Cmo

se estudian las clulas?

 EL ESTUDIO DE LAS CLULAS

CITOLOGA BIOQUMICA GENTICA

 Estudio de la Clula
1- Microscopa

2- CulDvos Celulares

3- Fraccionamiento Celular

4- Puricacin Protenas por
columnas y electroforesis
 1- Microscopa
Microscopa pDca:
Campo claro
Contraste de fase
Contraste diferencial de interferencia
Fluorescencia
Confocal

Microscopa Electrnica:
Transmisin
Barrido


Tamaos relativos de la clula y sus componentes
 Microscopio ptico

En un microscopio
compuesto la imagen
desde el lente objeDvo
es magnicada
nuevamente por el
lente ocular.

La magnicacin total
=lente objeDvo lente
ocular
Las muestras deben ser muy delgadas para que puedan ser
atravesadas por por las fuentes luminosas y a veces hay qie
teirlaspara mejorar el contraste

BIO 141c
Corte de Piel Humana Teida con Hematoxilina y
Eosina
Visualizacin de clulas mivas
con Microscopio pDco
 Microscopa de Fluorescencia

filtro permite el paso de luz emitida

por fluorescena 520 y 550 nm

espejo refleja luz bajo 510nm

y transmite sobre 510 nm

filtro de 450 a 490 nm

Microscopa confocal
Microscopia de epifluorescencia
 Inmunocitoqumica Indirecta: con
anDcuerpos acoplados a uorforos

Antgeno A Primer anticuerpo Segundos anticuerpos

inmobilizado en conejo contra acoplados dirigidos
antgeno A contra anticuerpos de
conejo
Fluorforos: Molculas Fluorescentes
(Fluorescena, Rodamina)
Microscopio Electrnico de Transmisin (MET)
Organizacin Subcelular en Clulas
Eucariontes y Procariontes

1 m
Microscopa Electrnica de Virus Bacterifago T4
Estudio del virus y sus posibles aplicaciones

DiagnsDco clnico

Informacin sobre la
infeccin de tejidos

Informacin sobre
posibles tratamientos


Macromolculas
Inmunohistoqumica:
con anDcuerpos
acoplados a par`culas
de oro
Microscopa Electrnica de Barrido
Superficies vegetales observadas con MEB
 Clulas animales

Estructuras supramoleculares
Congelamiento y fractura
las dos caras de la fractura

citoplasma superficie
partculas
intramembrana externa
hielo mem.
plasm.
Microscopa electrnica de supercies
de membranas

BI 141c
M.E. de Transmisin vs M.E. de Barrido
Aplicaciones de microscopia electrnica en otras
reas: biomedicina

Clula normal Clula transformada

Radiacin
Sustancias qumicas carcinognicas
Virus tumorales
Aplicaciones de microscopia electrnica en otras
reas: materiales

Imgenes tomadas con un microscopio electrnico de barrido (SEM) de micropilares

comprimidos de materiales multicapa de Al/SiC a nanoescala:
(a) a temperatura ambiente; y (b) 100 C.
 Comparacin entre Microscopa ptica,
Electrnica de Transmisin y Electrnica de Barrido
Asumiendo que todos los dems factores son los
mismos, los microscopios electrnicos Denen mayor
poder de resolucin que los microscopios de luz porque:

A) la longitud de onda de un haz de electrones es
mucho mayor que la longitud de onda de la luz
visible

B) los microscopios electrnicos Denen ms lentes

C) la longitud de onda de la luz visible es mayor que la
longitud de onda de un haz de electrones

E) los microscopios electrnicos son microscopios
compuestos
 2- CulDvo celular
Propagacin de clulas fuera del organismo

Tipos de culDvos celulares:

1) CulDvo primario
2) Lneas celulares
CulDvo celular
Clulas animales

Ventajas:
1) El ambiente celular se puede manipular
2) Dpo celular bien denido
3) se pueden obtener grandes canDdades de
clulas
4) se pueden estudiar muchas funciones
celulares
 Clulas inmortales HeLa
CulDvadas a parDr de un tumor crvico-uterino
Primeras clulas inmortales culDvadas in vitro
Esenciales en el desarrollo de la vacuna contra la polio
Viajaron al espacio para estudiar que ocurre en gravedad cero
Se uDlizan, hasta el da de hoy en experimentos relacionados con
clonamiento de genes, mapeo genDco y ferDlizacin in vitro.

