"Extração, Purificação e Isolamento de Antocianinas

i
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

INSTITUTO DE QUMICA
DEPARTAMENTO DE QUMICA ANALTICA
GRUPO DE PESQUISAS EM QUMICA ANALTICA E EDUCAO
DISSERTAO DE MESTRADO
Extrao, Purificao e Isolamento de Antocianinas

de Jambolo (Syzygium cuminii) e Avaliao dos seus
Efeitos Biolgicos
AUTORA: DANIELLA DIAS PALOMBINO DE CAMPOS

ORIENTADORA: PROFa. DRa. ADRIANA VITORINO ROSSI
CO-ORIENTADOR: PROF. DR. HIROSHI AYOAMA
JULHO/2006
ii
FICHA CATALOGRFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA DO INSTITUTO DE

QUMICA DA UNICAMP
Campos, Daniella Dias Palombino de.

C15e Extrao, purificao e isolamento de antocianinas
de jambolo e avaliao dos seus efeitos biolgicos
(Syzygium cuminii) / Daniella Dias Palombino de
Campos. -- Campinas, SP: [s.n], 2006.
Orientadora: Adriana Vitorino Rossi.
Co-orientador: Hiroshi Aoyama.
Dissertao - Universidade Estadual de Campinas,

Instituto de Qumica.
1. Antocianinas. 2. Syzygium cuminii. 3. Jambolo.

4. Efeitos biolgicos. I. Rossi, Adriana Vitorino.
II. Aoyama, Hiroshi. III. Universidade Estadual de
Campinas. Instituto de Qumica. IV. Ttulo.
Ttulo em ingls: Extraction, purification and isolation of anthocyanins from Syzygium

cuminii and evaluation of their biological activities
Palavras-chaves em ingls: Anthocyanins, Syzygium cuminii, Biological activities,

Jambolo
rea de concentrao: Qumica Analtica
Titulao: Mestre em Qumica na rea de Qumica Analtica
Banca examinadora: Adriana Vitorino Rossi (orientadora), Hiroshi Aoyama (co-

orientador), Susanne Rath, Yassuco Iamamoto, Nivaldo Baccan e der Tadeu Gomes
Cavalheiro
Data de defesa: 31/07/2006

v
"O Senhor te abrir o seu bom tesouro, o cu, para dar chuva tua
terra no seu tempo, e para abenoar toda a obra das tuas mos; e
emprestars a muitas gentes...
Deuteronmio 28:12
Aos meus pais Maria Jos e Jos Carlos

por todo apoio e carinho.
Ao meu esposo Eliseu,

por toda compreenso e amor.
vii
AGRADECIMENTOS
Deus, fonte de vida e sabedoria.

Agradeo minha famlia, em especial aos meus pais Maria Jos e Jos
Carlos, aos meus irmos Adriana, Andr e Carlos Vincius, Nina e ao meu
esposo Eliseu, por todo o incentivo e apoio em todos os momentos que precisei.
Agradeo a todos os professores que muito contriburam para a minha
formao. Em especial, professora Dra. Susanne Rath que me ensinou os
primeiros passos no desenvolvimento de pesquisas cientficas. Ao professor Dr.
Hiroshi Aoyama por toda sabedoria e amizade que demonstrou ao me orientar
durante minha iniciao cientfica e na co-orientao desta dissertao.
professora Dra. Adriana Vitorino Rossi pela orientao cuidadosa e exigente desta
dissertao, por todos os seus ensinamentos e pela sua amizade.
s professoras Dra. Carla B. G. Bottoli e Dra. Raquel M. Braga pela avaliao
cuidadosa deste trabalho e pelas sugestes apresentadas para seu
aprimoramento por ocasio do exame de qualificao. s professoras doutoras
Susanne Rath e Yassuco Yamamoto pelas correes e valiosas sugestes dadas
por ocasio da defesa desta dissertao.
Agradeo com muito carinho professora Dra. Carmen Verssima Ferreira
por todo o auxlio durante os testes biolgicos em cultura de clulas. Daniele
Arajo e Maria Eleonora Picoli pelo auxlio nos testes biolgicos in vivo.
todos os amigos do laboratrio de Enzimologia, em especial Erika,
Luciana, William, Roberta e Camila, pela amizade e companheirismo, e aos
amigos do GPQUAE, em especial Accia, pelo apoio e amizade. Agradeo ao
Mrcio Andr Miranda e Daniela Brotto Lopes Terci por todas as sugestes para
o desenvolvimento deste trabalho e pela valiosa ateno.
Aos amigos de graduao Talitha, Viviane, Srgio e Maurcio, pelos ombros-
amigos, incentivo e amizade. Em especial, agradeo ao Rodolfo que muito me
ajudou na anlise fatorial, alm de ser um grande amigo.
viii
Agradeo ao suporte tcnico de Paulo Baldasso e Ricardo Pereira pela

colaborao nas anlises cromatogrficas e a Wilson Floriano pela exsicata do
jambolo.
A toda a direo e aos funcionrios dos Institutos de Qumica e de Biologia
da UNICAMP pelo apoio acadmico e tcnico.
Por fim, agradeo ao CNPq pelo apoio financeiro deste projeto.
ix
CURRCULO DA AUTORA
A autora desta Dissertao de Mestrado formou-se em Qumica na

modalidade Bacharelado em 2003 e na modalidade Licenciatura em 2005, pela
Universidade Estadual de Campinas. Durante a graduao, realizou dois projetos
de Iniciao Cientfica. O primeiro, na rea de Qumica Analtica, desenvolvendo
mtodos para quantificao dos antibiticos amoxicilina e ampicilina em frmacos.
Este projeto, intitulado Controle de Qualidade de Antibiticos -lactmicos:
Amoxicilina e Ampicilina foi desenvolvido no perodo de 01/05/2000 01/05/2001
e contemplado com bolsa de estudos da FAPESP (processo 00/00781-2), sob
orientao da Profa. Dra. Susanne Rath. O segundo projeto foi na rea de
bioqumica, intitulado Identificao e Caracterizao Cintica de Fosfatase cida
de Membrana de Linfcitos Humanos e Efeito de Flavonides sobre a Atividade
Fosfatsica, desenvolvido no perodo de 01/01/2002 01/01/2003, tambm
contemplado com bolsa FAPESP, processo 01/11886-2, sob orientao do Prof.
Dr. Hiroshi Aoyama. Em maro de 2003, foi aprovada no Programa de Mestrado
do Instituto de Qumica da UNICAMP, onde desenvolveu o projeto Extrao,
Purificao e Isolamento de Antocianinas de Jambolo (Syzygium cuminii) e
Avaliao dos seus Efeitos Biolgicos, com bolsa do CNPq sob orientao da
Profa. Dra. Adriana Vitorino Rossi. Cursou 42 crditos, tendo sido aprovada com o
conceito mximo em todas as disciplinas, sendo estas: Mtodos Analticos
Aplicados Determinao de Traos, ministrada pelos professores doutores Luiz
Manoel Aleixo (in memorian), Solange Cadore e Nivaldo Baccan; Bioanaltica:
Qumica Farmacutica e Clnica, ministrada pelos professores doutores Lauro
Kubota e Susanne Rath; Qumica de Protenas, ministrada pelo professor doutor
Srgio Marangoni; e Enzimologia, ministrada pelo Prof. Dr. Hiroshi Aoyama.
Realizou ainda 3 cursos extracurriculares com durao de 6 horas cada:
Mecanismos de Reaes Enzimticas ministrado pela professora doutora Kaethy
Bisan Alves, Bioqumica do Cncer e Bioqumica da Cozinha, ambos
supervisionados pelo Prof. Dr. Bayardo B. Torres. Durante seu trabalho acadmico
x
participou de 8 congressos cientficos, tendo apresentado 10 trabalhos na forma

de painis.
Alm das atividades acadmicas e de pesquisa, atualmente a autora ministra
aulas de Qumica e Fsica na Escola Estadual Culto Cincia em Campinas e foi
aprovada no concurso pblico de prova e ttulos para provimento de cargo de
professor de Qumica Educao Bsica II em nvel de Estado, com homologao
publicada no DOE de 28/04/2004.
Para maior detalhes, consultar Currculo Lattes.
xi
RESUMO
Extrao, Purificao e Isolamento de Antocianinas de Jambolo
(Syzygium cuminii) e Avaliao dos Seus Efeitos Biolgicos
Autora: Daniella Dias Palombino de Campos

Orientadora: Profa. Dra. Adriana Vitorino Rossi
Co-orientador: Prof. Dr. Hiroshi Aoyama
Antocianinas so os principais pigmentos naturais responsveis pelas coloraes

vermelha, azul e prpura de uma grande variedade de flores e frutos e vm sendo
empregadas como corantes alimentcios e indicadores de pH. As antocianinas pertencem
famlia dos flavonides, compostos polifenlicos cujas propriedades biolgicas vem sendo
extensamente descritas na literatura. Apesar da abundncia de antocianinas na natureza,
padres comerciais apresentam custo elevado e disponibilidade escassa. Este trabalho teve
como objetivo otimizar procedimentos de extrao, identificao (por cromatografia lquida de
alta eficincia), purificao (emprego de extrao em fase slida) e isolamento (cromatografia
lquida de alta eficincia) de antocianinas extradas de jambolo (Syzygium cuminii), fruto
tipicamente encontrado no Brasil, para a realizao de testes biolgicos. Os extratos com
concentrao de antocianinas totais igual a 0,80,2 g L-1 (1,70,4 mmol L-1), foram obtidos
por imerso das cascas de jambolo em gua na proporo 1:3 (m/v), identificando-se
delfinifina-3-glicosdeo, cianidina-3-galactosdeo, petunidina-3-galactosdeo e pelargonidina-3-
arabinosdeo. Nos ensaios in vitro, extrato purificado de antocianinas 400 mol L-1 promoveu
cerca de 90% de morte celular em cultura de clulas da linhagem da leucemia mielide
humana (HL60) e apenas 20% de morte de clulas sadias. Nos ensaios in vivo, camundongos
foram injetados com extrato antocinico purificado 20 mmol L-1 (cada animal recebeu o
equivalente a 10 mg de antocianina por kg corpreo). Testou-se a influncia das antocianinas
na atividade de enzimas fosfatases de plasma sanguneo, rim e fgado destes animais,
verificando-se alterao nas atividades destas enzimas. As alteraes mais significativas
foram observadas no plasma sanguneo, onde as fosfatases cida total (FAT) e de baixa
massa molecular relativa (FABMr) foram inibidas em 50 % e 70 % respectivamente.
xii
ABSTRACT
Extraction, Purification and Isolation of Anthocyanins from Syzygium
cuminii and Evaluation of their Biological Effects
Author: Daniella Dias Palombino de Campos

Adviser: Profa. Dra. Adriana Vitorino Rossi
Co-adviser: Prof. Dr. Hiroshi Aoyama
Anthocyanins, the natural pigments chiefly responsible for red, blue and purple hues in
a great range of flowers and fruit, are used as food dye and pH indicators. Anthocyanins are a
member of the family of flavonoids, polyphenolic compounds whose biological properties have
been extensively described in literature. Even though anthocyanins are plentiful in nature,
standard commercial anthocyanin have high cost and are produced by very few industries.
This work was aimed at optimizing extraction procedures and identification (by High
Performance Liquid Chromatography - HPLC and paper chromatography methods),
purification (by solid phase extraction) and isolation (by HPLC) methods of anthocyanins
extracted from Syzygium cuminii (a fruit readily found in Brazil), so as to conduct biological
tests. Anthocyanin extracts with total concentrations of 0.80.2 g L-1 (1.70.4 mmol L-1), were
obtained by immersion of Syzygium cuminii skin in water, at the proportion (1:3, w/v).
Delphinidin-3-glucoside, cyanidin-3-galactoside, petunidin-3-galactoside and pelargonidin-3-
arabinoside were identified. In in vitro tests, the purified anthocyanin extract (400 mol L-1)
killed around 90% of the human myleoid leukemia cells (HL60) in a culture, whereas it only
killed 20% of the cells from a healthy culture. As for in vivo tests, mice received injections of
purified anthocyanin extract 20 mmol L-1 (each animal received a dose equivalent to 10 mg of
anthocyanin extract per kg of body weight). Tests were conducted to assess the influence of
anthocyanins over the activity of phosphatase enzymes in plasma, kidney and liver of the
animals. Enzyme activity was effectively altered by anthocyanin extract injections, and the
most significant alterations were observed in plasma, where enzymatic activity of total acid
phosphatase (TAP) and low relative molecular weight phosphatase (LMW-PTP) were inhibited
by 50% and 70%, respectively.
xiii
SUMRIO
Captulo 1. INTRODUO GERAL.........................................................................1
Captulo 2. OBJETIVOS GERAIS...........................................................................5
PARTE 1: ASPECTOS ANALTICOS
Captulo 3. INTRODUO....................................................................................11
3.1. Compostos Polifenlicos.......................................................................13
3.2. Antocianinas..........................................................................................14
3.3. Obteno de Antocianinas a partir de Vegetais .................................. 17
3.3.1. Extrao.................................................................................. 17
3.3.2. Purificao ............................................................................. 18
3.3.3. Separao ou Isolamento ...................................................... 19
3.4. Mtodos de Identificao de Antocianinas........................................... 20
3.5. Mtodos de Quantificao das Antocianinas .......................................22
Captulo 4. OBJETIVOS........................................................................................25
Captulo 5. PARTE EXPERIMENTAL...................................................................29

5.1. Consideraes Gerais...........................................................................31
5.2. Equipamentos, Materiais e Reagentes.................................................31
5.3. Procedimentos Experimentais.............................................................. 33
5.3.1. Quantificao das Antocianinas .............................................33
5.3.2. Otimizao da Extrao de Antocianinas................................33
5.3.2.1. Estudo de Temperatura x Rendimento de Extrao.33
5.3.2.2. Avaliao do Melhor Rendimento de Extrao ........ 34
5.3.3. Identificao das Antocianinas................................................35
5.3.3.1. Cromatografia em Papel (PC)....................................35
5.3.3.2. Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (HPLC)......35
5.3.4. Purificao do Extrato de Antocianinas...................................36
xiv
5.3.4.1. Deteco de Acares............................................... 36

5.3.4.2. Deteco de cidos Orgnicos..................................37
5.3.5. Isolamento das Antocianinas...................................................37
Captulo 6. RESULTADOS E DISCUSSES........................................................39
6.1. Quantificao das Antocianinas ...........................................................41

6.2. Otimizao da Extrao de Antocianinas de Jambolo........................42
6.2.1. Espectro de Absoro das Antocianinas................................ 42
6.2.2. Efeito do Tempo e Temperatura na Extrao ........................43
6.2.3. Avaliao do Melhor Sistema de Extrao..............................44
6.3. Identificao das Antocianinas.............................................................50
6.3.1. Cromatografia em Papel.........................................................50
6.3.2. Cromatografia Lquida de Alta Eficincia................................51
6.4. Purificao do Extrato de Antocianinas................................................54
6.4.1. Deteco de Acares............................................................54
6.4.2. Deteco de cidos Orgnicos...............................................55
6.4.3. Avaliao da Purificao do Extrato........................................56
6.5. Isolamento das Antocianinas................................................................59
Captulo 7. CONCLUSES ..................................................................................61
PARTE 2: ASPECTOS BIOLGICOS
Captulo 8. INTRODUO....................................................................................67
8.1. Propriedades Biolgicas dos Flavonides........................................... 69
8.2. Enzimas Fosfatases..............................................................................71
8.3. Bioensaios.............................................................................................73
8.4. Linfcitos Humanos...............................................................................75
8.5. Linhagem Celular da Leucemia Mielide Humana (HL60)...................76
Captulo 9. OBJETIVOS........................................................................................77
xv
Captulo 10. PARTE EXPERIMENTAL.................................................................81

10.1. Reagentes, Materiais e Equipamentos...............................................83
10.2.Procedimentos Experimentais ............................................................83
10.2.1. Ensaios in vitro......................................................................83
10.2.2. Ensaios in vivo .....................................................................85
Captulo 11. RESULTADOS E DISCUSSES......................................................89
11.1. Ensaios in vitro: Avaliao do Efeito de Antocianinas em Cultura de

Linfcitos Sadios e Clulas Tumorais Linhagem HL60.............................91
11.2. Ensaios in vivo: Avaliao do Efeito de Antocianinas em Fosfatases

de Camundongos.........................................................................................92
11.2.1. Efeito das Antocianinas na Concentrao de Protenas ......93
11.2.2. Efeito das Antocianinas em Fosfatases ...............................94
Captulo 12.CONCLUSES................................................................................101
Captulo 13: CONCLUSES GERAIS................................................................105
Captulo 14: PERSPECTIVAS FUTURAS..........................................................109
Captulo 15: REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS...............................................113

xvi
ABREVIATURAS
AE atividade enzimtica especfica
AREs extratos ricos em antocianinas (do ingls anthocyanins rich extract)
Cy-3-glu cianidina-3-glicosdeo
FABMr fosfatase cida de baixa massa molecular relativa
FAlc fosfatase alcalina
FAT fosfatase cida total
FATR fosfatase cida resistente ao tartarato
HPLC cromatografia lquida de alta eficincia (do ingls high performance liquid
chromatography
Mr massa molecular relativa
MS espectrometria de massas (do ingls mass spectroscopy)
MTT - brometo de (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio)
m/v razo entre massa e volume
NMR ressonncia magntica nuclear (do ingls nuclear magnetic ressonance)
PC cromatografia em papel (do ingls paper chromatography)
pHMB p-hidroximercuribenzoato
pNP p-nitrofenol
pNPP p-nitrofenilfosfato
PVP polivinilpirrolidona
RF fator de retardamento
rpm rotaes por minuto
RPMI - Roswell Park Memorial Institute
SPE extrao em fase slida (do ingls solid phase extraction)
TR tempo de retardamento
UE atividade enzimtica
UV-Vis ultravioleta-visvel
xvii
NDICE DE TABELAS
Tabela 1. Fatores escolhidos para o planejamento fatorial e seus nveis......................45
Tabela 2. Experimentos de otimizao da extrao das antocianinas de jambolo .....46
Tabela 3. Efeitos principais calculados para cada fator.................................................47
Tabela 4. Efeitos de interao entre os fatores..............................................................47
Tabela 5. Valores de varincia e erro dos efeitos..........................................................49
Tabela 6. Tempos de retardamento das antocianinas ..................................................52
Tabela 7. Dados da purificao das antocianinas por SPE...........................................58
Tabela 8. Dados da purificao das antocianinas por SPE...........................................59

xviii
NDICE DE FIGURAS
Figura 1. Estrutura qumica genrica dos flavonides...................................................13
Figura 2. Estrutura genrica das antocianinas..............................................................14
Figura 3. Variao nas estruturas das antocianinas em funo do pH.........................16
Figura 4. Espectros eletrnicos UV-VIS das antocianinas em diferentes solventes.....42
Figura 5. Estudo da influncia do tempo de extrao das antocianinas a 25 oC...........43
Figura 6. Estudo da influncia do tempo de extrao das antocianinas a 46 oC...........43
Figura 7. Cromatograma do extrato antocinico de jambolo obtido por PC................50
Figura 8. Cromatograma para o extrato de jambolo por HPLC .................................51
Figura 9. Teste de deteco de acares.....................................................................54
Figura 10. Teste de deteco de cidos orgnicos.......................................................55
Figura 11. Comparao de padres de cidos orgnicos por PC.................................56
Figura 12. Deteco de acares durante a purificao dos extratos antocinicos......56
Figura 13. Deteco de cidos orgnicos na purificao dos extratos por SPE...........57
Figura 14. Cromatograma referente ao isolamento das antocianinas...........................60
Figura 15. Efeito citotxico de antocianinas em cultura de clulas sadias e HL60.......92
Figura 16. Efeito de antocianinas no contedo total de protenas de camundongos....94
Figura 17. Mecanismo cataltico das Protenas Tirosinas Fosfatases...........................95
Figura 18. Efeito de antocianinas nas fosfatases de fgado de camundongos..............96
Figura 19. Efeito de antocianinas nas fosfatases de rim de camundongos...................98
Figura 20. Efeito de antocianinas em fosfatases plasmticas de camundongos..........99

