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Etude exprimentale de

la phosphatase alcaline
Enzymologie 2

Cabaret Laurine
Martin Laetitia
Groupe C2
01/10/2010
I. Introduction

Le but de cette manipulation est de dterminer les paramtres cintiques dune enzym
dtudier linfluence de la concentration en substrat et de la prsence dun inhibiteur su
vitesse de raction.

Dans ce TP, nous allons utiliser une prparation commerciale de phosphatase alcaline d
veau. Il sagit dune enzyme alcaline 2 substrats, capable dhydrolyser les monoesters
phosphoriques selon la raction suivante :

R-O-PO3 2- + H2O R-OH + HPO4 2-

II. Principe

Afin de suivre la raction enzymatique, nous allons raliser un dosage spectrophotomt


des produits apparus dans le milieu, lorsque lenzyme est en prsence de son substrat.
faciliter le dosage, nous allons utiliser comme substrat le P-nitrophnolphosphate (PNPP
qui, aprs action de lenzyme, libre un produit color (jaune) : le P-nitrophnol (PNP)
directement dosable 410nm.

2-
+ 2O
H 4 HPO
+

PNPP incolore

Le principe du dosage spectrophotomtrique est de mesurer labsorbance dune subst


colore, au cours du temps. Le spectrophotomtre est reli un dispositif denregistrem
(ordinateur), qui nous permet de visualiser lvolution de labsorbance dans un interval
temps (3min), et donc de dterminer la vitesse initiale de la raction enzymatique grc
pente de la droite obtenue, dans les temps initiaux (DO/min).

De plus, pour connatre la quantit de produit apparu dans le milieu, on ralise une gam
talon de tubes contenant diffrente concentration (connues) de produit. On trace la dr
DO = f ([PNP]). En reportant labsorbance dune solution de concentration inconnue, on
peut en dduire sa concentration.

III. Manipulations prliminaires

Afin de raliser la gamme talon et les milieux dincubation, nous devons pralablemen
prparer les solutions de substrats de concentrations diffrentes.

1) Solution de PNPP :
Nous voulons prparer 6 tubes de solution de PNPP 2,5 mM, 1mM, 0,5mM, 0,25mM,
0,167mM, 0,125mM, partir dune solution mre de 5mM. Pour cela, nous effectuons u
dilution en cascade.

10mL 8mL 10mL 10mL 13,4mL 5mL

5mM 2,5 mM 1mM 0,5mM 0,25mM 0,167mM


[PNPP] 5mM 2,5mM 1mM 0,5mM 0,25mM 0,167mM0,125mM
(umol /L)
Solution 20 10 8 10 10 13,4 5
mre
(mL)
H20 (mL)0 10 12 10 10 6,6 15

Calcul pour la premire dilution :

C1 V1 = C
2 V2

V1 = 20mL

Donc V
1 = (C
2 V2 )/ C1 V= (0,0025 * 0,02) / 0,005 = 10 mL

Il faut donc prlever 10mL de la solution mre, et ajouter 10mL deau pour la diluer 2 fo

2) Solution de glycrophosphate :
Comme prcdemment, nous voulons prparer 2 tubes de solution de glycrophosphat
2,5mM et 1mM, partir dune solution mre 5mM.

7mL 4mL

5mM 2,5 mM 1mM

[GRO-P] 5mM 2,5mM 1mM


Solution mre (mL)
10 7 4
H20 (mL) 0 7 6
Calcul pour la premire dilution :

C 1 V1 = C
2V2

Vf1 = 10mL

Donc V
1= ( 2
CV2)/ C1 V= (0,0025 * 0,0014) / 0,005 = 7 mL

Il faut donc prlever 7mL de la solution mre et ajouter 7mL deau pour la diluer 2 fois.

IV. Etude cintique de la libration du produit

1) Gamme talon n1 :
Nous prparons la gamme talon puis nous mesurons la DO dans chaque tube 410 nm
longueur donde laquelle le produit (PNP) absorbe. Nous traons, ensuite, la droite ta
DO corrige = f (quantit de PNP)

CF tableau 1 et figure 1a

Calcul de la quantit de produit dans les tubes :

n = CV

Tube 1:=n 0 mole


-3 -3
Tube 2: n= (0,5.10
. 0,025.10
)= 0,0125 mole (C= 6, 25 mole/ L)
-3 -3
Tube 3: n= (0,5.10
. 0,05.10) = 0,025
mole (C=12,5 mole/ L)
-3 -3
Tube 4: n= (0,5.10
. 0,1.10) =0,05 mole
(C=25 mole/ L)
-3 -3
Tube 5: n = (0,5.10
. 0,15.10) = 0,075mole
(C=37,5 mole/ L)
-3 -3
Tube 6: n = (0,5.10
. 0,2.10) = 0,1
mole (C=50 mole/ L)

