimtica,
4. Los derivados son estables en medios de trabajo con bajo
contenido en agua.

Los inconvenientes de la adsorcin son principalmente:

1. La optimizacin de las variables que controlan la adsorcin,

2. Los derivados obtenidos son poco estables desde el punto
de vista mecnico,
3. La unin al soporte es dbil.

6.3.2. Unin covalente.

La unin covalente de una enzima a un soporte es quiz el mtodo de

inmovilizacin ms interesante desde el punto de vista industrial. La
metodologa de la unin covalente se basa en la activacin de grupos
qumicos del soporte para que reaccionen con nuclefilos de las
protenas. De entre los 20 aminocidos diferentes que se encuentran en la
estructura de las enzimas, los ms empleados para la formacin de
enlaces con el soporte son principalmente la lisina, la cistena, la tirosina y
la histidina, y en menor medida la metionina, el triptfano, la arginina y el
cido asprtico y glutmico. El resto de aminocidos, debido a su carcter
hidrfobo, no se encuentran expuestos hacia el exterior de la superficie
proteica, y no pueden intervenir en la unin covalente. Este mtodo
presenta las siguientes ventajas:

1. La manipulacin de los derivados inmovilizados es sencilla;

 2. La carga de enzima permanece constante despus de la
inmovilizacin;
3. Los derivados pueden utilizarse en reactores en continuo,
empaquetados, de lecho fluidizado o tanque agitado.
4. Una mayor resistencia a la desactivacin por el efecto de la
temperatura, de los disolventes orgnicos o del pH, al tener
estabilizada su estructura terciaria.

En cambio la inmovilizacin por enlace covalente tambin presenta una

serie de inconvenientes:

1.- Es necesario conocer la densidad de grupos activos por unidad de

superficie, ya que condiciona el nmero de uniones enzima-soporte y su
geometra, que puede ser distorsionante y conducir a derivados inactivos.

2.- El proceso de inmovilizacin puede alterar la estructura del centro

activo. Para evitar esta posible alteracin, se realiza la inmovilizacin en
presencia de un inhibidor que bloquee el centro activo.

3.- La inmovilizacin covalente no es aconsejable en aquellas enzimas

muy sensibles a cambios de pH, fuerza inica, etc.

6.3.3. Reticulado.

Tambin denominado entrecruzamiento o cross-linking, es una tcnica

que ha sido ampliamente utilizada en la estabilizacin de muchas
enzimas. El mtodo del reticulado consiste en uso de reactivos
bifuncionales que originan uniones intermoleculares entre las molculas
de enzima. Como reactivos bifuncionales se pueden emplear dialdehdos,
diiminosteres, diisocianatos, sales de bisdiazonio e, incluso, diaminas si
estn activadas con carbodiimida. El resultado del reticulado son enzimas
con enlaces intermoleculares irreversibles capaces de resistir condiciones
extremas de pH y temperatura. El co-reticulado, permite eliminar las
prdidas de actividad enzimtica debidas a efectos difusionales, mediante
 el entrecruzamiento de las enzimas con una protena sin actividad
enzimtica y rica en residuos de lisina (por ejemplo, la albmina bovina).
Un procedimiento mixto de inmovilizacin muy comn consiste en
inmovilizar la enzima por adsorcin sobre una resina de intercambio inico
o un soporte polimrico (con lo que se consigue una elevada carga
enzimtica) y posteriormente aadir el reactivo bifuncional.

Actualmente el mtodo ms novedoso de cross-linking consiste en la

cristalizacin de enzimas y su posterior reticulado con glutaraldehdo
(Cross-LinkedEnzymeCrystals o CLECs). El aumento de estabilidad se
basa en la obtencin de un entramado cristalino, donde las molculas de
enzima estn rodeadas exclusivamente por otras molculas de protena.
De esta manera la propia enzima acta como soporte, y su estructura
terciaria est estabilizada por las uniones covalentes intermoleculares. La
estructura cristalina posee canales microscpicos (20-50) que permiten
el paso de sustratos hasta el centro activo de la enzima donde se cataliza
la reaccin. Estos cristales pueden soportar temperaturas elevadas y pH
extremos, as como la accin de las proteasas. Esta tecnologa se ha
aplicado a enzimas muy diferentes, las cuales se han utilizado en la
obtencin de compuestos enatiomricamente puros y en la sntesis de
pptidos.

6.4. APLICACIONES DE LAS ENZIMAS INMOVILIZADAS.

Las aplicaciones ms importantes de las enzimas inmovilizadas son:

6.4.1. Biosensores.

Los biosensores se estn convirtiendo en una herramienta imprescindible

en medicina, en el control de calidad de los alimentos y en el control
medioambiental. En principio, se puede disear un biosensor para
cualquier tipo de compuesto que sea capaz de interaccionar
especficamente con un sistema biolgico. Generalmente, el biosensor
(Figura 5) contiene una molcula biolgica inmovilizada (enzimas, clulas,
anticuerpos) prxima a un traductor que, en contacto con el analito,
transformar la seal qumica producida en una seal elctrica o de otro
tipo (ptica, calorimtrica, acstica, etc.).