Campos, D.D.P. Introduo Geral 1
CAPTULO 1
INTRODUO GERAL
1. INTRODUO GERAL
As porfirinas, os carotenides e os flavonides correspondem s principais

classes de pigmentos responsveis pela colorao de flores, frutos e folhas
(Alkema e Seager, 1982). As antocianinas so polifenis pertencentes famlia
dos flavonides que se responsabilizam pelas coloraes vermelha, azul e
prpura de flores e frutos (Brouillard e Harborne, 1988). A funo primria das
antocianinas nas plantas , sem dvidas, atrair insetos e pssaros com o objetivo
de promover a polinizao e disperso das sementes (Harborne, 1967).
Apesar da abundncia das antocianinas na natureza, o isolamento destes
compostos, do ponto de vista qumico, pode ser considerado um desafio, visto que
so instveis quando expostos luz e quando esto em meios alcalinos
(Harborne, 1967). Alm disso, seu isolamento requer grandes quantidades de
material de partida e sua secagem muito difcil, sendo facilmente hidrolisveis.
Talvez estes motivos aliados baixa demanda comercial das antocianinas,
expliquem porque padres comerciais de antocianinas apresentam preo elevado
e nem sempre so comercialmente disponveis.
Apesar dessa aparente dificuldade comercial, as antocianinas, como outros
flavonides, tm despertado um interesse crescente em vrios segmentos
industriais como, por exemplo, pelas indstrias farmacuticas que as
comercializam na forma de fitoterpicos (Scharrer e Ober, 1981), na rea
cosmtica, fazendo parte de formulaes na forma de extratos naturais (Arct. et.
al., 2002) e na indstria alimentcia que as utiliza como corantes naturais em
alimentos processados (Stringueta, 2000). Tais aplicaes ilustram a importncia
dos estudos analticos envolvendo a extrao, a purificao e o isolamento de
antocianinas.
No que diz respeito s suas atividades biolgicas, muitas propriedades
importantes foram descritas para os flavonides, principalmente aquelas
relacionadas com propriedades antioxidantes e seu papel inibitrio na proliferao
de clulas de cncer em cultura e em vrios estgios de desenvolvimento tumoral
estudados em animais (Miranda, 2000). Especificamente com relao s
antocianinas, vrios estudos vem sendo realizados recentemente para avaliao
dos possveis efeitos biolgicos destas molculas. Embora j se saiba que as

antocianinas so excelentes agentes anti-oxidante e anti-inflamatrio (Wang et.
al., 1999), uma outra caracterstica vem despertando mais interesse: seus efeitos
antitumorais. Zhao e colaboradores (2004) atriburam atividade anti-tumoral para
as antocianinas em clulas tumorais do clon e isto estimulou outros estudos que
podem ser realizados com antocianinas para a verificao de suas propriedades
biolgicas, visto que estas apresentam muitas similaridades estruturais com outras
classes de flavonides.
Na tentativa de avaliao de outras propriedades biolgicas das
antocianinas, neste trabalho verificou-se o efeito anti-tumoral de antocianinas de
jambolo em linhagem de clulas leucmicas (HL-60) bem como a atividade
destes pigmentos em enzimas fosfatases provenientes de camundongos, num
estudo paralelo com flavonides comerciais, cujas estruturas so semelhantes s
das antocianinas.
Campos, D.D.P. Objetivos Gerais 5
CAPTULO 2
OBJETIVOS GERAIS
Campos, D.D.P. Objetivos Gerais 7
H muitos estudos sobre a atividade biolgica de flavonides e em relao

s antocianinas, em particular, apenas as atividades anti-oxidante e anti-
inflamatria tm sido descritas com mais detalhes. S recentemente, alguns
estudos indicaram a atividade anti-tumoral desta classe de molculas.
Provavelmente, o motivo da pequena quantidade de estudos biolgicos publicados
utilizando-se as antocianinas esteja relacionado dificuldade de obteno de
padres destes pigmentos.
Visando obter quantidade suficiente de antocianinas para a realizao de

estudos biolgicos, este trabalho apresentou como objetivos principais:
1. - desenvolver um mtodo otimizado para extrao de antocianinas de

jambolo (Syzygium cuminii), que uma fruta muito comum no Brasil, mas
pouco utilizada para consumo humano;
2. - promover a eliminao de acares e cidos orgnicos para obter extratos

de antocianinas purificados;
3. - isolar as antocianinas;
4. - identificar e quantificar as antocianinas extradas;
5. - realizar testes biolgicos in vitro para avaliar a sua atividade anti-tumoral
6. - realizar testes biolgicos in vivo com as antocianinas obtidas para verificar

sua atividade em enzimas fosfatases;
Para melhor organizar todo o material e facilitar a leitura, o trabalho

apresentado em 2 partes.
Parte 1 Aspectos Analticos, que trata dos objetivos 1 a 4.
Parte 2 Aspectos Biolgicos, envolvendo os objetivos 5 e 6.
Campos, D.D.P. Introduo - Aspectos Analticos 9
PARTE 1
ASPECTOS ANALTICOS
Campos, D.D.P. Aspectos Analticos: Introduo 11
CAPTULO 3
INTRODUO
3.1. Compostos Polifenlicos
Polifenis so os agentes antioxidantes mais abundantes da dieta humana

e encontram-se divididos em classes, sendo que as principais so os cidos
fenlicos e os flavonides. Os polifenis, junto com outros compostos redutores
presentes na dieta humana, tais como vitamina C, vitamina E e carotenides,
protegem os tecidos do corpo contra estresse oxidativo e patologias associadas
como cnceres, doenas coronarianas e inflamaes (Tapiero et al., 2002).
O consumo humano dirio de flavonides varia de 6 a 64 mg, podendo
chegar at 1 g por dia. Estes compostos, exclusivamente produzidos por vegetais,
so bastante encontrados em chs verdes, frutas, verduras, plantas medicinais,
vinhos tintos e fitoterpicos. Mais de 4000 flavonides j foram estudados, sendo
conhecidas suas estruturas e atividades biolgicas. So divididos em diferentes
classes: antocianinas, flavanas, flavononas, flavonas, flavonis e isoflavonides
(Miranda, 2000). Nas plantas, os flavonides so encontrados ligados a acares
como glicosdeos e so bastante estveis. A Figura 1 apresenta a estrutura
genrica comum a grande maioria dos flavonides, sendo constituda pelo
esqueleto carbnico C6-C3-C6 (anis A, B e C) comum a todos flavonides, os
quais so diferenciados apenas por insaturaes, hidroxilaes e substituies
(Hertog et al., 1993; Peterson e Dwyer, 1998).
OH
C
HO O
A B
OH O
Figura 1. Estrutura qumica genrica dos flavonides. Os anis A e C so aromticos e o

anel B um heterociclo contendo oxignio vizinho a um carbono ligado ao anel C.
3.2. Antocianinas
O termo antocianina tem origem grega, sendo que antho significa flor e
kiano, azul. Este termo foi primeiramente utilizado por Marquat em 1835 para
designar os pigmentos azuis de flores. Atualmente, sabe-se que as antocianinas
so responsveis tambm pelas coloraes violeta, vermelha e prpura de uma
grande variedade de espcies do reino vegetal. Dois contra-exemplos notveis
so os tomates e beterrabas cujas coloraes vermelho-alaranjada e vermelho-
prpura so devidas presena de licopeno e betaninas, respectivamente
(Jackman et. al., 1987).
Estruturalmente, as antocianinas so derivados glicosilados do ction 2-fenil
benzopirilium, tambm denominado de ction flavlico, cuja estrutura encontra-se
ilustrada na Figura 2 (Jackman et. al., 1987).
R
Antocianidina grupo grupo
em R em R
OH Antocianidina grupo grupo
Cianidina emOHR emHR
HO 8 Delfinidina OH OH
7 O 2 Cianidina
Pelargonidina OH
H H
H
R Delfinidina
Peonidina OH
OCH3 OH
H
Pelargonidina
Petunidina H 3
OCH H
OH
6 3 Peonidina
Malvinidina OCH
OCH33 H 3
OCH
5 O Petunidina OCH3 OH
4 R
Malvinidina OCH3 OCH3
OH
Figura 2. Estrutura genrica das antocianinas a partir do esqueleto das antocianidinas

(agliconas). A substituio de R por uma ou mais unidades de acar
na antocianidina resulta numa antocianina. Outras unidades de acares tambm podem ser
ligadas pelos grupos OH nas posies 3, 5 e 7.
Os acares mais comumente ligados estrutura molecular central, em

geral nas hidroxilas das posies 3, 5 e 7, so monossacardeos como glicose,
galactose, arabinose, raminose, porm, podem apresentar-se tambm na forma
de di e trissacardeos. As variaes estruturais das antocianinas denotam
diferentes acares ligados, polimerizao e nos modos ou posies de
hidroxilao e metilao. Em alguns casos, os acares apresentam-se acilados
pelos cidos p-coumrico, cafeco, fenlico e vanlico. A molcula de antocianina

no glicosilada (aglicona) denominada antocianidina e raramente ocorre na
natureza, em geral, resultante do processo de isolamento das antocianinas. O
acar presente na estrutura das antocianinas confere maior solubilidade e
estabilidade a estes pigmentos quando comparados com suas agliconas
(Harborne, 1975; Jackman et al., 1987; Lee e Hong, 1992; Terci e Rossi, 2002;
Okumura et al., 2002).
As antocianinas possuem a interessante propriedade de apresentarem
cores diferentes dependendo do pH do meio em que se encontram, o que as torna
de interesse para uso como indicadores de pH. As mudanas estruturais das
molculas ocorridas mediante a variao do pH, permitem a obteno de solues
incolores ou coloridas, podendo ser vermelha, violeta, azul ou amarela como pode
ser visto pela Figura 3 (Terci e Rossi, 2002).
As antocianinas esto presentes na alimentao humana sendo
encontradas em diversos vegetais como: uva, ma, feijo preto, morango, amora,
jabuticaba, cerejas, jambolo, chicria, cenouras prpuras, dentre outros, estando
presente tambm em alimentos derivados de frutas como sucos, gelias, licores e
vinhos (Jain e Seshadri, 1975; Goiffon et al., 1991; Lee e Hong, 1992; Goiffon et
al., 1999; Chandra et al., 2001; Lazcano et al., 2001; Mataix e Castro, 2001;
Okumura et al., 2002; Terci e Rossi, 2002).
O crescente interesse na utilizao de antocianinas como corantes
alimentcios e em formulaes de drogas e cosmticos tem gerado uma
necessidade de desenvolver e/ou aprimorar mtodos analticos para a extrao,
purificao, identificao e quantificao destes pigmentos a partir de espcies
vegetais, fato que justifica uma discusso sucinta dos mtodos analticos mais
utilizados na realizao de cada uma destas etapas.
Figura 3. Variaes nas estruturas das antocianinas em funo do pH e conseqente

alterao da colorao das solues em que se encontram (Terci e Rossi, 2002).
3.3. Obteno de Antocianinas a partir de Vegetais

3.3.1 Extrao
Muitos autores preocuparam-se em propor mtodos de extrao, separao
e identificao de antocianinas provenientes de diversas fontes. Em extenso
trabalho de reviso da literatura, Lee e Hong (1992) bem como Jackman e
colaboradores (1987) descreveram os mtodos utilizados por diferentes
pesquisadores desde 1956. Mais atualmente tais mtodos foram revistos por Terci
(2004).
As antocianinas, muito solveis em gua, so facilmente extradas de
plantas utilizando-se solues polares. O solvente mais utilizado na extrao de
antocianinas o metanol, apesar da toxicidade. Entretanto, para algumas
aplicaes onde o aspecto quantitativo no prioritrio, etanol e gua tambm
tm sido utilizados. A limitao do uso de etanol e gua est relacionada com a
menor eficincia na extrao de antocianinas. Metanol 20% mais eficiente que
etanol e 73% mais efetivo que a gua (Terci, 2004).
Muitos pesquisadores empregaram solventes alcolicos acidificados, por
exemplo, HCl (1% v/v) em metanol, visto que o cido previne a oxidao das
antocianinas. Porm, Jackman e colaboradores (1987) advertiram que a
concentrao do cido clordrico em metanol no deve ser superior a 0,05%. Na
tentativa de estabilizar a antocianina, o cido modifica a forma nativa do pigmento,
devido ao rompimento das associaes com metais e co-pigmentos, podendo
levar decomposio de pigmentos acilados.
A temperatura outro fator importante na extrao de antocianinas.
Segundo Okumura et al. (2002), a hidrlise completa dos acares ligados a
antocianinas ocorre em 1 hora a 60C na presena de etanol acidificado com 1%
de HCl, ou quando o extrato etanlico evaporado sob aquecimento para
eliminao do solvente. Desta forma, segundos os autores, para que a extrao
seja realizada em sistemas aquecidos deve-se trabalhar com temperaturas
inferiores a 60C e a evaporao do solvente deve ser realizada temperatura
ambiente, ou inferior 40C, com evaporadores a vcuo.
Segundo reviso realizada por Terci 2004, os autores Revilla e

colaboradores (1998) compararam diversos mtodos descritos na literatura para
extrao de antocianinas de uvas e, pelos resultados obtidos, concluram que a
quantidade total de antocianinas extradas influenciada pelo tempo de extrao e
pela acidificao do solvente extrator. Os resultados mostraram que em 48 h de
extrao obteve-se um acrscimo de 20% na quantidade de antocianinas obtidas
quando comparado a uma extrao realizada em 20 h. Em relao ao solvente
extrator, a acidificao deste com 1% (v/v) de cido mineral repercutiu em um
acrscimo de 7% na quantidade de antocianinas extradas.
Geralmente, aps a extrao das antocianinas, os extratos brutos so
concentrados utilizando-se evaporadores rotativos a vcuo com temperaturas
inferiores a 40C at massa constante, o que resulta em um resduo viscoso
(Pazmin-Durn et al., 2001; Soares e Cavalheiro, 2001).
O extrato bruto antocinico contm, alm dos pigmentos de interesse,
outros compostos fenlicos, e ainda acares e cidos orgnicos. Portanto, estes
extratos devem ser previamente purificados para as aplicaes biolgicas.
3.3.2 Purificao
Aps a extrao, geralmente os extratos antocinicos so purificados com o
objetivo de serem obtidas as antocianinas totais, eliminando-se compostos como
acares, cidos orgnicos, polissacardeos solveis, protenas e ctions. Vrios
mtodos tm sido utilizados com sucesso para a purificao de antocianinas,
destacando-se entre estes a precipitao com acetato de chumbo, extrao
lquido-lquido, extrao com resina de troca inica e extrao em fase slida
(Terci, 2004).
Jackman e colaboradores (1987) relataram o emprego de polivinilpirrolidona
insolvel (PVP) e poliamida como adsorventes com a tcnica de cromatografia em
coluna. Estes materiais possuem oxignios ligados a um carbono de ligao
peptdica, o que tende a formar ligaes de hidrognio fortes com as hidroxilas
das antocianinas, mantendo tais molculas retidas no material. As antocianinas
tambm podem ser purificadas pela tcnica de extrao em fase slida (do ingls:
Solid Phase Extraction - SPE), K-Schafhalter e colaboradores (1998) avaliaram o

uso de 16 diferentes materiais para purificar antocianinas provenientes de Aronia
melanocarpa var Nero, (conhecida como black chockeberry) utilizando-se esta
tcnica. Foram testados materiais apolares em fase reversa, adsorventes
polimricos no inicos e resinas de troca inica fortes e fracas. Em todos os
casos, as impurezas orgnicas e inorgnicas hidrossolveis foram removidas com
percolao de gua e as antocianinas foram eludas posteriormente com etanol
acidificado. Os autores encontraram melhores resultados utilizando como fase
slida, Slica Gel C18 fase reversa e Amberlite XAD-7, um adsorvente acrlico
polimrico e no inico.
A purificao de extratos antocinicos brutos por SPE possvel devido
eluio dos componentes individuais do extrato em solventes apropriados. O
procedimento fundamental para a purificao de antocianinas por SPE consiste na
aplicao do extrato antocinico bruto em um cartucho contendo material
sorvente. As antocianinas so sorvidas fortemente neste material (fase
estacionria) por suas hidroxilas no substitudas; desta forma, as substncias
mais polares que as antocianinas, como acares e cidos orgnicos so eludas
primeiramente, com a percolao de gua. Na seqncia, os pigmentos
antocinicos podem ser eludos mediante percolao de solventes menos polares
(Terci, 2004).
3.3.3 Separao ou Isolamento