2) Milieux dincubation :
Cf tableau 2

Calcul de [PNPP] dans chaque tube (A G) :

On effectue deux dilutions successives du PNPP: On en ajoute 0,5 mL dans 3,5 mL de m


ractionnel, puis on prlve 1,75 mL de ce milieu dans lequel on rajoute 0,25mL denzy
Premire dilution (milieu A) :

[PNPP] = (C
PNPP.VPNPP) / V
total

[PNPP] = (0,125.0,5) / 3,5 = 17,85 M

Deuxime dilution (cuve A):

[PNPP] = (C
PNPP.VPNPP) / V
total

-3
[PNPP] = (17,85.10
. 1,75)/2 = 15,6 M

On procde de la mme manire pour les autres milieux et on obtient:

[PNPP]B = 20,90 M
[PNPP]C = 31,25 M
[PNPP]D = 62,5 M
[PNPP]E = 124,95 M
[PNPP]F = 324,71 M
[PNPP]G= 625,0 M

Calcul de la concentration de lenzyme dans les milieux ractionnels:

Cenz Venz = C
tubeVtube

Ctube= (0,1 . 0,25)/ 2 = 0,0125 mg/mL = 12,5 g/mL

Maintenant, nous mesurons les variations de la DO dans chaque milieu dincubation, au


cours du temps (3minutes), laide dun spectrophotomtre et dun systme
denregistrement. Nous obtenons diffrentes droites DO = f (t). La pente de chaque d
DO/min, reprsente la vitesse de la raction, aux temps initiaux, pour une concentrati
substrat donne.

Cf tableau 2 figure 2

Commentaire :

Daprs les courbes obtenues, on peut voir que la DO augmente au cours du temps, et
faon linaire pendant environ 1min. Ce qui signifie que la quantit de produit dans le
milieu augmente.
De plus, on remarque que plus la concentration en substrat est grande (croissante de A
plus la pente de la courbe, dans les temps initiaux, est importante. Ainsi, la vitesse
dapparition du produit dans le milieu, augmente avec la concentration en substrat.

Ensuite, pour un temps > 1minute, Il ny a plus de relation linaire (pour les milieux A,
D, E). En effet, la quantit de substrat dans le milieu, diminue au fur et mesure de la
raction. Ainsi, il y a de moins en moins de produit form donc labsorbance naugmen
plus de faon linaire.

Pour F et G, on remarque que pour un temps > 1min, la courbe reste linaire. Effectivem
la quantit de substrat est encore suffisante pour que la raction seffectue une vitess
initiale, maximale.

Nous voulons dterminer [PNP]/min, c'est--dire la vitesse dapparition du produit pa


de la pente DO/min. Pour cela, on reporte la valeur de la pente de chaque courbe sur
gamme talon n1, et on regarde quelle quantit de produit cela correspond.

On obtient :

DO/min 0,0126 0,108 0,2646 0,3762 0,3792 0,4128 0,4295


[PNP]/min 0,62 5,62 17,2 23,12 23,74 25,0 26,25
mole/L/min

V. Influence de la concentration en substrat su


la vitesse de la raction

1) Etude graphique de la vitesse de raction en fonction de [PNPP] :


Grce aux vitesses initiales dtermines prcdemment, on trace la courbe de Mickaeli
Menten : Vi = f([PNPP]).

Reprsentation graphique :
On obtient alors des valeurs approximatives de Vmax et Km :

Vmax = 0,411 DO/min

Si on reporte cette valeur sur la gamme talon n1, on trouve Vmax = 24,9 mole/min

Km = 23,4 mole/L

Ces valeurs ne sont que des estimations, la reprsentation de Mickaelis-Menten tant u


courbe, il y a une importante marge derreur lors de la dtermination de Vmax.

De plus, le Km est li la valeur de Vmax, donc la marge derreur se rapporte galeme


valeur du Km.

Ainsi, il est ncessaire de linariser cette reprsentation, afin de diminuer ces incertitud
et obtenir des valeurs beaucoup plus prcises. Nous allons donc utiliser les reprsentat
de Lineweaver-Burke, et Hanes-Woolf.

2) Dtermination de la vitesse maximale et de la constante de Mickae


La cintique de la raction suit lquation de Mickaelis- Menten : la vitesse initiale pour
certaine concentration en substrat (PNPP) est de la forme :

Vi =

Et daprs cette quation, on peut en dduire la reprsentation de Lineweaver Burke :

= = +

= . +

Reprsentation graphique :
A partir de la reprsentation de Lineweaver-Burke, on peut en dduire celle de Hanes-
Woolf :

= . + = . +

=[PNPP]. +

Reprsentation graphique :

Les reprsentations graphiques de ces deux relations, sont prfrables celle de Micka
Menten, car elles sont linaires et donc plus prcises pour la dtermination des constan
cintiques Vmax et Km, dune raction enzymatique.