Henriefa Lacks
3- Fraccionamiento celular : separacin de
organelos

ComparDmentos
Intracelulares en una
Clula HepDca
Puricando organelos: fraccionamiento
sub-celular

1. Puricacin celular, Seleccionador

celular (Cell sorter), culDvo celular.
2. Ruptura celular u homogenizacin
mecnica, sonicacin o shock osmDco.
3. Fraccionamiento subcelular por
centrifugacin diferencial
4. Caracterizacin por acDvidad de enzimas
marcadoras y ME.
 Homogenizacin
Romper las clulas con un homogenizador vidrio o por sonicacin o shock osmDco

Cortar el tejido en un buer isotnico en fro

(mezcla agua-hielo). La baja temperatura deDene
las reacciones enzimDcas. La isotonicidad
manDene la integridad celular y el buer evita
cambios de pH.
 Centrifugas
Producen la fuerza que se requiere para la sedimentacin:
fuerza centrfuga

Ultracentrfuga
 Centrifugacin Diferencial
Par`culas en suspensin se pueden separar en base a su
velocidad de sedimentacin o por sedimentacin al equilibrio.

Velocidad de sedimentacin: tamao

forma y densidad

Centrifugacin
Diferencial
Sedimentacin al equilibrio: Equilibrio de
densidad
Fraccionamiento
subcelular Homogenizado de
clulas

por velocidad de Centrifugacin a baja velocidad

sedimentacin
El pellet o sedimento contiene
Clulas sin romper y
Ncleos

El sobrenadante se centrifuga a velocidad media

Tamao, forma El pellet contiene

Mitocondrias lisosomas y
peroxisomas

y densidad ElEl
sobrenadante sese
sobrenadante centrifuga aa
centrifuga alta velocidad
alta velocidad

El pellet contiene
Microsomas y vesculas
pequas

El sobrenadante se centrifuga a muy alta

velocidad (ultracentrifuga)

El pellet contiene
Ribosomas virus o
molculas muy grandes

Sedimentacin al Equilibrio

homogenizado

Durante la
centrifugacin los
organelos migran
por el gradiente
hasta que
encuentran una
densidad igual a
la gradiente se la de ellos
centrfuga a 40.000
rpm por 2 h
Se fabrica una El homogenizado
gradiente de se pone en la
parte de arriba de
densidad con
la gradiente
sacarosa
 Recoleccin de Fracciones

Se colectan fracciones de la gradiente

Se determina la actividad de enzimas marcadoras y la presencia de protenas

 Caracterizacin: Ensayos enzimDcos para
determinar pureza y funcin
Membrana plasmDca: Na/K ATPase
Ncleo: DNA
Golgi: UDP-galactosil transferasa
Mitocondria: monoamina oxidasa, citocromo
oxidasa, etc.
Lisosomas: fosfatasa cida
Peroxisomas: catalasa
Re`culo Endoplsmico (rugoso): glucosa-6-
fosfatasa

ChrisIan de Duve 1950
4- Puricacin de protenas
Separacin de protenas por tamao:
cromatograoa de ltracin en gel
Protena grande

Protena pequea

Aplicacin El buffer
muestra a la arrastra las Coleccin
columna protenas a de
travs de la fracciones
columna

Partcula de gel
 Separacin de protenas por carga:
cromatograoa de intercambio inico

Protena cargada
negativa
Protena cargada
positiva
Elucin de las
protenas
Se aplica la Se colectan negativas con
muestra de las protenas
protenas no-unidas
a la (positivas)
columna

protenas
unidas
(negativas)

Partcula de gel cargada positiva

Separacin de protenas por la unin especca a otra
molcula: cromatograoa de anidad

Se aplican las
protenas a pH 7
(unin)
Protena
reconocida por Elucin
el anticuerpo Lavados con
buffer
Protena pH 3
no-reconocida
por el anticuerpo

Anticuerpo
Separacin de protenas en geles

Separacin de Protenas por Electroforesis

Detergente
Denaturante
SDS
Visualizacin de protenas separadas por
electroforesis
 Como se purican las protenas?

Filtracin en gel: par`culas con poros de tamaos denido separa
en base a la masa (& forma). Las molculas de un tamao
determinado entran en los poros a medida que pasan a travs de la
columna y se retrasa su salida de la columna.
Intercambio inico: par`culas con carga denida, separa en base a
la carga. Se despegan con gradiente de sal o pH
Anidad: par`culas unidas a un ligando. Si se usa un anDcuerpo, se
llama inmunoprecipitacin.
Hidrofobicidad: par`culas con cadenas de carbono, separa en base
a la hidrofobicidad, se eluye con un buer hidrofbico.
Electroforesis separa por tamao.
SDS-PAGE es muy efecDva, pero requiere denaturar la muestra de
protenas. Electroforesis bidimensional.