Em relao aos diferentes mtodos de separao existentes, destacam-se
aqueles baseados em tcnicas cromatogrficas por compreenderem um conjunto
de propostas que envolvem desde simples procedimentos clssicos de via mida
at sofisticados procedimentos com tcnica instrumental (Okumura et al., 2002).
A cromatografia em papel uma tcnica muito adequada para a separao
e caracterizao de quantidades limitadas de antocianinas (Harborne et al., 1975).
H muitas informaes disponveis na literatura, em relao aos valores de fator
de retardamento (RF) para diferentes sistemas de solventes empregados. Estes
valores permitem a identificao das antocianinas, visto que so caractersticos
para cada molcula (Lee e Hong, 1992). Com cromatografia de camada delgada,
os valores de RF variam muito devido s diferentes espessuras das placas e so
necessrios compostos de referncia, tais como padres certificados. Para a
obteno das antocianinas individualmente aps a separao (isolamento),
Jackman e colaboradores (1987) descreveram que alguns autores rasparam
placas de cromatografia de camada delgada ou recortaram o papel, no caso da
PC, e dissolveram as antocianinas previamente separadas em solventes
adequados. Porm, segundo Harborne e colaboradores (1975), quando se deseja
obter antocianinas isoladas em quantidades maiores, prefervel o emprego da
tcnica de cromatografia de baixo fluxo, utilizando colunas de adsorventes como
alumina e PVP e deve-se coletar as fraes individualmente.
Outras tcnicas como cromatografia contra-corrente, eletroforese,
cromatografia de coluna aberta e cromatografia gasosa tambm j foram
empregadas, porm, para a separao de antocianinas, prevalece a tcnica de
cromatografia lquida de alta eficincia (ou do ingls: High Performance Liquid
Chromatography - HPLC), especialmente de fase reversa, por oferecer excelentes
separaes, alta detectabilidade, tempo de anlise relativamente curto e no
necessidade de extratos com elevada pureza (K-Schafhalter et al., 1998).
3.4. Mtodos de Identificao de Antocianinas
As antocianinas podem ser identificadas por vrias tcnicas, sendo que as

mais utilizadas so espectroscopia ultravioleta e visvel (UV-Vis), espectroscopia
de ressonncia magntica nuclear (ou do ingls: Nuclear Magnetic Ressonance
NMR), espectrometria de massas (do ingls, MS Mass Spectrometer) e HPLC
(Terci, 2004). importante distinguir procedimentos que identificam a classe das
antocianinas e os procedimentos que identificam cada antocianina presente.
O espectro eletrnico de absoro das antocianinas e suas agliconas tem
sido muito til para a identificao desta classe de pigmentos. Em meio cido,
estes compostos apresentam uma absoro mxima caracterstica entre 465 e
550 nm e uma absoro menos intensa prxima a 275 nm (Harborne, 1967).
A identificao individual das antocianinas possvel com o uso de tcnicas

cromatogrficas, fatores de retardamento (RF) - obtidos por cromatografia em
placa ou papel - ou tempos de retardamento (TR), quando se utiliza cromatografia
em coluna - obtidos experimentalmente so comparados com os reportados na
literatura, guardadas as devidas limitaes deste procedimento. H uma relao
direta entre a estrutura da antocianina e sua mobilidade cromatogrfica, sendo
que a quantidade de grupos hidroxilas, bem como o grau de metilao, acilao e
o nmero de unidades de acar ligadas molcula, influenciam diretamente nos
valores de retardamento (Jackman et al., 1987). Segundo Goiffon e colaboradores
(1999), a mobilidade cromatogrfica representada pelo valor de RF ou TR a
caracterstica mais importante para identificar uma antocianina.
Para a identificao de antocianinas em alimentos e plantas, dois
procedimentos podem ser utilizados: comparao direta, quando h
disponibilidade de material padro, ou comparao indireta, se no houver
material padro. Neste caso, segundo Harborne, uma comparao cuidadosa com
os dados da literatura aceitvel. A comparao indireta, embora seja um mtodo
sujeito a erros, justificada pela falta de padres e pelo trabalhoso procedimento
para a identificao (Harborne, 1984).
Devido dificuldade de obteno e ao elevado preo de padres de
antocianinas, Goiffon e colaboradores, em 1999, descreveram um mtodo
utilizando HPLC para identificar estes pigmentos. Tal mtodo consiste na
comparao de fatores de retardamento das antocianinas que se deseja identificar
com quele referente a cianidina 3-glicosdeo, pigmento presente em praticamente
todas as frutas vermelhas. Assim, os autores sugerem a determinao de um
fator para cada antocianina, o qual calculado atravs da razo dos tempos de
retardamento da antocianina que se deseja identificar e da cianidina 3-glicosdeo.
Apesar da mesma simbologia, no se trata do mesmo fator , definido como fator
de separao que sempre relaciona os tempos de retardamento de picos
adjacentes (Collins et. al.1997).
Nesta dissertao, as antocianinas presentes no jambolo foram

identificadas utilizando-se o mtodo de Goiffon e colaboradores para HPLC em
complementao cromatografia em papel.
3.5. Mtodos de Quantificao das Antocianinas
Geralmente, os extratos antocinicos contm, alm dos pigmentos de

interesse, outros compostos polares como acares e cidos orgnicos, alm
disso, os extratos purificados podem conter antocianidinas como conseqncia da
degradao das antocianinas. Brouillard em 1982 descreveu diferentes mtodos
para a quantificao de antocianinas. Estes mtodos dividem-se em trs grupos:
queles relacionados a extratos que contm pouco ou nenhum interferente,
queles contendo produtos de degradao como interferentes e queles que
visam quantificao de cada pigmento individualmente. Cabe ressaltar que o
termo interferente refere-se a outros compostos polifenlicos, acares, cidos
ou mesmo s antocianidinas (Jackman et al., 1987).
Para a quantificao de antocianinas em extratos de frutas ou vegetais
frescos onde, geralmente, h poucos componentes interferentes, realiza-se a
leitura da absorbncia do extrato diludo em lcool acidificado em um nico
comprimento de onda situado na regio do visvel, entre 465 e 550 nm. Para a
determinao do contedo total de antocianinas em um extrato contendo dois ou
mais tipos de antocianinas diferentes, no havendo substncias interferentes,
realiza-se o mesmo procedimento, porm, deve-se conhecer previamente a
proporo de cada antocianina na mistura bem como suas absortividades molares
(Jackman et al., 1987). Porm, vale destacar que dados de composio de
extratos antocinicos de frutas no so triviais, j que, para uma mesma espcie
vegetal, os tipos e propores de antocianinas presentes podem variar em funo
de vrios fatores como clima, poca da colheita e caractersticas do solo. Neste
contexto, o mtodo do pH diferencial para a quantificao de antocianinas totais
representa uma opo vantajosa e o procedimento descrito a seguir.
Nos extratos em que os produtos de degradao (antocianidinas e

acares) podem estar presentes, as antocianinas devem ser quantificadas pelo
mtodo do pH Diferencial ou pelo mtodo Subtrativo. Este ltimo est relacionado
com a leitura da absorbncia do extrato no comprimento de onda na regio do
visvel onde h absoro mxima. Posteriormente, adiciona-se um agente
branqueador ao extrato, geralmente sulfito de sdio ou perxido de hidrognio, e
realiza-se novamente a leitura no mesmo comprimento de onda, a qual se refere
leitura do branco. Este mtodo tem sofrido crticas, j que os agentes
branqueadores no so especficos para as antocianinas e tambm causam um
decrscimo na absoro dos produtos de degradao (Jackman et al., 1987).
O mtodo do pH Diferencial tem sido amplamente utilizado para a
quantificao de antocianinas. A proposta de Fuleki e Francis (1968) que
fundamenta o mtodo do pH diferencial est baseada na obteno de espectros
das solues em 2 valores de pH, visto que com a alterao do pH, observam-se
transformaes nas estruturas das antocianinas e, conseqentemente, nas cores
das solues onde esto contidas (Jackman et al., 1987). So utilizadas solues
de pH 1,0 e 4,5 para a diluio do extrato que se deseja quantificar e 2
comprimentos de onda so escolhidos para a leitura da absorbncia, um
correspondente ao comprimento de onda de mxima absoro (prximo a 510 nm)
e outro em 700 nm, onde no ocorre absoro. Em pH 1,0, a soluo contendo as
antocianinas torna-se vermelha e em pH 4,5, incolor. Assim, a absorbncia das
solues em 517 nm (no caso dos extratos de jambolo) em pH 1,0 proporcional
concentrao das antocianinas presentes no extrato. A absorbncia lida para a
soluo de pH 4,5 em 517 nm refere-se aos produtos de degradao das
antocianinas, as antocianidinas, que no possuem a propriedade de alterarem a
colorao da soluo em que se encontram em funo do pH. Segundo o mtodo
de Fuleki e Francis (1968), as leituras a 700 nm devem servir para corrigir
eventuais espalhamentos de luz causados por partculas em suspenso, que de
acordo com os autores, podem estar presentes em extratos de frutas.
Campos, D.D.P. Aspectos Analticos: Objetivos 25
CAPTULO 4
OBJETIVOS
Campos, D.D.P. Aspectos Analticos: Objetivos 27
Nesta parte do trabalho o objetivo foi obter antocianinas de jambolo com o

mximo rendimento possvel e utilizando procedimentos simples, visando
possibilidade de aplicao em larga escala. Para tanto, foram priorizadas as
seguintes etapas:
- Otimizao do procedimento de extrao de antocianinas de jambolo;
- Purificao dos extratos de antocianinas;
- Isolamento das antocianinas;
- Identificao e quantificao das antocianinas presentes no extrato;

Campos, D.D.P. Aspectos Analticos: Parte Experimental 29
CAPTULO 5
PARTE EXPERIMENTAL
5.1. Consideraes Gerais

Optou-se por trabalhar com o jambolo, pois experincias anteriores do
nosso grupo de pesquisa apontaram que esta fruta apresenta outros compostos
fenlicos em menor quantidade quando comparada a outras frutas comuns como,
uva, amora e jabuticaba. Isto facilita a etapa de purificao. Alm disso, trata-se
de uma fruta comumente encontrada no Brasil e ainda pouco aproveitada.
Todas as frutas utilizadas para a realizao dos experimentos desta
dissertao foram coletadas de espcimes localizados na Faculdade de Educao
Fsica da UNICAMP em fevereiro de 2003 e identificadas como Syzygium cuminii,
famlia myrtacea, com registro de excicata nmero 132.456, no Herbrio do
Instituto de Biologia da UNICAMP. As frutas foram lavadas em gua corrente,
secas ao ar temperatura ambiente e mantidas a - 4 C at a sua utilizao.
Os extratos foram feitos imergindo-se as cascas das frutas (previamente
removidas com uma faca comum) em solvente apropriado, sempre na proporo
1:3, de massa de cascas e volume de solvente, respectivamente.
Todos os experimentos foram realizados com reagentes de pureza descrita
na lista da seqncia, seguindo-se as necessrias padronizaes e procedimentos
recomendados pela literatura (Baccan et. al., 2001; Vogel, 1991).
5.2. Equipamentos, Materiais e Reagentes

Os materiais, reagentes e equipamentos utilizados durante a execuo
deste trabalho esto descritos a seguir:
Materiais :
- cartucho C18 500 mg para SPE, Varian;
- coluna cromatogrfica bondesil C18 Varian 5 m, (4,6 mm x 25 cm);
- filme de PVC (magipack);
- micropipetas Sci Tech de 50-200 L e de 200-1000 L;
- papel cromatogrfico Whatman 1 Chr;
- papel de filtro qualitativo Qualy.
Reagentes:
- acetato de sdio Fisher; acetonitrila grau cromatogrfico J.T. Baker;
cido actico glacial Merck; cido ascrbico Merck; cido ctrico Vetec;
cido clordrico PA Vetec; cido frmico PA Nuclear; cido fumrico PA
Synth; cido mlico PA Synth; cido oxlico 99,5 % Lafan; cido succinco
PA Vetec; cido sulfrico PA Synth; cido tartrico 99,5 % Carlo Erba; azul
de bromofenol Merck; arabinose Synth, biftalato de potssio PA Vetec;
butanol PA Synth; carbonato de clcio Vimitec; citrato de sdio; cloreto de
sdio PA Sigma; etanol absoluto Merck; fluoreto de sdio Merck; fosfato
sdico monobsico Merck; frutose Synth; glicose Synth; hidrxido de sdio
Synth; lactose Synth; manose Synth; metanol PA Synth; molibdato de
amnio Synth; p-nitrofenil fosfato Merck; raminose Synth; sacarose Synth.
Para a quantificao das antocianinas pelo mtodo do pH diferencial,

utilizaram-se solues de pH 1,0 e 4,5. A soluo de pH 1,0 foi preparada por
diluio em gua destilada de uma soluo de cido clordrico 0,2 mol L-1. A
soluo de pH 4,5 foi preparada utilizando-se uma mistura de uma soluo de
biftalato de potssio 0,1 mol L-1 e hidrxido de sdio 0,1 mol L-1; o pH foi ajustado
para 4,5 com hidrxido de sdio. Todos os valores de pH foram verificados em
pHmetro com eletrodo de vidro combinado.
Equipamentos
- balana analtica Mettler AE 200;
- cromatgrafo lquido analtico Waters 600E com detector
espectrofotomtrico UV-VIS Waters 484 e integrador Waters 746;
- cromatgrafo lquido Waters 510, com detector de arranjo de diodos UV
Waters 991 e coletor de fraes Fox;
- evaporador Speed Vac SC110A-Savant;
- espectrofotmetro Pharmacia Biotech Ultrospec 2000;
- pHmetro Analyser 300 com eletrodo de vidro combinado;
- secador de cabelos Phillips Compact 1100 HP 4814.
- sistema de Purificao de gua Milli-Q;

- sistema de Filtrao de Solvente Millipore.
5.3. Procedimentos Experimentais
5.3.1 Quantificao das Antocianinas
Os extratos obtidos conforme mencionado em Consideraes Gerais (item

5.1) foram quantificados pelo mtodo do pH diferencial descrito por Fuleki e
Francis (Terci, 2004). Neste procedimento, alquotas de 50 L de extrato aquoso
ou alcolico contendo antocianinas foram diludas em bales volumtricos de
10 mL contendo solues de pH 1,0 e pH 4,5. A seguir, foram feitas medidas
espectrofotomtricas a 510 e 700 nm.
5.3.2. Otimizao da Extrao de Antocianinas
5.3.2.1. Estudo de Temperatura x Rendimento de Extrao

Inicialmente, foram obtidos espectros eletrnicos de extratos antocinicos
preparados a partir de cascas de jambolo tendo-se gua, metanol e etanol como
solventes, na proporo entre massa de casca e o volume do solvente 1:3 m/v,
escolhida de acordo com os estudos anteriores (Terci e Rossi, 2002).Os espectros
foram obtidos para avaliao dos comprimentos de onda de absoro mxima dos
extratos, a serem usados na posterior quantificao das antocianinas.
Para se verificar a influncia da temperatura no rendimento de extrao de
antocianinas de jambolo, foram colocadas cerca de 15 g de cascas de jambolo
em um balo de fundo redondo de duas bocas de 250 mL e foram adicionados
50 mL do solvente de extrao (gua deionizada, etanol ou metanol). O balo foi
conectado a um condensador de bolas e mantido em banho termostatizado
previamente ajustado para a temperatura desejada. Durante as 10 horas iniciais,
alquotas de 50 L da soluo eram retiradas com uma micro-pipeta a cada hora e
diludas em 10 mL da soluo de pH 1,0 para as medidas espectrofotomtricas em
517 nm, comprimento de onda de mxima absoro das antocianinas de jambolo
neste pH. Sempre foram retiradas 3 alquotas para as medidas e o experimento foi
realizado a 25 2 C e a 46 2C. Nos experimentos realizados a 25 C, foram
retiradas alquotas referentes a 24 horas de extrao, para se avaliar uma possvel
tendncia no rendimento de extrao de antocianinas. Este procedimento no foi
realizado a 46oC, pois posteriormente foi realizado um planejamento fatorial,
detalhado na seqncia, visando-se avaliar melhor as influncias do tipo de
solvente, meio acidificado, tempo e temperatura de extrao.
5.3.2.2. Avaliao do Melhor Sistema de Extrao
A otimizao do procedimento de extrao de antocianinas foi realizada

mediante um planejamento fatorial 24, tendo-se como fatores: solvente de
extrao, acidificao do solvente, temperatura e tempo de extrao, em dois
nveis (+ e -) conforme listado a seguir:
1. solvente de extrao: metanol (-) e etanol (+);
2. acidificao do solvente: no acidificado (-) e acidificado com HCl 0,05% (+);
3. temperatura de extrao: 25oC (-) e 46oC (+);
4. tempo de extrao: 12 horas (-) e 24 horas (+)
Os sinais (-) referem-se aos nveis inferiores e os sinais (+) aos superiores.
Para a realizao dos experimentos referentes ao planejamento fatorial

foram utilizados 32 frascos escuros, visto que as antocianinas so fotossensveis.
Para a extrao das antocianinas, 1,0 g de cascas de jambolo e 3,0 mL de
solvente foram colocados em cada frasco, sendo que todos foram submetidos s
temperaturas de trabalho nos perodos indicados, seguindo-se o planejamento
pr-estabelecido com a alternncia dos nveis inferiores e superiores de cada
fator. Cabe ressaltar que os experimentos foram realizados aleatoriamente e em
duplicata conforme sugerido por Neto e colaboradores, 2002.
Alquotas de 100 L dos extratos obtidos eram colocadas em bales
volumtricos de 10 mL, completando-se o volume com a soluo de pH = 1,0
(HCl/KCl) para medida da absorbncia das solues em 517 nm.
5.3.3. Identificao das Antocianinas

Antocianinas foram identificadas aplicando-se Cromatografia em Papel e
Cromatografia Lquida de Alta Eficincia.
5.3.3.1. Cromatografia em Papel (PC)

Para a identificao das antocianinas do jambolo por PC, utilizou-se um
extrato aquoso de cascas da fruta na proporo 1:3 m/v. Empregou-se papel
cromatogrfico recortado em retngulos de 19 x 9 cm como suporte da fase
estacionria e uma mistura de solventes butanol, cido actico e gua (BAW), nas
propores 4:1:5 v/v/v como fase mvel (Harborne, 1967). Um bquer coberto
com filme de PVC foi saturado com o vapor da fase mvel e utilizado como cuba
cromatogrfica. Os papis foram retirados da cuba e secos ao ar livre aps a fase
mvel percorrer 12,5 cm do papel. As manchas de antocianinas apresentaram
colorao magenta, que se tornavam azuis na presena de vapores de NH3, todas
facilmente observveis e teis para identificao da presena de antocianinas. Os
fatores de retardamento (RF) das antocianinas foram calculados pela razo entre a
distncia do centro da mancha do pigmento em relao origem da corrida
cromatogrfica e a distncia total percorrida pela fase mvel (Braga e
Collins,1987).
5.3.3.2 Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (HPLC)

A identificao das antocianinas por HPLC foi realizada seguindo-se a
metodologia descrita por Goiffon et. al.(1999). Nas anlises, o volume de amostra
injetado na coluna era de 50 L. Como sistema de deteco utilizou-se um
espectrofotmetro UV-VIS e como fase mvel uma mistura de gua, acetonitrila e
cido frmico na proporo 81:9:10 v/v/v. Empregou-se um sistema isocrtico,
sendo a vazo da fase mvel 1 mL min-1.
As amostras injetadas foram extratos alcolicos de jambolo previamente
filtrados em filtros de membrana de 0,45 m.
5.3.4. Purificao do Extrato de Antocianinas