On obtient donc les rsultats suivant :

Lineweaver-Burke :
- Vmax =
- Km =

Hanes-Woolf :
- Vmax = 27,2 mole/L/min
- Km = 34,42 mole/L

Pour la reprsentation de Hanes-Woolf, nous avons enlev le premier point de la courbe


il ne correspondait pas au rsultat attendu, il faussait la droite.

Cf figure 4b et 4b

3) Ordre de la raction :
Daprs la courbe de Mickaelis-Menten, pour des faibles concentrations en substrat (de
0,3 M), on a une courbe linaire.
[PNPP] >> Km donc
, V = Vm/Km)
( . [PNPP]

Or Vm/Km = constante, donc V = K[PNPP]

La vitesse est proportionnelle la concentration en substrat dans le milieu, donc


raction est dordre 1.

Pour des concentrations en substrats importantes (de 200 500 M), on a un plateau.

[PNPP] << Km donc, V = Vmax


La raction est dordre 0

4) Dtermination de lactivit spcifique de lenzyme :


Lactivit spcifique As est la quantit de substrat convertie en produit par unit de tem
au cours dune raction enzymatique. Elle est exprime en mole/min.

Activit Enzymatique AE = Vmax


cuve . V
+
ASZn2 = (Vmax cuve
. V) / (menz)

+
ASZn2 = (27,2. 0,002) / (0,1 . 0,25) = 2,2 mol/min/mg
2+
Or lactivit spcifique obtenue en prsencedansde Mgles conditions optimales est cinq
2+
fois plus forte que lactivit spcifique en prsence
. de Zn

ASMg2+= AS
Zn2+. 5 = 2,2 . 5 = 11,0 U/mg

Lactivit spcifique que nous trouvons est lgrement plus leve que celle donne pa
fabriquant.

VI. Etude dun phnomne de comptition entr


deux substrats

1) Gamme talon n2
Nous ralisons une deuxime gamme talon de tube, puis nous mesurons la DO 410n

Cf tableau 4 et figure 1b

Calcul de la quantit de PNP dans chaque tube :

Tube 1: n= 0 mol
Tube 2: n=PNP
(C. VPNP) = (0,5 . 0,2) = 0,10 mole
De la mme manire, on obtient :

Tube 3: n= 0,20 mole


Tube 4: n= 0,30 mole
Tube 5: n= 0,40 mole
Tube 6: n= 0,50 mole

Calcul de la concentration de PNP dans chaque tube :

Tube 1: C= 0 mol/L
Tube 2: C=PNP
(C. VPNP) / Vtot = (0,5 . 0,2) / 5 = 20 mol/L

De la mme faon, on obtient :

Tube 3: C= 40 mol/L
Tube 4: C= 60 mol/L
Tube 5: C= 80 mol/L
Tube 6: C= 100 mol/L

2) Comptition entre le glycrophosphate et le PNPP


Cf tableau 5

Dans cette partie, nous allons tudier linfluence dun inhibiteur : le glycrophosphate (GRO-P)
vitesse de la raction enzymatique. Pour cela, nous allons prparer des sries de tubes de
concentration en inhibiteur et en substrat (PNPP) diffrente. Nous allons ensuite, lancer la rac
enzymatique dans chaque tube, pendant 3min exactement, afin de pouvoir comparer les vitess
avec celles obtenues prcdemment.
Enfin, nous mesurons la DO 410nm.

Calcul des concentrations en Glycrophosphate dans les tubes :

2V2 C1 = C
C1V1 = C 2V2/V1

Srie A : C = (0,001 . 0,001)/0,004 = 0,25mM


Srie B : C = 0,625mM
Srie C : C = 1,25mM

Calcul des concentrations en PNPP dans les tubes :

2V2 C1 = C
C1V1 = C 2V2/V1

Srie 1 : C = (0,0005 . 0,000125)/0,004 = 15,6 mol/L


Srie 2 : C= 20,90 mol/L
Srie 3 : C =31,25 mol/L
Srie 4 : C= 62,5 mol/L
Srie 5 : C= 124,95 mol/L
Srie 6 : C= 312,5 mol/L
Srie 7 : C= 625 mol/L

Dtermination de la vitesse de raction :

Aprs larrt de la raction, nous mesurons labsorbance de chaque tube 410nm.

Afin de dterminer la quantit de produit libr (en mole/L), on reporte les valeurs de
DO sur la gamme talon n2. Pour obtenir la vitesse de la raction, on divise ces valeur
le temps dincubation (3min). On a alors, une vitesse en mole/L/min.