El empleo de los biosensores presenta las siguientes ventajas

1. la instrumentacin requerida es barata y sencilla,

2. el anlisis es muy sensible,
3. permite el uso de muestras con color o turbias que no se podran
medir con mtodos espectroscpicos.

6.4.2. En la fabricacin de alimentos

La fermentacin alcohlica es un ejemplo conocido de los procedimientos

en que se efectan alteraciones enzimticas, tanto cuando se agrega
alguna enzima como cuando se aade algn microbio vivo que las
contiene (por ejemplo, levaduras). Muchos productos que se consumen
en la actualidad se fabrican por un proceso fermentativo, tales como el
yogur, las bebidas alcohlicas, el vinagre, los embutidos, etc. Por ejemplo,
la elaboracin de vinagre con alcoholes es un proceso enzimtico
producido por un microbio vivo (Acetobacter aceti). El alcohol es oxidado y
convertido en cido actico con oxgeno de la atmsfera. Si bien, aislada
de las bacterias, la enzima cataliza igualmente la oxidacin, el desarrollo
del producto se realiza con el microorganismo entero, por resultar ms
econmico.

En la fabricacin de queso, por ejemplo, se utiliza la enzima renina para

producir la coagulacin de las protenas de la leche (casena), que luego
se trata para convertirla en queso. Si bien, originariamente, esta enzima
era extrada del cuajo de terneros, hoy en da se est utilizando enzima
quimosina de origen recombinante.

Otra de las enzimas ampliamente utilizadas es la lactasa, que transforma

la lactosa (un azcar) en una mezcla de sus monmeros glucosa y
galactosa con un sabor ms dulce. As, se refina el producto y se
concentra en una especie de jarabe con un sabor parecido al de la miel,
ya ampliamente utilizado en el sector de confitera industrial.

6.4.3. En la industria textil

En la fabricacin de telas, se realiza en proceso llamado lavado

enzimtico. En ste se realiza la bio-preparacin del algodn en rama
utilizando ciertas enzimas. As, se remueven del algodn solamente los
componentes necesarios y se evita o se reduce el dao causado a la
celulosa, utilizando, adems, condiciones de proceso ms favorables
para los operarios, las mquinas y el medio ambiente.

Numerosos estudios realizados muestran que un tratamiento usando

solamente pectinasa, seguido por un enjuagado en agua caliente, es
capaz de hacer que la fibra de algodn se vuelva hidrfila y absorbente,
facilitando su posterior utilizacin.

Entre las enzimas utilizadas en la industria textil se pueden nombrar:

Proteasa, usada en el tratamiento de fibras protenicas (seda y lana);

Catalasa, para la eliminacin de perxido de hidrgeno despus del
blanqueado y antes del teido; Lacasa, en la oxidacin enzimtica del
ndigo; Peroxidasa, en la oxidacin enzimtica de colorantes reactivos no
fijados y Lipasa para el desengrasado.

6.4.4. En la industria de detergentes

Las enzimas empleadas en detergentes se encuentran disponibles en

forma lquida y granular. stas actan sobre los materiales que
constituyen las manchas, facilitando la remocin de los mismos y de
forma ms efectiva que los detergentes convencionales. Entre las
enzimas utilizadas se pueden encontrar: proteasas (producidas
principalmente por Bacillus licheniformis o B. Amyloliquefaciens y
Aspergillus flavus) que aceleran la degradacin de protenas y producen
pequeos pptidos o aminocidos individuales los cuales pueden ser
fcilmente removidos de los tejidos.

Las amilasas provenientes de Bacillus licheniformis, que degradan el

almidn, sacando manchas de chocolate y papa, entre otros. Las lipasas,
que rompen los lpidos por hidrlisis, sacando manchas de grasa y aceite.
Las celulasas producidas por el hongo Humicola insolens son utilizadas
para remocin de suciedad, y para restaurar la suavidad y color de fibras
de algodn.

6.4.5. En la industria del papel

Al igual que en el tratamiento de telas, en la fabricacin de papel, se

utilizan las enzimas celulasas para degradar la celulosa, componente
principal de la madera.

Adems de la celulosa, la madera contiene lignina, un compuesto que

debe ser eliminado en la fabricacin de papel. La eliminacin se realiza
con compuestos qumicos que son contaminantes del medio ambiente.

La elucidacin de los mecanismos enzimticos implicados en el proceso

de biodegradacin de la lignina est proporcionando nuevas herramientas
biotecnolgicas para un mejor aprovechamiento de la biomasa vegetal en
sectores industriales, tales como la produccin de pasta de papel y la
obtencin de biocombustibles.

6.4.6. Aplicacin de las enzimas en anlisis clnicos

Las enzimas se emplean como reactivos estndar en los laboratorios para

el diagnstico de enfermedades, para el control y el seguimiento de
enfermedades y de la respuesta del paciente hacia la terapia seguida, y
para la identificacin y control de la concentracin de drogas o sus
metabolitos en la sangre u otros fluidos corporales. Las tcnicas de
inmunoanlisis enzimtico (ELISA) representan un nuevo e importante
avance al asociar anticuerpos especficos a enzimas como la peroxidasa
o la galactosidasa cuya unin genera una reaccin colorimtrica (se
observa color) proporcional a la extensin de unin del anticuerpo.