A purificao do extrato antocinico foi realizada por extrao em fase
slida (SPE) utilizando-se cartuchos C18 de 500 mg da Varian. De acordo com as
recomendaes do fabricante do cartucho, a quantidade de massa de material a
ser eludo deve ser da ordem de 1% da massa de sorvente contida no cartucho.
Sendo assim, apenas foram percolados extratos antocinicos contendo
quantidade de antocianinas inferior a 5 mg. A eficincia do processo foi verificada
a partir de testes de deteco de acares e cidos orgnicos, descritos na
seqncia, bem como pela avaliao da quantidade de antocianinas recuperada,
conforme descrito por Terci, 2004.
Inicialmente, o cartucho foi condicionado com a percolao de 5 mL de
metanol, seguidos por 5 mL de soluo aquosa de HCl 0,01% m/v. Ento o extrato
aquoso de jambolo era percolado e depois o cartucho era lavado com 10 mL da
soluo aquosa de HCl 0,01% v/v. Ao todo, 5 fraes de 2 mL foram coletadas e
nelas foram realizados os testes de deteco de acares e de cidos orgnicos.
Aps a lavagem do cartucho, as antocianinas foram eludas com 5 mL de HCl
0,01% v/v em metanol e coletadas em um balo volumtrico de 5 mL para
quantificao pelo mtodo do pH diferencial. Para avaliao do rendimento de
purificao, diferentes massas de antocianinas foram percoladas pelo cartucho
separadamente.
5.3.4.1 Deteco de Acares

A deteco de acares foi feita baseando-se no mtodo colorimtrico
descrito por Terci, 2004, o qual corresponde a uma adaptao do mtodo descrito
por Dubois (1956). Para tanto, solues aquosas de concentrao 1 g L-1 foram
preparadas com os padres de acar disponveis (arabinose, frutose, glicose,
lactose, manose, raminose e sacarose). Em tubos de ensaio, foram adicionados
300 L das solues de acar, 300 L de soluo aquosa de fenol 5% m/v, 1 mL
de H2SO4 concentrado e 400 L de gua destilada. Os tubos foram
termostatizados a 37 oC por 10 minutos. Este um teste colorimtrico pelo qual as
solues contendo acar apresentam colorao varivel entre amarelo e marrom.
5.3.4.2 Deteco de cidos Orgnicos

A deteco de cidos orgnicos foi realizada por cromatografia de papel,
seguindo procedimento do Manual Tcnico de Anlise Qumica de Alimentos do
Instituto de Tecnologia de Alimentos de Campinas (1990). Utilizou-se papel
cromatogrfico (19 x 9 cm), sendo a gua adsorvida neste a fase estacionria e
uma mistura de butanol, cido actico e gua, na proporo 4:1:1 v/v/v como fase
mvel. Adicionaram-se 0,02 g de azul de bromofenol cuba cromatogrfica
(bquer coberto com filme PVC), quantidade suficiente para obter soluo 1 g L-1
deste corante. Antes da corrida, a cuba foi saturada com a fase mvel. O papel
era retirado aps a ascenso de 10 cm da fase mvel e seco com ar quente.
Solues aquosas de cidos ascrbico, ctrico, fumrico, oxlico, succnico,
tartrico e mlico com concentrao de 5 g L-1 foram os padres de cidos
orgnicos testados. Realizou-se ainda uma corrida cromatogrfica com os padres
cujos RF se aproximaram daquele referente ao cido orgnico presente no extrato
de antocianinas de jambolo.
Cabe ressaltar que para a avaliao do rendimento de purificao,
diferentes volumes do extrato aquoso de jambolo foram percolados: 3,0; 4,0; 5,0
e 6,0 mL, respectivamente, e que as antocianinas foram quantificadas prvia e
posteriormente percolao (purificao) atravs do mtodo do pH diferencial .
5.3.5 Isolamento das Antocianinas

As antocianinas presentes no extrato purificado (etapa anterior) foram
isoladas em procedimento de HPLC a partir da injeo de 200 L do extrato,
utilizando-se uma mistura de gua, acetonitrila e cido frmico, na proporo
81:9:10 v/v/v como fase mvel. Empregou-se um sistema isocrtico de eluio,
com vazo de fase mvel de 1 mL min-1. Para a construo dos cromatogramas,
as fraes foram coletadas em tubos de ensaio e as leituras de absorbncia foram
realizadas em espectrofotmetro em 517 nm.
As fraes contendo as antocianinas coletadas aps este procedimento
foram mantidas por aproximadamente 4 horas em evaporador a vcuo
(temperatura ambiente) para eliminao do solvente.
Campos, D.D.P. Aspectos Analticos: Resultados e Discusses 39
CAPTULO 6
RESULTADOS E DISCUSSES
6.1. Quantificao das Antocianinas

A concentrao dos extratos antocinicos foi determinada pelo mtodo do
pH diferencial, que fundamentado nas transformaes estruturais das
antocianinas em funo do pH gerando solues coloridas (vide Figura 3, pgina
11). O ction flavlico, de colorao vermelha, a forma predominante em pH 1,0
enquanto que o carbinol, incolor, predomina em pH 4,5. Por isso, seguindo-se este
mtodo so feitas medidas espectrofotomtricas de antocianinas em solues de
pH 1,0 e 4,5, em 517 nm (mximo de absoro das antocianinas) e 700 nm, para
corrigir eventuais erros referentes ao espalhamento da luz, j que extratos de
frutas podem apresentar suspenses coloidais (Terci, 2004). Para seguir
exatamente a proposta de Fuleki e Francis (1968), realizou-se a medida da
absorbncia dos extratos em 700 nm, embora todos os valores obtidos tenham
sido nulos como era esperado j que no se observava material em suspenso.
Inicialmente, determina-se a absorbncia resultante das leituras das
solues pela equao I para o clculo da concentrao das antocianinas nos
extratos de acordo com a equao II.
A quantificao de extratos contendo antocianinas diferentes tambm pode
ser feita pela equao II, embora os valores de absortividade molar e massa molar
sejam referentes a cianidina 3-glicosdeo (cy-3-glu). Neste caso, o resultado
expressa a quantidade total de antocianinas. A utilizao da cianidina 3- glicosdeo
como uma espcie de padro de antocianinas, em diversos procedimentos
experimentais bastante comum na literatura e isto se deve abundncia desta
antocianina em frutas vermelhas (Terci, 2004).
A = ( A517 nm A700 nm ) pH = 1,0 ( A517 nm A700 nm ) pH = 4,5 Equao I
A MM
C= Equao II
b
onde: C a concentrao de antocianinas em g/L;

A a absorbncia calculada pela equao I;
MM a massa molar da cy-3glu (449,2 g.mol-1);
o coeficiente de absortividade molar da cy-3glu (26900 mol.L.cm -1)
b o caminho ptico (1,0 cm).
6.2. Otimizao da Extrao de Antocianinas de Jambolo
6.2.1. Espectro de Absoro das Antocianinas

Os estudos com as antocianinas iniciaram-se com a obteno de espectros
eletrnicos dos extratos brutos de jambolo, visando observar os comprimentos de
onda de mxima absoro. Para tanto, foram utilizados extratos em meio aquoso,
metanlico e etanlico, todos levemente acidificados com cido clordrico (HCl
0,01 % m/v). Os espectros obtidos encontram-se na Figura 4.
Solventes:
- metanol
- etanol
- gua
Figura 4. Espectros eletrnicos UV-VIS dos extratos antocinicos preparados com diferentes
solventes respeitando a proporo 1:3 massa de casca por volume de solvente.
Os espectros apresentados na Figura 4 indicam que, independente do

solvente utilizado, h 3 bandas de absoro mxima para os extratos, as quais
encontram-se em 206, 274 e 517 nm, respectivamente. Este dado condizente
com a literatura, segundo Harborne (1967), as antocianinas simples em solues
cidas apresentam duas absores mximas, uma na regio visvel entre 465 e
550 nm e outra, menos intensa, na regio UV, em torno de 275 nm. A banda de
absoro em 206 nm, visualizada na Figura 4, provavelmente refere-se
presena de acares livres, cidos orgnicos e outros polifenis contidos no
extrato bruto.
6.2.2. Efeito de tempo e temperatura no rendimento de extrao

A temperatura um fator importante na extrao das antocianinas, pois
estes pigmentos podem sofrer hidrlise quando submetidos ao aquecimento
(Okumura et. al., 2002). Este estudo teve como objetivo verificar o efeito do tempo
de extrao a diferentes temperaturas no rendimento de extrao de antocianinas
de jambolo, utilizando-se para tanto diferentes solventes. As Figuras 5 e 6
apresentam as curvas obtidas, onde as barras verticais correspondem aos desvios
da mdia obtida a partir de triplicatas.
0,32
0,28
0,24
Absorbncia a 517 nm
0,20
0,16
0,12 o
etanol, 25 C
o
0,08
metanol, 25 C
o
gua deionizada, 25 C
0,04
0 5 10 15 20 25
tempo (h)
Figura 5. Estudo da influncia do tempo de extrao das antocianinas de jambolo a 25 C.
0,7 o
etanol, 46 C
o
metanol, 46 C
0,6 o
gua deionizada, 46 C
Absorbncia a 517 nm
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0 2 4 6 8 10
tempo (h)
Figura 6. Estudo da influncia do tempo de extrao das antocianinas de jambolo a 46 C.

possvel observar pelas Figuras 5 e 6 que os solventes metanol e etanol

apresentaram um comportamento semelhante em relao extrao de
antocianinas, de forma que o metanol sempre se sobressaa como melhor
solvente, por possibilitar a extrao de uma quantidade maior de antocianinas em
ambas temperaturas analisadas. Por outro lado, a gua desionizada apresentou
um comportamento distinto, em geral, extraindo uma quantidade menor de
antocianinas em relao aos outros solventes.
Os resultados obtidos nos experimentos realizados a 25 C, Figura 5,
O
indicaram que a quantidade de antocianinas extradas aumenta com a durao da

extrao. Porm, um fato interessante que nas primeiras 5 horas de extrao, o
metanol apresentou um comportamento de extrao semelhante ao da gua,
podendo esta ltima ser preferida nestas condies. Pela Figura 5 possvel
concluir ainda que extraes de antocianinas em meio aquoso devem durar at 5
horas, visto que aps este perodo no se observa ganho significativo na
quantidade de antocianinas extradas.
Os resultados dos experimentos de extrao realizados a 46 oC, Figura 6,
sugerem que as antocianinas no tenham sido degradadas devido ao
aquecimento.
Neste contexto, foi conduzido o estudo cujos resultados so detalhados na
seqncia, visando encontrar as condies que permitam chegar mxima
extrao das antocianinas.
6.2.3. Avaliao do Melhor Sistema de Extrao

As antocianinas, muito solveis em gua, so facilmente extradas de
plantas utilizando-se solues polares, assim, muitos pesquisadores empregaram
apenas gua para a extrao enquanto outros trabalhos descrevem a utilizao de
solventes alcolicos acidificados ou no (Jackman et al., 1987). O objetivo desta
etapa foi avaliar o melhor sistema de extrao das antocianinas, ou seja, a
combinao entre solvente, temperatura e tempo de extrao responsvel pelo
maior rendimento de extrao de antocianinas. Para tanto, foi realizado um
Planejamento Fatorial 24, com a descrio dos fatores apresentada na Tabela 1.
Tabela 1. Fatores escolhidos para o planejamento fatorial e seus nveis.

Nveis
Fatores Inferior (-) Superior (+)
1. Solvente metanol etanol
2. Acidificao no acidificado HCl 0,05 % v/v
3. Temperatura 25C 46C
4. Tempo 12 h 24 h
Os experimentos foram realizados aleatoriamente, alternando-se os nveis

superiores e inferiores de cada fator e, juntamente com os resultados, esto
descritos na Tabela 2. Os ensaios assinalados com () referem-se s duplicatas.
Os resultados obtidos foram expressos pela razo (R) entre a absorbncia
das solues (A) (lida em 517 nm) e a massa das cascas de jambolo (m) na
tentativa de normalizao dos valores, j se espera que quanto maior quantidade
de cascas de jambolo, maior a quantidade de antocianinas. Por este motivo,
torna-se invivel avaliar o rendimento de extrao apenas pela absorbncia sem
se considerar a massa e, portanto, optou-se por avaliar a razo entre estes dados.
Os resultados descritos na Tabela 2 foram avaliados estatisticamente
conforme sugerido por Neto e colaboradores, 2002. Inicialmente, foi realizado um
planejamento 24, isto , um planejamento experimental com 4 fatores e 2 nveis.
Entende-se por fator, a varivel que se deseja avaliar sua influncia e que se tem
o controle sobre ela, enquanto os nveis so as possibilidades de variao
qualitativa ou quantitativa dos fatores. Neste trabalho, por exemplo, um dos fatores
analisados foi o solvente extrator para o qual havia dois nveis: metanol e etanol.
O objetivo do planejamento realizado foi investigar o efeito da variao dos fatores
na resposta do sistema, ou seja, o rendimento de extrao das antocianinas. Num
primeiro momento, foram calculados os efeitos principais e os efeitos de
interao para cada fator. O efeito principal para cada fator relaciona-se com a
variao da resposta do sistema quando o nvel do fator alterado. Para
determin-lo, leva-se em considerao as contribuies das mdias dos
experimentos realizados para cada nvel do fator. Os efeitos de interao ocorrem
quando o efeito de uma varivel depende do nvel de outra varivel, se os fatores
interagem, pode-se dizer que so interdependentes (Neto et. al., 2002).
Tabela 2. Experimentos de otimizao da extrao das antocianinas de jambolo.
Rmdio estimativa
T t m A
Ensaio S H+ o desvio padro
( C) (min) (g) em 517 nm
(g-1)
1 0,9569 0,238
- - - - 0,249 0,001
1 0,9639 0,240
2 1,0383 0,228
+ - - - 0,23 0,01
2 1,0822 0,256
3 0,9826 0,217
- + - - 0,23 0,01
3 0,9834 0,234
4 0,8001 0,222
+ + - - 0,25 0,04
4 0,8456 0,188
5 1,0271 0,312
. - + - 0,27 0,05
5 1,0729 0,253
6 1,3812 0,275
+ - + - 0,199 0,001
6 1,1372 0,225
7 0,8942 0,288
. + + - 0,29 0,05
7 0,8585 0,213
8 0,8998 0,189
+ + + - 0,23 0,02
8 0,9028 0,217
9 0,9104 0,234
. - - + 0,24 0,02
9 0,9123 0,208
10 0,8551 0,259
+ - - + 0,27 0,05
10 1,0340 0,248
11 0,9660 0,280
. + - + 0,27 0,03
11 0,9165 0,231
12 0,9615 0,248
+ + - + 0,24 0,02
12 0,8069 0,184
13 1,2716 0,252
. - + + 0,24 0,06
13 1,1063 0,308
14 0,9695 0,221
+ - + + 0,222 0,008
14 1,0036 0,217
15 1,1493 0,281
. + + + 0,246 0,003
15 0,9875 0,245
16 1,0306 0,178
+ + + + 0,22 0,07
16 0,9431 0,254
onde S refere-se ao tipo de solvente, H presena de HCl 0,05% v/v, T temperatura e t ao
+
tempo de extrao.
Os clculos dos efeitos principais e dos efeitos de interao so realizados

de acordo com as equaes (III) e (IV), respectivamente:
E x = m x( + ) m x ( ) Equao III
Ix,y = m x( )y( ) + m x( + )y( + ) [m x( )y( + ) + m x( + )y( ) ] Equao IV
onde: E corresponde ao efeito principal, I corresponde ao efeito de interao,

m corresponde mdia dos efeitos, x e y correspondem aos fatores
os sinais (+) e (-) correspondem aos nveis.
Os resultados referentes aos clculos dos efeitos principais esto

demonstrados na Tabela 3 e queles que se referem aos efeitos de interao
esto contidos na Tabela 4.
Tabela 3. Efeitos Principais calculados para cada fator.

Fator Efeito
1 - 0,0221
2 0,0073
3 -0,0076
4 0,0003
Tabela 4. Efeitos de Interao entre os fatores.

Interaes Efeitos
12 - 0,002
13 - 0,0218
23 - 0,0066
14 0,0111
24 - 0,063
34 - 0,0155
123 0,0028
124 -0,0151
134 0,0108
234 -0,0055
1234 0,0102
Para avaliar se os efeitos principais ou as interaes entre efeitos so

estatisticamente significativos, deve-se comparar seus valores absolutos com ,
que o produto do erro padro do efeito (Eefeito) pelo valor da Distribuio de
Student (t) correspondente, no intervalo de confiana desejado (neste caso, 95%).
O Efeito ser estatisticamente significativo caso seja numericamente maior .
No planejamento fatorial realizado, os ensaios foram feitos em duplicatas
visando estimar o erro experimental, e a partir da, avaliar a significncia
estatstica dos efeitos. Neste caso o termo duplicata refere-se realizao de
todas as etapas do procedimento novamente, desde a lavagem das vidrarias. A
importncia desta repetio incluir a variabilidade total do processo para se
determinar o erro experimental mais corretamente. Com esta mesma finalidade,
todos os experimentos foram realizados aleatoriamente.
A partir das repeties feitas numa dada combinao de nveis pode-se

obter uma estimativa do erro experimental nesta combinao. Primeiramente
obtm-se a varincia para cada par de valores (Vensaio) que pode ser considerada
uma estimativa da varincia tpica do procedimento experimental. A varincia
calculada de acordo com a equao V.
2
(
Vensaio = ( X n XM ) + X ' n XM ) 2
Equao V
onde: xn o valor da razo R = A / m (vide Tabela 2),

xn corresponde duplicata xM a mdia aritmtica entrexn e xn.
Cada um dos ensaios foi realizado 2 vezes, o que gerou uma estimativa da
varincia com 1 grau de liberdade. Para se obter uma estimativa da varincia
conjunta (Vconjunta), que se refere a todos os ensaios realizados, deve-se calcular a
mdia de todas as estimativas (Vensaio), ponderadas pelos respectivos graus de
liberdade (GL). No experimento realizado, foram obtidos 16 experimentos
independentes e, portanto, 16 graus de liberdade.
Vconjunta =
Vensaios
Equao VI
GL
A partir da varincia conjunta determina-se a varincia de um efeito (Vefeito)

a qual leva em considerao a contribuio de cada efeito para a varincia
conjunta. Nota-se pelas equaes III e IV que cada efeito calculado pela
diferena de duas mdias, em que metade dos experimentos contribui para uma
das mdias, enquanto a metade restante aparece na outra mdia. Assim, no
planejamento realizado, contendo 16 experimentos, sempre 8 experimentos
contriburam para cada uma das mdias. Desta forma, a contribuio de cada
efeito 1/8. Logo,
1
Vefeito = Vconjunta Equao VII
8
O erro padro do efeito (Eefeito) numericamente igual raiz quadrada da

varincia do efeito e, desta maneira, pode ser calculado pela equao VIII.
E efeito = Vefeito Equao VIII
Os valores de varincias e erro do efeito esto apresentados na Tabela 5.
Tabela 5. Valores de varincias e erro dos efeitos.