Cependant, il faut dabord calculer la concentration de PNP libr, avant


2HPO
lajout
4, de NA
qui a permis de stopper la raction enzymatique. On multiplie alors cette concentration
le coefficient de dilution d = 5/4.

d = volume total/volume sans


2HPONA
4

CPNP = C . 5/4
PNP (NA2HPO4)

CPNP (A1)= 7,5 . 5/4 = 9,4 mole/L

Cest la valeur de la concentration non dilue, que lon divise par le temps dincubation.

V(A1) = 9,4/3 = 3,1 mole/L/min

On procde de la mme manire pour les autres essais.

Nous traons, ensuite, les courbes V= f ([PNPP] (figure 3) pour chaque concentration de
glycrophosphate.

Commentaire :

Sur la figure 3, on observe que la vitesse de raction sans inhibiteur est suprieure ce
avec inhibiteur. Effectivement, pour une mme concentration en substrat (124,9 mole
la vitesse est de 23,74 mole/L/min sans inhibiteur, alors quelle est de 12,5 mole/L/m
avec une concentration en inhibiteur de 0,25mM. Ainsi, on peut dire, que le
glycrophosphate diminue la vitesse dhydrolyse du substrat.

De plus, on remarque, que plus la concentration en inhibiteur est importante, plus la vit
de raction est faible. On voit que pour la mme concentration de substrat que
prcdemment, la vitesse est de 12,5 mole/L/min pour une concentration de
glycrophosphate de 0,25mM, et de 3,73 mole/L/min pour une concentration de 1,25m
Pour conclure, la vitesse de raction est diminue par la prsence dinhibiteur, et dauta
plus que sa concentration est importante.

Afin de dterminer les paramtres cintiques (Vmax et Km), on linarise la reprsentati


Mickaelis-Menten, en utilisant lquation de Lineweaver-Burke (figure 4a).

[PNPP] 15,6 20,9 31,3 62,5 124,9 312,5 625


En
mole/L
1/[PNPP] 0,064 0,048 0,032 0,016 0,008 0,0032 0,0016

Commentaire :

Sur la figure 4a, on peut voir que chaque courbe se coupe en un mme point sur laxe des ordo
On a alors une valeur de (1/Vmax) identique pour chacune.

En revanche, la valeur de ( -1/Km) diffre en fonction de la concentration en inhibiteur : On


remarque que plus la concentration en glycrophosphate est grande, plus( -1/Km) est petit don
le Km est grand.

Ainsi, linhibiteur a une influence sur le Km de la raction, mais pas sur la Vitesse maximale. On
donc en dduire, que le glycrophosphate agit comme un inhibiteur comptitif, cest--dire qu
prend la place du substrat naturel de lenzyme. Celle-ci prsente, alors, une plus faible affinit
son substrat (PNPP) : le Km augmente.

Schma ractionnel dune inhibition comptitive :

Km kcat
E+S ES EP= [ES] + [EI] + [E]
[E]totale

Ki

EI

Sans inhibiteur[GRO-P] [GRO-P] [GRO-P]


=0,25mM =0,625mM =1,25mM
Vmax en
mole/L/min
Km en mole/L
Dtermination des paramtres apparents :

Daprs lquation de Mickaelis-Menten, on cherche lexpression thorique de la fonction


1/V =f ( 1/[PNPP]) :

Vi = = Avec = +1

= = ( . )+

=( . )+

Pour 1/[PNPP] = 0, on a 1/V = 1/Vmax


Ce qui correspond lintersection de chaque droite avec laxe des ordonnes.

Pour 1/V = 0 on a,

( . )+ =0

=
Ce qui correspond lintersection des droites avec laxe des abscisses.

Nous pouvons en dduire le Km apparent, on trouve :

Kmapp = Km . =

Serie -1/Km app Km app en mole/L


A
B
C
On sait que Km
app =

On veut dterminer le KI, la constante de dissociation de lenzyme pour linhibiteur.

KI =

Pour la srie A : KI =

Srie [GRO-P] en mmole/L Kmapp en mole/L Km en mole/L


A 0,25
B 0,625
C 1,25

Reprsentation de Dixon

A partir de la relation en double inverse, on veut trouver la relation de Dixon :

=( . )+

= . +

=( . [GRO-P]+ ( . + 1))

On obtient une quation de droite du type y= ax + b. Il sagit de la reprsentation de Dixon.


Nous traons donc les droites 1/V = f ([GRO-P] (figure 5) pour chaque concentration en PNPP.

Commentaire :

Sur la figure 5, on observe que les droites convergent en un seul et mme point de
coordonnes (-Km, 1/Vmax).

Dmonstration : Cf annexes
On peut donc en dduire les paramtres cintiques Km et Vmax.

Km =
Vmax =

VII. Conclusion