Las enzimas se emplean rutinariamente para diagnosticar enfermedades

hepticas, miocrdicas, pancreticas y prostticas, anemias, leucemias,
distrofia muscular, tumores y toxemias del embarazo.

Las tcnicas enzimticas tambin se utilizan en la deteccin de drogas,

anlisis de antibiticos, deteccin de antgenos o anticuerpos, o en la
deteccin de enzimas y metabolitos en los fluidos intracelulares. Estas
tcnicas son generalmente ms rpidas, especficas ya baratas que otros
mtodos de deteccin como el inmunoanlisis, los anlisis fotomtricos,
cromatogrficos.

6.4.7. Uso de enzimas como productos mdicos y farmacuticos

A diferencia de otros usos industriales para las enzimas, las aplicaciones

mdicas y farmacuticas de las mismas requieren generalmente
pequeas cantidades de enzimas muy purificadas. Esto se debe a que si
el destino de una enzima o de un producto obtenido por mtodos
enzimticos es su administracin a un paciente, resulta evidente que el
preparado debe contener las menores cantidades posibles de material
extrao para evitar probables efectos secundarios.

Uno de los productos obtenidos mediante el uso de enzimas son los

aminocidos. Si bien se pueden sintetizar empleando un proceso qumico,
el resultado es una mezcla de dos tipos distintos (D y L ismeros). Puesto
que solamente el L-ismero es biolgicamente activo, la mezcla debe ser
separada en sus dos componentes.

Adems de aminocidos, las enzimas son utilizadas para la produccin de

antibiticos semi-sintticos. Las penicilinas semisintticas son los
principales productos farmacuticos obtenidos por tecnologa enzimtica.
Tambin se utilizan enzimas en la produccin de esteroides. Los
esteroides se utilizan en un gran nmero de preparados farmacuticos
(por ejemplo en los antinflamatorios), por lo que los procesos empleados
en la produccin de estas sustancias presentan una considerable
importancia econmica.

6.4.8. USO DE ENZIMAS PARA GENERACIN DE ENERGA

Otra aplicacin biotecnolgica de las enzimas es la produccin de

energa, a partir de fuentes orgnicas en vez de combustibles fsiles, no
renovables.

Cada ao crecen unos 200 mil millones de toneladas de biomasa

(madera, cereales, etc), de las cuales se usan slo un 3%. Por lo tanto,
este rubro ofrece un enorme potencial que puede ser aprovechado. Un
ejemplo clsico de biocombustible es el alcohol obtenido por fermentacin
de material rico en azcares y almidn, o de residuos orgnicos como los
forestales. El principal obstculo para la viabilidad de esta propuesta es el
costo, puesto que el petrleo sigue siendo ms barato. Sin embargo, los
avances tecnolgicos permitirn en un futuro aumentar el desarrollo de
estos productos biodegradables.

La tecnologa enzimtica tiene como objetivo superar aquellos

inconvenientes que puedan retrasar la aplicacin de las enzimas en
procesos a escala industrial. Esta rea tiene aplicaciones desde tiempos
remotos, y actualmente se utiliza en diferentes industrias, ya que implica
la utilizacin de sistemas enzimticos diversos que optimizan el
procesamiento en la obtencin de detergente, aditivos alimenticios,
productos qumicos y farmacuticos. La tecnologa enzimtica se presenta
como alternativa biotecnolgica para que las industrias desarrollen
productos de calidad homognea, aprovechen ptimamente sus materias
primas, aceleren sus procesos de produccin, minimicen desperdicios y
disminuyan el deterioro del medio ambiente.
BIBLIOGRAFIA

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http://biologicas.ucm.es/data/cont/docs/2-2013-02-10-tres17.pdf
http://biotecnologiaequipo5.blogspot.com/p/biotecnologia-enzimatica-e.html
http://docencia.izt.uam.mx/sgpe/files/users/uami/sho/Tema_10_Biotec_Enzimas.pdf
http://www.cyted.org/cyted_innovacion/forum/2011/ponentes/ponencia_p13.pdf
http://observatorio.bioemprende.eu/index.php?option=com_content&view=category&layou
t=blog&id=62&Itemid=85&lang=es
http://www.porquebiotecnologia.com.ar/adc/uploads/pdf/Limpiando_ropa_enzimas.pdf
http://blogs.creamoselfuturo.com/bio-tecnologia/2010/06/08/biotecnologia-enzimatica/
2. REAL:
Revista Factores de riesgo hoy. Laboratorios Phoenix. Numero 2. Talleres Grficos
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Raquel Osatinski, Luis Garnek. Revista de la Asociacin Bioqumica Argentina. Ao 1997.
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Ao 1997.
Lorena L. Enzimologa Clnica. Ao 1990. 5. Smith-Thier. Fisiopatologa Clnica. Editorial
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