Vconjunta 0,0006
Vefeito 0,00007
Eefeito 0,009
Multiplicando-se o erro do efeito (0,009) pelo valor da distribuio de

Student para um intervalo de 95% de confiana (2,042) tem-se 0,018, valor que
chamamos anteriormente de . Voltando-se aos dados das Tabelas 3 e 4, pode-se
notar que apenas o efeito principal 1, correspondente ao tipo de solvente, e a
interao 13, correspondente interao solvente e temperatura, so
estatisticamente significativos por serem numericamente maiores que 0,018, num
intervalo de 95% de confiana, sendo ambos valores (em mdulo) iguais a 0,022.
Isto implica que para se obter maior rendimento na extrao de antocianinas
prefere-se o uso de metanol e o aquecimento do sistema de extrao a 46 C.
Trabalhando-se a temperatura 25 oC, os rendimentos de extrao foram menores
quando comparados aos sistemas a 46 oC, ainda assim, o metanol se sobressaiu
como melhor solvente. Em relao ao tempo de extrao e presena de cido,
pode-se dizer que estes fatores no influenciaram significativamente o rendimento
de extrao de antocianinas, portanto, estes fatores devem ser selecionados de
acordo com os objetivos especficos de cada extrao.
Cabe ressaltar que, nesta dissertao, optou-se por trabalhar com extratos
aquosos de antocianinas, visto que no possvel purificar extratos antocinicos
alcolicos por SPE, j que se utiliza justamente o metanol como eluente. Para
tornar a purificao de extratos alcolicos possvel, uma etapa prvia de
evaporao do solvente requerida, acrescentando mais uma etapa ao processo,
cuja realizao deve ser considerada em funo dos objetivos pretendidos. Neste
trabalho, os extratos foram obtidos utilizando-se gua como solvente
temperatura ambiente, encontrando-se em mdia 2,7 0,9 mg de antocianinas por
grama de casca de jambolo.
6.3. Identificao das Antocianinas
6.3.1. Cromatografia em Papel (PC)
Os testes com cromatografia em papel permitiram verificar visualmente 3

manchas com colorao violeta intensa, referentes s antocianinas presentes no
extrato de jambolo. O cromatograma obtido e os fatores de retardamento
calculados, juntamente com os respectivos desvios esto ilustrados na Figura 7.
Figura 7. Cromatograma do extrato antocinico de jambolo, com fatores de retardamento.
No total, 12 corridas cromatogrficas foram realizadas e os fatores de

retardamento (RF) para cada mancha correspondem mdia aritmtica dos
valores obtidos em cada corrida. A importncia das replicatas est associada ao
fato de que as antocianinas apresentam estruturas moleculares bastantes
semelhantes, muitas vezes distintas apenas na quantidade e posies de
hidroxilas, no grau de metilao e acilao, bem como no nmero de unidades de
acar ligado molcula (Jackman et al., 1987). Isto resulta em valores de RF
muito prximos. Neste contexto, pequenas diferenas no valor de RF podem ser
bastante significativas para a avaliao dos resultados.
Apesar da identificao de compostos por cromatografia sem padres no
ser recomendvel, este procedimento vem sendo aceito na literatura para
identificao de antocianinas em virtude da dificuldade da obteno de padres de
antocianinas e ao elevado preo destes padres. Seguindo dados e valores de
referncia descritos por Harborne (1967) para a primeira mancha h 5
possibilidades de antocianinas, para a segunda mancha 19 e para a terceira 26,

considerando-se os valores de RF tabelados dentro do intervalo de mdia e
estimativa de desvio padro determinados com os dados experimentais. J que
h mais de uma possibilidade de antocianina para cada mancha, optou-se por
utilizar um procedimento de HPLC.
6.3.2. Cromatografia Lquida de Alta Eficincia HPLC

O cromatograma obtido pela tcnica de HPLC para o extrato de jambolo
apresentou 4 picos, como mostra a Figura 8.
A517 (nm)
tempo (min)
Figura 8. Cromatograma obtido para o extrato de jambolo por HPLC.
A Figura 8 mostra que no extrato de jambolo esto presentes, no mnimo,

4 antocianinas diferentes.
Goiffon e colaboradores (1999) desenvolveram um mtodo para identificar
antocianinas por HPLC tomando como referncia o tempo de retardamento da
cianidina 3-glicosdeo, que a antocianina mais comumente encontrada nas
frutas. A despeito de todas as implicaes em erros, assume-se como vlida esta
metodologia para o caso de antocianinas, visto que seus padres apresentam um
custo muito elevado e a diversidade de compostos presentes em extratos naturais
muito ampla. Neste mtodo, estabelece-se um fator de correlao () que
corresponde razo entre o tempo de retardamento (ou tempo de reteno) da
antocianina que se deseja identificar e o tempo de retardamento da cianidina 3-
glicosdeo (cy 3-glu). Segundo Goiffon e colaboradores, o termo pode ser
calculado pela equao IX.
t' r
= Equao IX
t' r(cy 3glu)
onde: tr o tempo de retardamento da antocianina que se quer identificar
tr (cy-3glu) o tempo de retardamento da cianidina 3-gicosdeo, tomada como
padro.
Como a princpio no se sabia se o jambolo possui a cy-3glu, tomou-se

como referncia o extrato de uva, que contm esta antocianina e vem sendo
utilizado em estudos de nosso grupo. O tempo de retardamento do extrato de uva
da cy 3-glu, injetado na coluna nas mesmas condies de anlise do jambolo, foi
de 11,78 minutos. A Tabela 6 indica os tempos de retardamento das antocianinas
de jambolo, os valores calculados e aqueles encontrados na literatura (Goiffon
et al., 1999).
Tabela 6. Tempos de retardamento (tR) e respectivos para as antocianinas de jambolo.
tR calculado literatura* Antocianina

6,59 0,56 0,58 Delfinidina 3-glicosdeo
9,5 0,81 0,77 Cianidina 3-galactosdeo
12,82 1,09 1,17 Petunidina 3-galactosdeo
25,95 2,20 2,27 Pelargonidina 3-arabinosdeo
*Goiffon et. al.,1999
Estes resultados de HPLC levam identificao de 4 antocianinas,

enquanto que apenas 3 foram identificadas por PC, confirmando a esperada maior
eficincia da separao na coluna cromatogrfica.
Os dados da Tabela 6 sugerem a identificao das 4 antocianinas
presentes no extrato de jambolo, o que pode ser reforado pela comparao com
os resultados obtidos por cromatografia em papel. Segundo Harborne (1967) os
tempos de retardamento por PC da delfinidina 3-glicosdeo, petunidina 3-
galactosdeo e cianidina 3-galactosdeo so respectivamente 26, 33 e 37.
Retornando-se Figura 7, pode-se dizer que elas correspondem s segunda e
terceira manchas, porm, por cromatografia em papel no foi possvel separar
estes trs pigmentos adequadamente. O tempo de retardamento para a
pelargonidina 3-arabinosdeo por PC no citado na literatura. A comparao
entre os resultados obtidos por ambas tcnicas leva a concluir que a HPLC
permite uma maior eficincia de separao e maior facilidade de identificao,
porm a tcnica de PC pode ser utilizada previamente e apresenta a vantagem de
ter baixo custo a maior acessibilidade.
A Figura 8 ainda mostra um pico em 2,20 minutos. Este pico no
corresponde a uma antocianina, pois sua rea no proporcional concentrao
do extrato. Isto foi verificado pela injeo do mesmo extrato, porm diludo.
Verificou-se que no extrato diludo houve uma diminuio proporcional de todas as
reas, exceto a referente ao pico de 2,20 minutos. Muito provavelmente, este pico
refere-se a eluio de um componente que no interage com a fase estacionria,
como por exemplo, a fase mvel (Collins et.al.,1997).
Foram encontrados 2 artigos que trazem a identificao de antocianinas de
jambolo. No primeiro artigo, publicado em 1974, os autores identificaram trs
antocianinas por cromatografia em papel e hidrlise alcalina: delfinidina 3-
gentibiosdeo, petunidina 3-gentibiosdeo e malvinidina 3-laminaribiosdeo. Cabe
ressaltar que gentibiosdeo e laminaribiosdeo correspondem a duas glicoses
ligadas entre si pelos carbonos 1-5 e 1-3, respectivamente (Jain and Seshadri,
1974). J no segundo artigo, publicado por pesquisadores da Unicamp em 1982, a
nica antocianina encontrada foi a cianidina 3- glicosdeo (Bobbio and Scamparini,
1982). Em trabalho prvio de nosso grupo de pesquisa, foram identificadas 3
antocianinas presentes no extrato de jambolo: cianidina 3,5-diglicosdeo,
peonidina 3-glicosdeo e delfinidina 3-glicosdeo (Terci, 2004). Embora cada autor
tenha identificado diferentes antocianinas para o jambolo, estes dados reforam
a idia de que diferentes culturas, origens geogrficas, maturidade das plantas e
condies ambientais como intensidade de luz e temperatura, geram frutos
contendo diferentes antocianinas. Esta uma caracterstica to interessante que
vem servindo de base de estudos para comprovar a autenticidade de vinhos
comparando a impresso digital de suas antocianinas com quela da uva que o
originou. Para isso, houve a necessidade de construir extensos bancos de dados
de diferentes uvas provenientes de diversas culturas e origens enolgicas (Revilla
et al., 2001).
6.4. Purificao do Extrato de Antocianinas

Uma vez identificadas as antocianinas do extrato de jambolo, o prximo
passo foi promover sua purificao atravs da eliminao de acares e cidos
orgnicos. Portanto, inicialmente, foram feitos ensaios de deteco de acares e
cidos com padres comerciais disponveis para posteriormente avaliar a
purificao do extrato antocinico mediante a deteco destes compostos nas
fraes de lavagem.
6.4.1. Deteco de Acares

A deteco de acares foi feita baseando-se no mtodo colorimtrico
descrito por Dubois (1956) e adapatado por Terci (2004). Neste mtodo, solues
contendo acar apresentam colorao amarelo-alaranjada ao reagirem com fenol
e cido sulfrico concentrado. A Figura 9 demonstra que o teste pode ser aplicado
para os diferentes tipos de acar gerando solues com a colorao prevista.
Figura 9. Escala de cores para deteco de padres de acares de concentrao 1 g L-1

(a) ausncia de acar; (b) arabinose; (c) frutose; (d) glicose; (e) lactose; (f) manose; (g) raminose
e (h) sacarose.
Embora, a colorao das solues resultantes deste teste seja ligeiramente

diferente para diferentes padres, todas as coloraes so bastante distintas
daquela correspondente soluo sem acar que incolor. Isto sugere que o
teste seja adequado para a deteco de acares presentes em extratos de frutas.
A colorao das solues pode ser visualizada a olho nu quando a concentrao

de acar no tubo for superior a 7 g/mL.
6.4.2. Deteco de cidos Orgnicos

A deteco de cidos orgnicos foi realizada por cromatografia em papel,
utilizando-se os padres disponveis, seguindo procedimento descrito na literatura
(ITAL, 1990). A Figura 10 apresenta cromatogramas obtidos para estes padres e
tambm para o extrato de jambolo no purificado.
(a) (b) (c) (d) (e) (f) (g) (h)
Figura 10. Deteco de cidos orgnicos: (a) ascrbico; (b) ctrico; (c) fumrico; (d) oxlico;
(e) succnico; (f) tartrico; (g) mlico e (h) extrato aquoso de jambolo.
A partir de padres nas concentraes 5 g L-1.
O azul de bromofenol um indicador cido-base, portanto, como pode ser

observado na Figura 10, os cidos foram visualizados como manchas amarelas. A
parte da fase mvel por conter cido actico tambm apresentou colorao
amarela que se observa no incio da ascenso cromatogrfica (ainda na
Figura 10). Os cidos orgnicos que apresentaram fator de reteno mais prximo
ao daquele contido no extrato de jambolo foram aplicados juntamente em outro
papel numa tentativa sem sucesso de identificao, como pode ser visto na
Figura 11. Como identificar os cidos presentes no extrato no era um dos
objetivos deste trabalho, este aspecto no foi explorado.
(a) (b) (c) (d)
Figura 11. Comparao de padres de cidos orgnicos: (a) ctrico; (b) mlico; (c) oxlico com
(d) extrato aquoso de jambolo. A mancha laranja direita corresponde s antocianinas.
6.4.3 Avaliao da Purificao do Extrato

Aps a injeo do extrato no cartucho, este era lavado com 10 mL de uma
soluo aquosa de HCl 0,01%. Foram coletadas 3 fraes, nas quais foram
realizados os testes de deteco de acares e cidos orgnicos, apresentados a
seguir:
Figura 12. Deteco de acares nas fraes coletadas da purificao do extrato por SPE.
(a) (b) (c) (d)
Figura 13. Deteco de cidos orgnicos na purificao do extrato por SPE (a) gua milli-Q, (b)
extrato bruto de jambolo, (c) segunda frao de lavagem e (d) extrato purificado de jambolo.
A Figura 12 indica grande quantidade de acar na primeira frao de

lavagem (colorao intensa). Percebe-se que a concentrao de acar diminui
progressivamente nas fraes subseqentes, indicando a adequao do
procedimento de purificao para a eliminao de acares do extrato. De acordo
com estes resultados, recomenda-se lavar o cartucho com um volume mximo de
gua igual a 15 mL, o que suficiente para a purificao e no promove a perda
das antocianinas durante o processo.
Pela Figura 13 observa-se a presena de cidos orgnicos apenas no
extrato bruto de jambolo, letra (b). Na segunda frao de lavagem, letra (c), a
quantidade de cidos orgnicos presentes desprezvel. No extrato purificado,
letra (d), no possvel visualizar manchas relativas presena de cidos, o que
confirma a purificao do extrato.
Os testes de deteco de acares e cidos orgnicos foram coerentes
para indicar que o procedimento de purificao foi adequado e que no houve
necessidade de lavar exaustivamente o cartucho para a purificao; ao contrrio,
com apenas 10 mL de gua acidificada foi possvel limpar o cartucho, sem que
houvesse perda de antocianinas.
Aps os resultados negativos do teste de deteco de acar, a lavagem do
cartucho era suspensa e as antocianinas eram eludas com uma soluo
metanlica de HCl 0,01% m/v e coletadas em um balo volumtrico de 5 mL. Para
a quantificao das antocianinas presentes no extrato, 2 alquotas de 100 L eram
retiradas e diludas separadamente em 10 mL de soluo de pH 1,0 e 10 mL de
soluo de pH 4,5, seguindo-se o mtodo do pH diferencial, descrito por Fuleki e
Francis (1968).
Segundo as especificaes do fabricante, a quantidade de analito a
percolar o cartucho no deve exceder 1% em massa da quantidade do sorvente.
Assim, como os cartuchos contm 500 mg de fase ligada C18, o volume de extrato
a ser percolado foi calculado de forma a conter uma quantidade mxima de 5 mg
de antocianinas e foi expresso como volume relativo, ou seja o volume de extrato
contendo 5 mg de antocianinas equivale a 100%. A Tabela 7 contm o volume de
extrato percolado (V), o volume relativo (Vrel) e a percentagem em massa de
antocianina recuperada, calculada segundo o mtodo do pH diferencial.
Tabela 7. Dados da purificao das antocianinas por SPE.

V Vrel mp mR
% recuperao
(mL) (%) (g) (g)
6,0 95 4,78 3,94 82
5,0 79 3,98 3,54 89
4,0 63 3,19 2,91 91
3,0 48 2,39 2,25 94
* o volume de 6,3 mL equivale a 5 mg de antocianinas.
possvel observar pela Tabela 7 que a porcentagem de recuperao em

massa das antocianinas maior quando o volume de extrato percolado pelo
cartucho menor. Isto pode estar relacionado ao fato de que o extrato bruto
contm outros componentes, como outros polifenis e compostos orgnicos, que
ocupam os stios ativos da fase C18 no permitindo a partio das antocianinas, as
quais no ficam retidas no cartucho.
Segundo K-Schafhalter e colaboradores (1998) os cartuchos de SPE

podem ser re-utilizados at 7 vezes, sem que haja perda da eficincia na
purificao, os dados experimentais obtidos no presente trabalho, comprovam
esta observao. Os dados, relativos a re-utilizao do cartucho, encontram-se
descritos na Tabela 8.
Tabela 8. Dados da purificao das antocianinas por SPE.

percolao mp mR %
(g) (g) recuperao
1 2,87 2,87 100
2 2,87 2,90 101
3 2,87 2,79 97
4 2,87 2,85 99
5 2,87 2,87 100
6 2,87 2,87 100
7 2,87 2,91 101
8a 2,87 2,69 94
mp corresponde massa de antocianinas percolada e mR massa recuperada.
De acordo com os resultados apresentados na Tabela 8, pode-se afirmar

que possvel utilizar cada cartucho pelo menos 7 vezes consecutivas sem que
tenha sido observada perda na eficincia de purificao. Na oitava tentativa de
purificao, verificou-se uma diminuio de cerca de 6% no rendimento. Porm,
dependendo dos objetivos pretendidos, esta perda pode ser considerada
desprezvel.
As antocianinas totais obtidas por este mtodo de purificao foram levadas
evaporao do solvente temperatura ambiente para uso nos ensaios
biolgicos.
6.5. Isolamento das Antocianinas

O isolamento das antocianinas tambm realizado seguindo-se a
metodologia de Goiffon e colaboradores (1999). Alquotas de 0,5 mL foram
coletadas e a absorbncia foi registrada para a montagem do cromatograma
representado na Figura 14. Este procedimento foi adotado para contornar
problemas de ordem instrumental que impediram a obteno dos cromatogramas

e deve ser considerado ao se notar sua aparente baixa resoluo.
2,5
Absorbncia a 522 nm
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
0 10 20 30 40
Frao
Figura 14. Cromatograma da separao das antocianinas, construdo a partir das fraes
coletadas. As fraes (eixo x) correspondem s solues contidas nos tubos de ensaio que foram
coletadas aps a passagem da amostra pela coluna cromatogrfica.
No desenvolvimento deste trabalho, foi cogitado o emprego da tcnica de

ressonncia magntica nuclear de prtons para a identificao das antocianinas
isoladas. A quantidade mxima de material isolado, cerca de 0,4 mg, no foi
suficiente para este teste, sendo necessria uma quantidade mnima de
antocianinas em torno de 10 mg. Esta massa de antocianina foi obtida a partir de 3
corridas cromatogrficas da mistura de 3 extratos purificados por SPE, cada um
contendo em mdia 3 mg de antocianinas totais. Eventualmente, o uso de
cromatografia em coluna aberta para o isolamento das antocianinas possa
representar uma alternativa mais adequada para isola-las em maior quantidade.
Campos, D.D.P. Aspectos Analticos: Concluses 61
CAPTULO 7
CONCLUSES
Campos, D.D.P. Aspectos Analticos: Concluses 63
As antocianinas podem ser extradas em meio aquoso ou alcolico. O

planejamento fatorial indicou que o tipo de solvente e a temperatura so fatores
que influenciam o rendimento de extrao de antocianinas. Para se extrair
antocianinas com o maior rendimento deve-se utilizar metanol a 46 C. Porm, as
condies do extrato devem ser adequadas s caractersticas compatveis com
aplicaes pretendidas. Por exemplo, para posterior purificao por SPE em
cartucho C18 ou mesmo para aplicaes biolgicas diretas, o extrato deve ser
aquoso. Assim, neste trabalho, trabalhou-se com extratos aquosos visando a
posterior purificao das antocianinas por SPE.
As tcnicas de PC e HPLC propuseram a identificao das antocianinas
presentes no extrato de jambolo como sendo delfinidina 3-glicosdeo, cianidina 3-
galactosdeo, pelargonidina 3-glicosdeo e pelargonidina 3-arabinosdeo.
A tcnica de extrao em fase slida com cartucho C18 demonstrou ser
adequada para a purificao do extrato aquoso de jambolo, pois permitiu a
eliminao de acares e cidos orgnicos do extrato, alm de possibilitar a
recuperao de antocianinas com grande eficincia. Os cartuchos podem ser
utilizados, no mnimo, 7 vezes, sem que haja perda da eficincia de purificao.
Em geral, ao se percolar uma quantidade de antocianinas em massa inferior a
3 mg (cerca de 60% da capacidade do cartucho) obtm-se rendimento de
purificao em torno de 100%, aumentando-se a massa de antocianinas para
5 mg, capacidade mxima do cartucho, tem-se rendimento em torno de 82%.
As antocianinas purificadas foram adequadamente separadas por HPLC e
coletadas em fraes de 0,5 mL para a realizao dos testes biolgicos. Porm,
inicialmente, avaliou-se o efeito biolgico das antocianinas totais contidas no
extrato purificado, os quais apresentaram em mdia a concentrao de
0,8 0,2 g L-1, equivalente a 1,7 0,4 mmol L-1 de antocianinas totais (expressa
como cianidina 3-glicosdeo). Para a realizao dos testes biolgicos in vivo,
vrios extratos purificados foram agrupados, o solvente evaporado e as
antocianinas novamente dissolvidas em um volume menor de gua, visando-se
aumentar as concentraes.
Campos, D.D.P. Aspectos Biolgicos 65
PARTE 2
ASPECTOS BIOLGICOS
Campos, D.D.P. Aspectos Biolgicos: Introduo 67
CAPTULO 8
INTRODUO
8.1. Propriedades Biolgicas dos Flavonides

Inicialmente, os flavonides foram reconhecidos por sua importncia na
manuteno da integridade das paredes e da resistncia dos capilares
sanguneos. Posteriormente, outras propriedades foram descritas para esta famlia
de molculas, incluindo: atividades anti-hipertensiva, antiarrtmica, anti-
colesterolmica, hepatotxica, anti-hemorrgica, anti-tumoral, anti-trombtica,
antiinflamatria e antialrgica, alm de atuarem como estabilizantes de plaquetas
e mastcitos. Os flavonides possuem tambm potencial funo protetora contra
doenas cardiovasculares e coronarianas, podendo atuar ainda contra vrias
formas de cncer (Gryglewski et al., 1987; Hertog et al., 1993; Formica e
Regelson, 1995; Hertog, 1996; Rice-Evans et al., 1996).
A variedade dos efeitos biolgicos dos flavonides em inmeros sistemas
celulares in vitro, bem como in vivo, tem sido descrita por vrios autores.
Flavonides podem inibir muitas enzimas importantes nos sistemas celulares
como: ATPase, fosfolipase, ciclooxigenase, lipoxigenase, aldose redutase,
hexoquinase, NADH oxidase, succinoxidase, xantina oxidase e protena quinase
(Bohmont et al., 1987; Hille e Sprecher, 1987, Ferriola et al., 1989; Formica e
Regelson, 1995). Podem, ainda, induzir vrias enzimas como aril hidroxilase e
epxido hidroxilase (Das, 1994) e atuar na diminuio da peroxidao lipdica (Das
e Ray, 1988). A capacidade antioxidante dos flavonides pode inibir a produo de
radicais livres nas clulas (Haenen et al., 1997; Metodiewa et al. 1999).
De maneira geral, os flavonides parecem possuir muitas propriedades que
os tornam excelentes agentes naturais modificadores da resposta biolgica.
Atualmente, muita nfase tem sido dada as suas propriedades antioxidantes e seu
papel inibitrio na proliferao de clulas de cncer em cultura e em vrios
estgios de desenvolvimento tumoral estudados em animais. As atividades
antioxidante e quelante dos flavonides so, provavelmente, os fatores mais
importantes na sua ao de proteo contra degradao em tecidos e clulas por
radicais livres (Miranda, 2000).
Com relao s antocianinas em particular, Milbury e colaboradores (2002)
examinaram sua biodisponibilidade e farmacocintica em 4 mulheres com idade
mdia de 67 anos em bom estado de sade. Os autores investigaram a presena

de antocianidinas glicosiladas (antocianinas) na urina e no plasma sanguneo aps
a ingesto de um suco de fruta contendo 720 mg destas substncias. Os autores
perceberam que as antocianinas na forma glicosilada so absorvidas no plasma
sanguneo e sua eliminao do plasma seguiu uma cintica de primeira ordem,
sendo que a maior parte dos compostos foi excretada na urina em 4 horas.
Vrios autores estudaram a atividade antioxidante de antocianinas (Nielsen
et. al., 2003, Cho et. al., 2003; Bagchi et. al., 2004). Wang e colaboradores (1999)
atriburam atividade antioxidante e anti-inflamatria cianidina extrada de cerejas
em estudos realizados in vitro. O efeito antioxidante observado para a cianidina,
em concentrao 2 mmol L-1 foi superior ao da vitamina E. A propriedade anti-
inflamatria desta molcula foi observada por sua capacidade de inibir as enzimas
prostaglena H endoperxido sintase-1 e prostaglena H endoperxido sintase-2
com IC50 (concentrao do composto que promove a inibio de 50% da atividade
enzimtica) de 90 e 60 mmol L-1, respectivamente. Amorini e colaboradores (2003)
descreveram a capacidade da cianidina 3-glicosdeo de proteger o miocrdio e
eritrcitos de ratos de danos mediados por espcies reativas de oxignio,
propriedade que est associada ao efeito antioxidante das antocianinas.
Mais recentemente, a atividade anti-tumoral de extratos ricos em
antocianinas (AREs) foi avaliada por Zhao e colaboradores (2004). Os autores
testaram trs AREs contendo entre 10 e 75 g de antocianinas/mL em clulas
tumorais da linhagem HT-29 (cncer de clon) e em clulas de clon no tumorais
NCM460. Verificaram que todos os extratos inibiram aproximadamente 50% da
proliferao de clulas HT-29 quando estas clulas foram submetidas a 25 g de
antocianinas/mL durante 48 horas, o que no foi observado para as clulas de
clon no tumorais cuja proliferao praticamente no foi afetada na presena de
antocianinas.
Estudos recentes tm demonstrado a importncia das antocianinas em
diversos eventos biolgicos (Chang, et. al., 2005; Chen et. al., 2005; Duthie et. al.,
2005; Heo and Lee, 2005; Talavra et.al., 2005; Fleschhut, et.al., 2006).
Entretanto, no h dados sobre efeitos destes flavonides em fosfatases, enzimas
essenciais em diversos mecanismos de controle biolgico no organismo. Uma

breve discusso sobre esta famlia de enzimas est descrita a seguir.
8.2. Enzimas Fosfatases

Conforme mencionado, os flavonides possuem importantes atividades
biolgicas, muitas das quais so resultantes da capacidade destes compostos
inibir ou ativar a atividade de enzimas especficas. Aoyama e colaboradores tem
estudado sistematicamente as enzimas fosfatases sobre o mbito de purificao,
caracterizao e regulao destas frente a inibidores especficos. H tambm
estudos sobre o efeito de flavonides (disponveis comercialmente) na atividade
das fosfatases, o que originou parte desta dissertao (Taga et.al.,1997; Ferreira
et.al., 1998 a-b; Ferreira et.al., 1999; Aoyama et. al., 2001; Silva, 2002; Miranda,
2000; Aoyama et. al., 2003; Freire et. al. 2003 a-b; Miranda, 2005).
As fosfatases so hidrolases que utilizam como substratos
fosfatomonosteres. Tais enzimas esto amplamente distribudas na natureza,
tendo sido encontradas em animais, vegetais e em microorganismos e so
divididas em trs grupos principais: fosfatases cidas, fosfatases alcalinas e
protenas fosfatases. Enquanto as fosfatases cidas apresentam um pH timo
para catlise em torno de 5,0, as alcalinas apresentam o pH timo ao redor de 9,0.
Ambas atuam em substratos de baixa massa molecular, como por exemplo,
acares fosforilados, entretanto, elas possuem diferentes mecanismos de reao
e somente as fosfatases alcalinas necessitam de ons bivalentes, tais como
magnsio, cobalto ou mangans para a catlise. Os mecanismos das reaes
podem ser observados a seguir e foram propostos por Vicent e colaboradores em
1992 e citados pelo grupo de Aoyama (Aoyama et.al., 2003).
Fosfatase Alcalina
E + ROPO32- E.ROPO32- E-PO32- E.Pi E + Pi
Fosfatase cida ROH H O

2
E + ROPO3H2 E.ROPO E - PO3H2 ROH + H2PO4-
Em organismos eucariticos, as fosfatases cidas so classificadas, de

acordo com a massa molecular relativa (Mr) e pelos padres de inibio, em 3
grandes grupos (Silva, 2002):
i. fosfatases cidas de alta Mr ou tartarato-resistentes, enzimas que
possuem massa molecular superior a 100 kDa e no so inibidas pelo
tartarato;
ii. fosfatases de Mr intermediria, enzimas que possuem massa molecular
entre 20 e 100 kDa e so inibidas pelo fluoreto;
iii. fosfatases de baixa Mr, enzimas com massa molecular inferior a 20 kDa
e so inibidas pelo p-hidroximercuribenzoato.
As fosfatases cidas de alta e intermediria Mr podem conter ferro, zinco ou

magnsio e, algumas vezes, carboidratos. Elas esto presentes em diversos
tecidos animais e possuem distribuio extremamente variada, podendo ser
encontradas em secrees como saliva, smen, e em diversos tecidos e rgos
como: prstata, placenta, crebro, fgado, corao, bao, rim, glndulas salivares,
ossos, gengiva, nervos e glnglios nervosos. Estudos citoqumicos revelaram a
presena destas enzimas em diferentes locais da clula: ncleo, mitocndrias,
membranas, lisossomo, complexo de golgi e retculo endoplasmtico. No sangue,
as fosfatases podem ser detectadas tanto nos eritrcitos, leuccitos, plaquetas,
como no plasma, onde algumas vezes so utilizadas como meio de diagnstico
para algumas doenas. A atividade alterada da fosfatase cida plasmtica til
nos prognsticos dos cnceres de prstata e ovrio (Silva, 2002).
As fosfatases cidas de baixa Mr so classificadas como protenas
tirosina fosfatases e correspondem a uma classe de enzimas essencial ao
organismo, visto que o balano entre a fosforilao e a desfosforilao de
protenas a base para o controle de diversos eventos biolgicos disparados por
efetores (ou reguladores) extracelulares, como hormnios, mitgenos,
carcingenos, citocinas, neurotransmissores, substncias ou metablitos txicos
(Miranda, 2005). Em conseqncia ao destes efetores ocorre regulao da
diviso, diferenciao e desenvolvimento celular, regulao do metabolismo e
expresso gnica, contrao, transporte, locomoo celular, aprendizado e

memria (Trowbridge, 1991; Cohen, 1992; Johnson & Barford, 1993; Denu et. al.,
1996). Cabe ressaltar que antagonicamente ao das enzimas fosfatases atuam
as enzimas quinases, responsveis por adicionar grupamentos fosfato em seus
substratos, de forma que a fosforilao reversvel de protenas catalisada pela
ao oposta e dinmica de protenas quinases e fosfatases (Aoyama et.al., 2003).
Os ensaios biolgicos utilizados para verificar a ao de diferentes
substncias em organismos vivos so denominados bioensaios, sendo alguns
descritos na seqncia. Neste trabalho, foram realizados diferentes experimentos
procurando avaliar o efeito das antocianinas em fosfatases de camundongos e em
cultura de clulas.
8.3. Bioensaios
O bioensaio definido como a estimativa da concentrao ou da potncia
de determinada substncia atravs da medida da resposta biolgica por ela
produzida. Assim, o bioensaio utilizado com a finalidade de medir a atividade
farmacolgica de substncias novas ou quimicamente no definidas, investigar a
funo dos mediadores endgenos e medir a toxicidade das drogas e seus efeitos
indesejveis. Atualmente, um dos principais objetivos do bioensaio fornecer
informaes que iro prever o efeito da droga em situaes clnicas. A escolha
dos sistemas de testes laboratoriais (modelos in vivo e in vitro) que proporcionam
este elo previsvel tem sido alvo de muita ateno (Rang et.al., 2001).
Os ensaios in vitro apresentam grande aceitao no meio cientfico, no
apenas devido contribuio nas investigaes do mecanismo de toxicidade de
diversas drogas, mas tambm devido s suas vantagens em relao aos sistemas
in vivo, tais como: melhor reprodutibilidade dos ensaios e resultados, simplicidade,
rapidez, diminuio do custo e reduo do nmero de animais utilizados em
experimentos (Chu, 1995). O termo in vitro refere-se primariamente ao manuseio
de clulas e tecido retirados do organismo sob condies que permitem sua
estabilidade, crescimento e diferenciao. As tcnicas de cultura de clulas so
fundamentais para a compreenso e melhorias de procedimentos em biologia
celular e molecular e tm sido empregadas com crescente freqncia na qumica

medicinal, farmacologia, gentica, biologia reprodutiva e oncologia (Barile, 1994).
Atravs dos estudos de citotoxicidade possvel determinar o potencial de
um agente causar dano celular. Os efeitos citotxicos podem comprometer a
viabilidade das clulas de diversas maneiras, como, por exemplo, alterando
integridade estrutural, metablica e reprodutiva, podendo levar inibio da
diviso ou morte celular (Repetto & Sanz, 1993).
Existem 3 tipos de citotoxicidade: basal, rgo-especfica e organizacional.
A citotoxicidade basal engloba processos celulares fundamentais que envolvem
estruturas e funes comuns a todas as clulas do organismo (membrana celular,
mitocndrias, ribossomos, ncleo e lisossomos). Na rgo-especfica, ocorre o
efeito de um composto ou droga em uma funo especializada. A citotoxicidade do
tipo organizacional causada por drogas que interferem com produtos do
metabolismo ou secreo celular, interferindo em funes rgo-especfica ou
funes organizacionais (Barile, 1994).
Um dos testes de viabilidade celular muito utilizado para avaliar danos
celulares baseia-se na reduo do corante MTT [brometo de (3-(4,5-dimetiltiazol-
2-il)-2,5-difeniltetrazolio] a formazano. Este teste envolve a absoro do sal MTT
pelas clulas e sua reduo no interior da mitocndria a um produto chamado
formazano, o qual acumulado no interior da clula e extrado atravs da adio
de um solvente apropriado, no caso, o etanol. O formazano pode ser quantificado
pela sua absoro a 570 nm em um espectrofotmetro e sua quantidade
proporcional ao nmero de clulas viveis, que so as nicas que metabolizam o
MTT. Entre outros mtodos utilizados na avaliao da viabilidade celular,
destacam-se:
- Incorporao do Vermelho Neutro (cloridrato de 2-amino-3-metil-7-
dimetil-amino fenanzina): avalia a integridade da membrana lisossomal
(Renzi et. al., 1993);
- Contedo de cidos nuclicos e dosagem de protenas: oferece um
indicativo do nmero de clulas, porm, no evidencia morte ou
diferenciao celular (Cingi et. al., 1991);
- Excluso do azul de tripan: avalia a integridade de membranas, pois as

clulas viveis excluem o corante (Renzi et. al., 1993);
- Dosagem da atividade de fosfatases fornece indicao do
metabolismo celular em relao ao metabolismo do fosfato (Aoyama et.
al., 2000).
Nesta dissertao, os linfcitos foram escolhidos como clulas-alvo para os

testes in vitro, pois em 2003, no havia trabalhos publicados na literatura
avaliando-se o efeito de antocianinas neste tipo de clulas. Os linfcitos so
clulas essenciais para o sistema imunolgico e tem sido extensamente
estudadas pelo grupo de Hiroshi Aoyama.
8.4. Linfcitos Humanos

Assim como as demais clulas sanguneas, os linfcitos dos mamferos
originam-se das clulas tronco hematopoiticas, atravs de uma srie de eventos
complexos de diferenciao e se tornam maduros. Estas clulas se congregam
em tecidos especializados conhecidos como rgos linfides, sendo os principais
tecidos linfides: a medula ssea, o timo, o bao, as adenides, as tonsilas, o
apndice, os linfonodos e as placas de Peyer (Abbas et. al., 2000).
A funo dos linfcitos defender o organismo contra a invaso de
patgenos. Eles se distinguem em duas linhagens principais, conhecidas como
clulas T (derivadas do timo) e clulas B (derivadas da medula ssea). As
propores relativas de clulas T e B variam entre tecidos, e no sangue perifrico,
representam cerca de 75% e 10% de todos os linfcitos, respectivamente. Alm
disso, os linfcitos B e T apresentam diferentes funes. Os linfcitos B ao
reconhecerem antgenos extra-celulares ou antgenos em superfcies de clulas
se diferenciam em clulas secretoras de imunoglobulinas. Os linfcitos T
reconhecem e respondem aos antgenos ligados ao complexo de
histocompatibilidade (MHC) na superfcie de outras clulas e so classificados em
T helper, que secretam citocinas que estimulam a proliferao e diferenciao de
outras clulas de defesa, e linfcitos T citotxicos os quais lisam as clulas que
expressam antgenos. H uma terceira classe de linfcitos, os Natural Killers

(NK), a qual responsvel pela imunidade inata contra vrus e microorganismos
intracelulares (Abbas et al., 2000).
Os linfcitos so responsveis pela produo de diversas substncias,
entre elas, mediadores inflamatrios como citocinas, peptdeos solveis
secretados por uma variedade de clulas. Estas citocinas incluem os interferons,
importantes na limitao da propagao de determinadas infeces virais, e as
interleucinas, as quais esto envolvidas na induo de diviso e diferenciao de
outras clulas (Abbas et al., 2000).
O cncer dos leuccitos (glbulos brancos) denominado leucemia e
muitas vezes no tem origem conhecida, mas tem como principal caracterstica o
acmulo de clulas jovens (blsticas) anormais na medula ssea, que substituem
as clulas sanguneas normais. O tipo de leucemia mais freqente na criana a
leucemia linfide aguda (ou linfoblstica). A leucemia mielide aguda mais
comum no adulto. Esta ltima tem vrios subtipos: mieloblstica, promieloctica,
mielomonoctica, monoctica, eritroctica e megacarioctica (INCA,2006).
8.5 Linhagem Celular da Leucemia Mielide Humana (HL60)

Para este trabalho, as clulas da leucemia promieloctica humana, HL60,
foram isoladas do sangue de um paciente com leucemia promieloctica aguda e
proliferam continuamente em suspenso, consistindo predominantemente de
promielcitos (Newburger et al., 1979; Breitman, 1990), porm, 4-5% delas
mostram caractersticas morfolgicas de clulas mielides mais maduras, como
mielcitos, metamielcitos, bastes e leuccitos polimorfonucleares (Newburger et
al., 1979). Estas clulas representam um sistema experimental para o estudo in
vitro da diferenciao leucmica, bem como alvo do estudo de possveis drogas
que podero ser utilizadas no tratamento dos diferentes tipos de leucemias
(Sokoloski and Sartorelli, 1997; Uzunoglu et al, 1999).
Campos, D.D.P. Objetivos: Aspectos Biolgicos 77
CAPTULO 9
OBJETIVOS
Campos, D.D.P. Objetivos: Aspectos Biolgicos 79
Nesta parte do trabalho, visou-se realizar os testes biolgicos com as

antocianinas previamente extradas e purificadas, sendo priorizadas as seguintes
etapas:
- Realizao dos testes in vivo para a avaliao do efeito de antocianinas

na atividade de enzimas fosfatases de camundongos;
- Realizao dos testes in vitro para a avaliao da citotoxicidade de

antocianinas em clulas de linfcitos sadias e tumorais da linhagem de leucemia
mielide humana (HL-60).
Campos, D.D.P. Aspectos Biolgicos: Parte Experimental 81
CAPTULO 10
PARTE EXPERIMENTAL
10.1. Reagentes, Materiais e Equipamentos
Reagentes:
- Albumina de soro bovino Sigma; glicina Merck; -mercaptoetanol Sigma;
MTT brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio] Sigma;
hidrxido de sdio Synth; p-hidroximercuribenzoato, pHMB, Sigma; p-
nitrofenil-N-acetil--glicosamina; reagente de Ficoll-PaqueTM Plus
(Amersham Bioscience); reagente de Folin Ciocalteu Merck; soro fetal
bovino inativado Nutricell; sulfato de cobre Ecibra; sulfato de p-nitro catecol
Sigma; tartarato de sdio Art Lab.; meio de cultura RPMI (Roswell Park
Memorial Institute); todos de pureza analtica.
Materiais:
- placas para cultura de clulas Corning;
- vidrarias de uso geral.
Equipamentos:
- cmara de Neubauer 0,0025 mm2 Loptik Labor;
- centrfuga 212 Fanem;
- espectrofotmetro Ultrospec 2000, Amersham Bioscience;
- estufa de CO2 Forma Scientifica SL Shel Lab;
- fluxo laminar Steril Gard III Advance - The Baker Company;
- triturador Omni-mixer MWDR Survall;
10.2. Procedimentos Experimentais
10.2.1. Ensaios in vitro

a) Obteno e Cultura Primria de Linfcitos
Os linfcitos foram obtidos coletando-se cerca de 50 mL do sangue
perifrico de voluntrios saudveis no fumantes e que no estavam fazendo uso
de medicamentos (conforme aprovado pela Comisso de tica em Pesquisa da
Faculdade de Cincias Mdicas - UNICAMP, no 219/2000). O sangue coletado foi
diludo em meio para cultura RPMI na proporo 1:1 v/v. Este meio continha
glutamina 0,200 g/L e antibiticos (100 UI/mL de penicilina e 100 g/mL
estreptomicina) para evitar proliferao bacteriana. Em tubos de centrfuga foram
adicionados 3 mL do reagente de Ficoll-PaqueTM Plus e 11 mL de sangue diludo.
Os tubos foram centrifugados a 1500 rpm durante 30 minutos onde houve a
separao dos componentes do sangue por diferena de densidade. Com uma
pipeta pasteur, retirou-se a nuvem de linfcitos a qual foi centrifugada juntamente
com RPMI a 1500 rpm para lavagem. Este procedimento foi repetido por duas
vezes e ao seu trmino, os linfcitos foram re-suspensos em RPMI suplementado
com 10% de soro fetal bovino e contados. Os linfcitos obtidos foram colocados
em placas para cultura com 24 cavidades de forma a conter 1 x 106 clulas por
mililitro em cada cavidade. As clulas foram incubadas em estufa a 37oC sob
atmosfera mida e contendo 5% de CO2.
b) Cultura de Clulas Tumorais - Linhagem HL60

As clulas HL60 foram mantidas em cultura contnua, atravs de repiques
peridicos (72 horas) e foram utilizadas quando atingiram uma densidade de 1 x
106 clulas/mL. O cultivo foi realizado em RPMI suplementado com 10% de soro
fetal bovino inativado (mesmas condies das clulas sadias). A incubao foi
feita em estufa a 37oC sob atmosfera mida e contendo 5% de CO2.
c) Tratamento das Culturas de Linfcitos Sadios e Clulas HL-60 com

Antocianinas
Tanto a cultura primria de linfcitos quanto a contnua (HL-60) foram
mantidas em estufa a 37oC, ambas submetidas individualmente ao mesmo
procedimento relatado na seqncia. Aps 48 horas de incubao, 800 L do
meio contendo as clulas foram cuidadosamente retirados e acrescentou-se o
mesmo volume de diferentes solues estoque contendo as antocianinas totais
previamente purificadas e diludas em RPMI. As concentraes finais de
antocianinas em cada cavidade da placa de cultura foram 50, 100, 200, 300 e
400 mol L-1. Cabe ressaltar que foi realizado um controle (clulas na ausncia de
antocianinas). As placas foram mantidas em estufa por 24 horas, aps este

perodo, 800 L do meio contendo as clulas foi cuidadosamente retirado e
descartado e adicionaram-se 800 L de corante MTT (dissolvido em RPMI na
concentrao de 1mg/mL). Aps 4 horas, o meio de cultura foi retirado e 1 mL de
etanol absoluto foi adicionado em cada cavidade, a seguir realizou-se a leitura da
absorbncia a 570 nm. Cabe ressaltar que todo o procedimento foi realizado em
triplicata e no fluxo laminar de clulas para no haver contaminaes das culturas.
10.2.2. Ensaios in vivo

O efeito biolgico das antocianinas sobre a atividade fosfatsica de
camundongos foi avaliado atravs da administrao subcutnea do extrato aquoso
purificado equivalente a 10 mg de antocianinas totais por kg de massa corprea
do animal. Esta quantidade de antocianinas foi estimada tendo-se como parmetro
trabalhos realizados com flavonides comerciais disponveis na literatura. Ao todo
foram utilizados para o experimento 10 camundongos albinos machos da linhagem
Swiss pesando entre 25 e 35 g cada. Estes animais foram submetidos a ciclos
claro/escuro de 12 horas, com gua e alimentao ad libitum, temperatura
ambiente monitorada entre 22C, alojados coletivamente (5 animais por gaiola) e
aclimatados ao local de experimentao por pelo menos 7 dias. Os animais foram
divididos aleatoriamente em dois grupos, sendo um deles chamado controle,
injetado com 100 L de uma soluo de NaCl 0,9 % m/v e o outro que foi injetado
com 100 L do extrato antocinico purificado 20 mmol L-1, de forma que cada
animal recebeu o equivalente a 10 mg de antocianinas por kg de massa corprea.
O extrato de antocianinas injetado foi previamente purificado por extrao em fase
slida e o metanol evaporado em evaporador temperatura ambiente. As
antocianinas foram dissolvidas em gua deionizada.
Aps 24 horas da aplicao, teste agudo, os animais foram sacrificados e
os rgos de interesse (rim e fgado) foram retirados e congelados em nitrognio
lquido. Aps 24 horas, os rgos foram descongelados, pesados e triturados por
2 minutos em tubo contendo 10 mL de tampo acetato 100 mmol L-1, pH 5,0 com
0,05% de -mercaptoetanol v/v e NaCl 50 mmol L-1. O extrato foi centrifugado a
20000 rpm (47807 g) durante 30 minutos para a precipitao do tecido no lisado,

o qual foi descartado. A seguir, dosou-se a atividade fosfatsica nestes extratos,
conforme descrito no item b a seguir.
O plasma coletado foi diludo em soluo fisiolgica (NaCl 0,9 % m/v) na
proporo 1:1 v/v e centrifugado por 10 minutos a 12.000 rpm. O precipitado foi
descartado e a atividade de fosfatases foi determinada (vide item b) bem como a
quantidade de protenas no sobrenadante.
a) Dosagem de Protenas
A quantidade de protena em cada animal foi quantificada para verificar se
as antocianinas influenciaram o contedo destas substncias nos organismos.
Este dado importante, pois variaes no contedo protico podem estar
relacionadas sntese de DNA e diviso celular. Alm disso, a atividade
especfica enzimtica leva em considerao a quantidade de protena presente no
meio. As protenas foram quantificadas pelo Mtodo de Lowry (Hartree, 1972). Em
tubos de ensaio, foram adicionados 50 L do extrato protico e 150 L de gua
Milli-Q e 2 mL de um reagente previamente preparado, sendo constitudo de uma
mistura das seguintes solues:
- 4,9 mL de CaCO3 2% m/v dissolvido em uma soluo de NaOH 0,1 mol L-1 e
- 0,1 mL de CuSO4 0,5% m/v e tartarato de sdio 1% m/v dissolvidos em gua.
Aps 10 minutos, foram adicionados 200 L do reagente de Folin Ciocalteu

diludo 1:1 v/v em gua. A absorbncia das solues foi lida a 660 nm, aps 30
minutos de reao.
b) Avaliao da Atividade Fosfatsica

I) Fosfatase cida Total (FAT)
A atividade das enzimas fosfatases foi determinada em tubos de ensaio
colocando-se 50 L do extrato enzimtico, 5 mmol.L-1 p-nitrofenilfosfato (pNPP)
como substrato, completando-se o volume de 1 mL com tampo acetato de sdio
0,1 mol L-1 pH 5,0. Os tubos foram mantidos a 37oC durante 10 minutos e a reao
foi paralisada com 1 mL de NaOH 1 mol L-1. Nos tubos controles, o extrato
enzimtico foi adicionado aps a adio da soluo de NaOH (Taga e Van Etten,
1982).
A formao do p-nitrofenol (pNP), produto da reao enzimtica, foi
determinada pela leitura da absorbncia em 405 nm, considerando-se o valor de
18.000 L Mol-1cm-1 como absortividade molar da forma do pNP (Chaimovich e
None, 1970).
II) Fosfatase cida Tartarato Resistente (FATR)

O ensaio foi realizado como descrito anteriormente, porm com a adio
de pHMB e tartarato de sdio. O pHMB inibe toda a atividade de FABMr e o
tartarato inibe a atividade de outras fosfatases. A atividade residual corresponde
atividade das fosfatases resistentes ao tartarato.
III) Fosfatase cida de Baixa Massa Molecular Relativa (FABMr)

O ensaio foi realizado como descrito para a determinao de fosfatase
cida total (FAT), porm com adio de tartarato e fluoreto, pois estes so
inibidores de fosfatases de alta e mdia massa molecular relativa,
respectivamente.
IV) Fosfatase Alcalina de Membrana (FAlc)

A atividade enzimtica das fosfatases alcalinas foi realizada adicionando-se
50 L de extrato enzimtico em meio contendo 25 mmol L-1 de glicina (pH 9,4), 2
mmol L-1 de MgCl2 e 1 mmol L-1 de pNPP para um volume reacional final de
1,0 mL, a 37 C, de acordo com os procedimentos descritos por Ciancaglini e
colaboradores (1992). A adio da soluo de Mg2+ necessria porque as
fosfatases alcalinas necessitam de ons divalentes para a catlise.
Em todos os ensaios, uma unidade de atividade enzimtica (UE) foi

definida como a quantidade de enzima necessria para produzir 1 mol de
produto por minuto. A atividade enzimtica especfica (AE) foi expressa como
unidade de atividade enzimtica por miligrama de protena (AE= UE mg-1).
Campos, D.D.P. Aspectos Biolgicos: Resultados e Discusses 89
CAPTULO 11
RESULTADOS E DISCUSSES
11.1 Ensaios in vitro: Avaliao do Efeito de Antocianinas em Cultura

de Linfcitos Sadios e Clulas Tumorais linhagem HL60
Vrios compostos naturais originrios de plantas (fitoqumicos) so
potenciais quimiopreventivos e quimioterpicos. Como agentes teraputicos, os
fitoqumicos podem induzir a morte de clulas cancerosas ou evitar seu
crescimento promovendo a remisso do cncer em modelos animais (Pezutto,
1997). Os alcalides da vinca, taxanos e campotecinas so exemplos de
derivados vegetais usados na quimioterapia do cncer (Rang et. al., 2001).
A citotoxicidade de uma substncia pode ser avaliada atravs de vrios
parmetros, os quais analisam a integridade da membrana celular, metabolismo e
funcionamento de organelas. Neste trabalho, avaliou-se a citotoxicidade de
antocianinas em cultura de clulas utilizando-se a reduo de MTT como
parmetro de viabilidade celular. MTT um corante amarelo que ao ser reduzido
para formazano torna-se azul e sua concentrao pode ser determinada por
medidas espectrofotomtricas em 570 nm.
O teste da reduo de MTT avalia a viabilidade celular pela funo
mitoncondrial, pois o corante reduzido na presena de NADH, que liberado por
atividade de enzimas como succinato desidrogenase presente nas mitocndrias
celulares (Mosmann, 1983). A Figura 15 mostra os resultados obtidos.
Pela Figura 15 pode-se notar que a citotoxicidade das antocianinas maior
em clulas da linhagem HL-60. A concentrao de 400 mol L-1 de antocianinas
totais em meio aquoso suficiente para induzir a morte celular em cerca de 90%
das clulas HL-60 e esta mesma concentrao induz a morte de apenas cerca de
20% de linfcitos normais. Estes resultados indicam que as antocianinas
apresentam efeito citotxico s clulas da leucemia mielide humana,
apresentando grande seletividade a estas clulas, o que sugere a propriedade
anti-tumoral destes pigmentos. Cabe ressaltar que mais estudos devem ser
realizados visando confirmar a atribuio efetiva da propriedade anti-tumoral s
antocianinas em relao s clulas HL-60, principalmente sob o aspecto de
proposta dos mecanismos de ao desta classe de pigmentos.
120
Linfcitos Normais
100 Clulas HL 60
Reduo de MTT (%)

80
60
40
20
0
0 100 200 300 400
-1
Cantocianinas( mol L )
Figura 15. Efeito citotxico de antocianinas em culturas de linfcitos e clulas HL-60. Os ensaios
foram feitos em triplicata e as barras verticais indicam a estimativa de desvio-padro.
11.2 Ensaios in vivo: Avaliao do Efeito de Antocianinas em

Fostatases de Camundongos.
As antocianinas apresentam diversas atividades biolgicas, porm, no foi
encontrado material disponvel na literatura sobre a atividade destas substncias
em enzimas fosfatases que, conforme mencionado, so enzimas que participam
de diversos eventos celulares essenciais ao organismo e representam, portanto,
um promissor alvo de estudos. Um dos objetivos deste trabalho consistiu na
avaliao do efeito de antocianinas em protenas e em algumas fosfatases
presentes no plasma sanguneo, nos rins e no fgado de camundongos. Para
tanto, foram realizados estudos in vivo, que permitem compreender a disperso
das antocianinas no organismo e sua possvel ao nos diversos rgos. Num
primeiro momento, foi feito um ensaio agudo para avaliar a atividade biolgica de
antocianinas em um curto perodo de tempo. Estes resultados indicariam a
relevncia de prosseguir a avaliao das propriedades biolgicas de antocianinas.
Todas as enzimas fosfatases reconhecem o substrato sinttico p-
nitrofenilfosfato (pNPP) e o convertem a p-nitro fenol (pNP) e fosfato inorgnico.
Na presena de hidrxido de sdio, pNP apresenta colorao amarela e pode ser

quantificado espectrofotometricamente a 405 nm.
No foi possvel a avaliao direta do efeito das antocianinas em enzimas
fosfatases isoladas de rim bovino. As antocianinas interferem na quantificao do
produto da reao catalisada pelas fosfatases, pNP, j que neste meio sua forma
amarelada absorvem no mesmo comprimento de onda. Alm disso, tanto pNP
quanto antocianinas apresentam absoro em 276 nm, o que inviabiliza opo
alternativa de leitura neste comprimento de onda. Para contornar esta dificuldade,
foram realizados os estudos in vivo que permitiram estudar a influncia das
antocianinas em fosfatases dos rgos de interesse de camundongo.
Todos os resultados obtidos esto apresentados na forma de grficos
(Figuras 16, 18-20), em termos de porcentagem relativa, ou seja, tomou-se a
atividade das enzimas fosfatases do grupo de camundongos controle como sendo
100% para comparao com os resultados obtidos com o grupo teste. Cabe
ressaltar que cada barra representada nas figuras corresponde a uma mdia de
resultados para grupos com 5 de camundongos e as retas verticais indicam as
estimativas de desvio padro. Alm disso, em todos os grficos, a primeira barra
corresponde mdia obtida para o grupo controle (camundongos que foram
injetados com soluo salina) e a barra adjacente corresponde ao grupo teste
(camundongos injetados com o extrato antocinico na concentrao 20 mmol L-1).
Para verificar se os resultados obtidos eram estatisticamente significativos,
ou seja, se as mdias calculadas para os camundongos do grupo controle e do
grupo teste diferiam entre si a um nvel de 95% de confiana, realizou-se um teste
t-no pareado de Student, usando-se o Programa Prisma, o que tambm permitiu
verificar se os dados em questo seguiam uma distribuio normal. Os resultados
obtidos esto apresentados e discutidos a seguir.
11.2.1 Efeito das Antocianinas na Concentrao de Protenas
Atravs do mtodo de Lowry foi possvel quantificar o contedo total de

protenas contido nos extratos de plasma, rim e fgado dos camundongos. Os
resultados obtidos esto representados na Figura 16.
250
Contedo Relativo de Protenas (%)

200
150
100
50
0
plasma -- -- fgado -- -- rim --
Figura 16. Efeito de antocianinas sobre o contedo total de protenas. O extrato de

antocianinas foi administrado a camundongos como descrito em materiais e mtodos (item 10.2.2).
Aps o sacrifcio dos animais, determinou-se o teor de protenas no plasma, rim e fgado. As barras
na cor cinza correspondem ao grupo controle e as vermelhas ao grupo teste.
A Figura 16 indica que o contedo total de protenas presentes no rim e

fgado de camundongos no foi alterado significativamente a um nvel de 95% de
confiana, ao contrrio do que foi observado no plasma, onde houve um aumento
de cerca de 130% na quantidade total de protenas. O aumento na quantidade de
protenas pode sugerir proliferao celular, visto que num primeiro momento as
clulas produzem protenas para depois se dividirem. Entretanto, no plasma no
ocorre diviso celular e, portanto, seria conveniente a realizao de mais estudos
para mapear as causas deste aumento protico bem como as suas reais
conseqncias.
11.2.2 Efeito das Antocianinas em Fosfatases

Assim como os flavonides, as antocianinas apresentam atividade
antioxidante e podem atuar na atividade das enzimas fosfatases, que possuem
resduo sulfidrila (-SH) em seu stio ativo, o qual essencial para a catlise por se
ligar ao grupo fosfato do substrato (Figura 17).
Protena
lento
Figura 17. Mecanismo cataltico das Protenas Tirosina Fosfatases.
A Figura 17 mostra a desprotonao do resduo de cistena (Cys-215)

essencial para catlise e ataque nucleoflico ao fsforo da protena fosforilada
(Reao A). Na seqncia, ocorre hidrlise do intermedirio cisteinil-fosfato por
adio de uma molcula de gua nucleoflica, completando o ciclo cataltico pela
regenerao da enzima ativa (Reao B).
Na presena de agentes oxidantes, o resduo SH oxidado e as enzimas
fosfatases tendem a perder suas atividades. Assim, os flavonides podem alterar
a atividade das fosfatases modulando-as de trs maneiras: aumentando a
atividade das enzimas antioxidantes e nveis de glutationa reduzida; atuando
diretamente sobre aminocidos importantes para a catlise enzimtica (por
exemplo, resduos de SH); ou ainda, como seqestradores diretos de espcies
reativas de oxignio. Em um estudo realizado previamente com os flavonides
comerciais morina e quercetina em fosfatases de camundongos, a morina inibiu a
atividade de fosfatases cidas e alcalinas, enquanto que a quercetina aumentou
as atividades destas mesmas enzimas. A diferena entre estes flavonides est
apenas nas posies dos grupos hidroxilas (3 e 4 para a quercetina e 2 e 4 para
a morina vide Figura 1 desta dissertao, pgina 08), o que sugere uma
importante relao estrutura-atividade para estas molculas (Miranda, 2005).
Avaliou-se, no presente trabalho, a influncia das antocianinas sobre as

fosfatases de rim, fgado e plasma de camundongos. O fgado o principal rgo
responsvel pela metabolizao de xenobiticos e, com isto, possui uma elevada
taxa metablica e est sujeito a muitos problemas causados pelo estresse
oxidativo. Conseqentemente, uma manuteno correta do sistema de defesa
antioxidante heptico de grande importncia para a manuteno da sade. O
fgado , tambm, o rgo principal envolvido no metabolismo de polifenis junto
com a mucosa intestinal e os rins, aos quais chegam, atravs da corrente
sangunea aps a absoro ao longo do trato grastrointestinal ou por outra via de
administrao (Ali et.al., 2003). Assim, foi avaliado o efeito do extrato de
jambolo purificado contendo as 4 antocianinas na atividade das fosfatases cidas
totais (FAT), tartarato-resistente (TRAP), baixa massa molecular relativa (FABr) e
fosfatases alcalinas (Falc) em rim, fgado e plasma.
a) Efeito de Antocianinas em Fosfatases de Fgado

A Figura 18 mostra os resultados obtidos no estudo do efeito de
antocianinas nas fosfatases de fgado.
140
120
Atividade Relativa (%)
100
80
60
40
20
0
FAT -- -- FATR -- -- FABr -- -- FAlc --
Fosfatases
Figura 18. Efeito de antocianinas nas fosfatases de fgado de camundongos. O extrato de

antocianinas foi administrado a camundongos e o fgado foi extrado aps sacrifcio dos animais,
como descrito em materiais e mtodos (item 10.2.2). As barras na cor cinza correspondem ao
grupo controle e as vermelhas ao grupo teste.
De acordo com a Figura 18, pode-se dizer as antocianinas foram

responsveis pela inibio de cerca de 20% da atividade da FATR, enquanto
promoveram um aumento de 30% na atividade da Falc. Estas alteraes foram
estatisticamente significativas a um nvel de 95% de confiana, ao contrrio dos
resultados obtidos para FAT e FABr, que no se mostraram estatisticamente
significativos neste intervalo de confiana.
Pelos dados apresentados na Figura 18, nota-se que as antocianinas
podem alterar as atividades das fosfatases ativando-as (Falc) ou inibindo-as
(FATR). Estes efeitos aparentemente antagnicos podem ser explicados pela
presena de diferentes antocianinas no extrato. Tambm interessante ressaltar
que, no fgado, pode ocorrer a metabolizao das antocianinas, no sendo
possvel atribuir o efeito biolgico observado antocianina intacta ou ao seu
metablito. De fato, Talavra e colaboradores (2005) realizaram estudos
farmacocinticos de antocianinas em camundongos (alimentados durante 15 dias
com uma dieta enriquecida em antocianinas) e verificaram que algumas
antocianinas eram metiladas no fgado. Os autores ainda concluram que a alta
quantidade de antocianinas metiladas no fgado e a baixa quantidade destes
derivados no plasma podem estar relacionados ao fato de que estes metablitos
foram eliminados diretamente do fgado para a bile.
b) Efeito das Antocianinas nas Fosfatases de Rim
De acordo com Talavra e colaboradores (2005), o rim o ltimo rgo

pelo qual as antocianinas passam antes de serem eliminadas pela urina e, depois
do fgado, um dos principais rgos de metilao. Os resultados da avaliao do
efeito das antocianinas em fosfatases de rim foram tratados de maneira
semelhante ao descrito para as fosfatases de fgado e esto representados na
Figura 19.
120
100
80
60
40
20
0
FAT -- -- FATR -- -- FABr -- -- FAlc --
Fosfatases
Figura 19. Efeito de antocianinas nas fosfatases de rim de camundongos. O extrato de

antocianinas foi administrado a camundongos e as atividades de atividades determinadas nos rins
aps sacrifcio dos animais, como descrito em materiais e mtodos (item 10.2.2). As barras na cor
cinza correspondem ao grupo controle e as vermelhas ao grupo teste.
Os dados obtidos e representados na Figura 19 indicaram que houve

aumento de 20% nas atividades da FAT e de 10% para FATR e uma diminuio
de 10% na atividade da Falc, porm, as alteraes observadas em todas as
atividades enzimticas no foram estatisticamente significativas em um nvel de
95% de confiana. Estes dados indicam que as antocianinas no alteram a
atividade de fosfatases de rim.
c) Efeito das Antocianinas nas Fosfatases de Plasma

Os dados obtidos para avaliar o efeito de antocianinas em fosfatases
plasmticas foram tratados semelhantemente aos descritos para as fosfatases de
fgado e rim. Os resultados encontram-se na Figura 20.
120
100

80
60
40
20
0
FAT -- -- FABr -- -- FAlc --
Fosfatases
Figura 20. Efeito de antocianinas em fosfatases plasmticas de camundongos. O extrato

de antocianinas foi administrado a camundongos e a atividade fosfatsica determinada no plasma
aps sacrifcio dos animais, como descrito em materiais e mtodos (item 10.2.2) As barras na cor
cinza correspondem ao grupo controle e as vermelhas ao grupo teste.
Pode-se verificar, pela Figura 20, que a ao das antocianinas nas enzimas
FAT e FABr foi estatisticamente significativa a um nvel de 95% de confiana. As
antocianinas inibiram cerca de 50% e 70% as atividades das enzimas FAT e FABr,
respectivamente, no alterando a atividade das fosfatases alcalinas. Anlogo aos
resultados das fosfatases de fgado, no se pode afirmar se foram as antocianinas
intactas ou seus metablitos que causaram este efeito. Talavra e
colaboradores (2005) encontraram antocianinas metiladas e conjugadas ao cido
glucnico no sangue de camundongos e atriburam a existncia de metabolizao
e absoro de antocianinas no intestino delgado dos animais.
Campos, D.D.P. Aspectos Biolgicos: Concluses 101
CAPTULO 12
CONCLUSES
Muitos trabalhos vem sendo publicados recentemente atribuindo inmeras

propriedades biolgicas s antocianinas, principalmente, no que diz respeito s
atividades anti-tumorais. Os resultados dos testes realizados in vitro permitiram verificar
que as antocianinas induziram morte celular em cerca de 90% de clulas da linhagem
de leucemia mieloctica humana (HL60) ao passo que esta mesma concentrao de
antocianinas (400 mol L-1) induziu morte cerca de 25% das clulas sadias. Isto indica
que as antocianinas so interessantes potenciais agentes quimioterpicos e estudos
sobre o mecanismo de ao destas molculas devem ser realizados em etapas futuras.
Em relao aos ensaios in vivo, as antocianinas promoveram alterao
significativa na quantidade de protenas presentes no plasma (aumento de 130%) e no
alteraram significativamente os nveis proticos relativos ao rim e fgado. Estudos
adicionais devem ser realizados com o objetivo de se averiguar as causas deste
aumento protico e suas conseqncias.
Em relao s enzimas fosfatases de fgado, as antocianinas foram responsveis
pela inibio de cerca de 20% da atividade da FATR, enquanto promoveram um
aumento de 20% e 30% nas atividades da FABr e Falc, respectivamente. J em relao
as fosfatases plasmticas, houve uma inibio de 50% e 70% das atividades das
enzimas FAT e FABr, respectivamente. As alteraes nas atividades enzimticas renais
foram desprezveis. Estes dados mostram que diferentes enzimas foram inibidas ou
ativadas, no sendo possvel prever um comportamento comum em relao inibio
ou ativao de fosfatases por antocianinas. Seria interessante realizar estudos futuros
com antocianinas isoladas para identificar a atividade de cada antocianina e, se
possvel, traar o mecanismo de ao.
Trabalhos publicados recentemente mostraram que as antocianinas so
metabolizadas em diferentes rgos de camundongos (Ali, et. al., 2003; Talavra
et.al., 2005). Os presentes resultados indicam que as antocianinas intactas ou seus
metablitos foram capazes de alterar diferentemente a atividade de enzimas fosfatases
ora inibindo, ora ativando a atividade destas enzimas.
Campos, D.D.P. Concluses Gerais 105
CAPTULO 13
CONCLUSES GERAIS
Campos, D.D.P. Concluses Gerais 107
Os resultados mostrados nesta dissertao permitem concluir que:
As antocianinas podem ser extradas de jambolo utilizando-se solventes polares

como gua e lcoois. Foram encontrados em mdia 2,70,9 mg de antocianinas por g
de casca de jambolo. Para aumentar a quantidade de antocianinas extradas,
conveniente a utilizao do solvente metanol, na proporo 1:3 (massa de cascas de
frutas: volume de solvente) a 46 oC. Para aplicaes biolgicas, a extrao com gua
na mesma proporo, a temperatura ambiente forneceu extratos com concentrao
total de antocianinas igual a 0,80,2 g L-1 (1,700,04 mmol L-1).
Os extratos antocinicos podem ser purificados pela tcnica de extrao em fase

slida utilizando-se cartuchos C18 oferecendo altos rendimentos de purificao (em
torno de 100%).
As tcnicas de cromatografia em papel e cromatografia lquida de alta eficincia

permitem identificar e isolar as antocianinas rapidamente. Nos extratos de jambolo
foram identificadas as seguintes antocianinas: delfinifina-3-glicosdeo, cianidina-3-
galactosdeo, petunidina-3-galactosdeo e pelargonidina-3-arabinosdeo.
Os experimentos com extrato purificado de antocianinas 400 mol L-1 promoveu

cerca de 90% de morte celular em cultura de linfcitos da linhagem da leucemia
mielide humana (HL60) e apenas 20% de morte celular de clulas sadias. Isto indica
que as antocianinas so potenciais agentes quimioterpicos e que estudos mais
detalhados devem ser feitos visando uma aplicao medicinal para as antocianinas.
Os experimentos em camundongos mostraram que as antocianinas alteram a

atividade de enzimas fosfatases, sendo que as mais significativas foram observadas no
plasma sanguneo, onde as enzimas FAT e FABr foram inibidas em 50 % e 70 %,
respectivamente. Ser interessante prosseguir os estudos com estas molculas a fim
de detalhar suas aes no organismo.
Campos, D.D.P. Perspectivas 109
CAPTULO 14
PERSPECTIVAS FUTURAS
Campos, D.D.P. Perspectivas 111
Tendo em vista as diversas aplicaes das antocianinas e sua importncia

biolgica, muitos trabalhos ainda podem ser realizados a partir das idias
desenvolvidas nesta dissertao, sugerindo-se entre eles:
1 Isolamento de antocianinas em maior quantidade, o que pode ser

conseguido muito provavelmente usando-se cromatografia em coluna aberta
(escala preparativa).
2 Identificao das antocianinas por ressonncia nuclear magntica que

representa um mtodo muito adequado para a identificao de pigmentos
naturais, em complementao s identificaes feitas por HPLC e PC.
3 Estudar o mecanismo de ao das antocianinas em clulas HL-60,

visando a sua utilizao como agentes antitumorais.
4 Estudar o mecanismo de ao das antocianinas em enzimas

fosfatases e suas conseqncias para o organismo. Sugere-se, neste caso, a
aplicao de antocianinas isoladas em fosfatases.
5 Verificar uma possvel proteo oferecida pelas antocianinas s

enzimas fosfatases frente ao estresse oxidativo, dado o carter antioxidante das
antocianinas e a presena de um stio de cistena (-SH) no stio ativo das
fosfatases, imprescindvel para a catlise.
Campos, D.D.P. Referncias Bibliogrficas 113
CAPTULO 15
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

Extrao, Purificao e Isolamento de Antocianinas

AUTORA: DANIELLA DIAS PALOMBINO DE CAMPOS

FICHA CATALOGRFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA DO INSTITUTO DE

Campos, Daniella Dias Palombino de.

Orientadora: Adriana Vitorino Rossi.

Co-orientador: Hiroshi Aoyama.

Dissertao - Universidade Estadual de Campinas,

1. Antocianinas. 2. Syzygium cuminii. 3. Jambolo.

Ttulo em ingls: Extraction, purification and isolation of anthocyanins from Syzygium

Palavras-chaves em ingls: Anthocyanins, Syzygium cuminii, Biological activities,

rea de concentrao: Qumica Analtica

Titulao: Mestre em Qumica na rea de Qumica Analtica

Banca examinadora: Adriana Vitorino Rossi (orientadora), Hiroshi Aoyama (co-

Data de defesa: 31/07/2006

Aos meus pais Maria Jos e Jos Carlos

Ao meu esposo Eliseu,

Deus, fonte de vida e sabedoria.

Agradeo ao suporte tcnico de Paulo Baldasso e Ricardo Pereira pela

A autora desta Dissertao de Mestrado formou-se em Qumica na

participou de 8 congressos cientficos, tendo apresentado 10 trabalhos na forma

Autora: Daniella Dias Palombino de Campos

Antocianinas so os principais pigmentos naturais responsveis pelas coloraes

Author: Daniella Dias Palombino de Campos

Captulo 1. INTRODUO GERAL.........................................................................1

Captulo 2. OBJETIVOS GERAIS...........................................................................5

PARTE 1: ASPECTOS ANALTICOS

Captulo 5. PARTE EXPERIMENTAL...................................................................29

5.3.4.1. Deteco de Acares............................................... 36

Captulo 6. RESULTADOS E DISCUSSES........................................................39

6.1. Quantificao das Antocianinas ...........................................................41

Captulo 7. CONCLUSES ..................................................................................61

PARTE 2: ASPECTOS BIOLGICOS

Captulo 10. PARTE EXPERIMENTAL.................................................................81

Captulo 11. RESULTADOS E DISCUSSES......................................................89

11.1. Ensaios in vitro: Avaliao do Efeito de Antocianinas em Cultura de

11.2. Ensaios in vivo: Avaliao do Efeito de Antocianinas em Fosfatases

11.2.1. Efeito das Antocianinas na Concentrao de Protenas ......93

11.2.2. Efeito das Antocianinas em Fosfatases ...............................94

Captulo 13: CONCLUSES GERAIS................................................................105

Captulo 14: PERSPECTIVAS FUTURAS..........................................................109

Captulo 15: REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS...............................................113

Tabela 1. Fatores escolhidos para o planejamento fatorial e seus nveis......................45

Tabela 2. Experimentos de otimizao da extrao das antocianinas de jambolo .....46

Tabela 3. Efeitos principais calculados para cada fator.................................................47

Tabela 4. Efeitos de interao entre os fatores..............................................................47

Tabela 5. Valores de varincia e erro dos efeitos..........................................................49

Tabela 6. Tempos de retardamento das antocianinas ..................................................52

Tabela 7. Dados da purificao das antocianinas por SPE...........................................58

Tabela 8. Dados da purificao das antocianinas por SPE...........................................59

Figura 1. Estrutura qumica genrica dos flavonides...................................................13

Figura 2. Estrutura genrica das antocianinas..............................................................14

Figura 3. Variao nas estruturas das antocianinas em funo do pH.........................16

Figura 4. Espectros eletrnicos UV-VIS das antocianinas em diferentes solventes.....42

Figura 5. Estudo da influncia do tempo de extrao das antocianinas a 25 oC...........43

Figura 6. Estudo da influncia do tempo de extrao das antocianinas a 46 oC...........43

Figura 7. Cromatograma do extrato antocinico de jambolo obtido por PC................50

Figura 8. Cromatograma para o extrato de jambolo por HPLC .................................51

Figura 9. Teste de deteco de acares.....................................................................54

Figura 10. Teste de deteco de cidos orgnicos.......................................................55

Figura 11. Comparao de padres de cidos orgnicos por PC.................................56