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Biochimie structurale

Glucides.

Introduction.

Glucides = Cn(H20)n "hydrates de carbone" (1) ou polysaccharides

Trs rpandus dans la matire vivante : 5% poids sec animaux, 70% poids sec vgtaux

( importance des polymres)

En alimentation : pain, sucre, crales, lait

Oses : glucides simples, non hydrolysables en milieu acide

Osides : glucides complexes, dont l'hydrolyse donne plusieurs produits :

o holosides : constitus uniquement d'oses simples (amidon, glycogne, saccha-

rose)

o htrosides : constitus d'une partie glucidique importante et d'un aglycone =

partie non glucidique (chane carbone autre).

Oses.

Composs les plus simples : chane carbone linaire (au moins en thorie)

1
Le terme hydrate de carbone correspond la traduction de lamricain carbohydrate mais na pas

de sens en franais : seuls les termes glucide ou ose et leurs drivs doivent tre employs.

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Tous les carbones portent une fonction alcool primaire ou secondaire sauf :

un aldhyde sur C1 = aldoses

une ctone sur C2 = ctoses

Ces deux fonctions sont rductrices (cf. infra).

Aldoses.

Le plus simple comporte 3 C : glycraldhyde = aldhyde glycrique

la molcule possde 1 C asymtrique 2 nantiomres possibles : D = OH droite ou L

= OH gauche

On connat sa configuration absolue base pour la nomenclature de tous les autres glu-

cides. On regarde l'avant dernier carbone. Les glucides naturels sont de la srie D.

polariseur solution analyseur

Par ailleurs l'asymtrie du carbone confre la molcule un pouvoir rotatoire, c'est dire

qu'une solution de glucide est susceptible de dvier le plan de vibration d'une lumire po-

larise. L'angle de dviation dpend de plusieurs facteurs, notamment le pH, la concentra-

tion et la longueur du trajet optique (conditions standardises), mais aussi de la nature du

glucide.

Les glucides qui dvient la lumire droite sont dits dextrogyres et nots (+), ceux qui la

dvient gauche sont lvogyres (-).

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[]=1000A/(Cl)

Il ne faut pas confondre les notations ni les notions d'nantiomres et de pouvoir rota-

toire, malgr l'analogie possible.

Par la synthse de Kiliani, on peut passer d'un glucide (n) carbones son homologue

suprieur (n+1) carbones. Cette synthse n'est pas strospcifique mais fournit deux

pimres (isomres se diffrenciant par la position d'un groupement hydroxyle).

Aldoses remarquables : glycraldhyde ; rythrose ; ribose ; arabinose ; xylose ; glucose ;

mannose ; galactose.

Ctoses.

On peut faire driver les ctoses de la dihydroxyactone : CH2OH-CO-CH2OH.

Les ctoses portent une fonction ctone sur le deuxime carbone, ce qui fait qu'ils poss-

dent un carbone asymtrique de moins que leur homologue aldose.

Les autres proprits sont semblables celles des aldoses.

Ctoses remarquables : dihydroxyactone ; ribulose ; fructose.

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Composs apparents aux oses.

Osamines.
H O
C
CH 2OH
L'hydroxyle du C2 est remplac par
H C OH
H O H HO C H une amine : galactosamine, glucosa-
H
OH H H C OH
OH OH H C OH
mine, ou encore par NH-CO-CH2 : N-
H N C CH 3 C actyl-glucosamine
H HO O
O
N-actyl-D-glucosamine Acide D glucuronique Acides uroniques.

Oxydation de la fonction alcool I en

fonction carboxylique (et conservent fonction aldhyde) : acide glucuronique (forme de

dtoxication), acide galacturonique (pectines).

CH2OH
OH
OH CH2OH Autres.
HO

Acide ascorbique = Vitamine C


OH
Sorbitol
Polyalcools = polyols

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Proprits des oses.

Cyclisation.

Mise en vidence ; Nature.

Le pouvoir rotatoire d'une solution de glucose volue au cours du temps, alors que c'est

en thorie une constante, au mme titre que le point de fusion ou la masse molculaire.

Par ailleurs, certaines ractions caractristiques des aldhydes ne se font pas complte-

ment. Ces observations et d'autres ont conduit postuler l'existence d'un carbone asym-

trique supplmentaire par rapport la forme linaire.

Cette situation est possible par l'apparition d'un cycle form par l'limination d'une mol-

cule d'eau entre la fonction aldhydique et l'hydroxyle port par le carbone 4 ou le carbone

5.

Dans le cas du pont oxydique 1-5, on a un cycle hexagonal comportant 5 atomes de car-

bone et 1 atome d'oxygne : c'est un noyau pyrannose2. Dans le cas du pont 1-4, on a un

cycle pentagonal 4 atomes de carbone et 1 oxygne : c'est un noyau furannose.

L'loignement des carbones 1 et 4/5 et faible lorsqu'on prend en considration non la re-

prsentation linaire, mais la reprsentation spatiale des molcules.

H2
C O O
HC CH HC CH
C C C C
2
pyranne = H H ; furanne = H H

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Formes chaise et bateau.

Les cycles peuvent prendre deux formes diffrentes dans l'espace : la forme chaise ou la

forme bateau. Ceci est d principalement des problmes lis d'une part aux contraintes

cres par les liaisons et leurs angles, et d'autre part par l'encombrement strique des

atomes. Ces formes sont des tats d'quilibre.

On admet que la configuration en chaise est la plus stable, et que c'est de cette faon que

sont les oses en solution.

Nomenclature.

Lorsque le groupement hydroxyle port par le carbone 1 est en dessous du plan du cycle,

c'est un -pyrannose, tandis que si elle est au-dessus, c'est un -pyrannose (ou furan-

nose).

Proprits chimiques des oses.

Solubilit.

Les oses sont de petites molcules, trs polarisables : ils sont donc trs solubles dans

l'eau (jusqu' 3 M, c'est dire 540 g.l-1 !).

Estrification.

alcool + acide ester + eau

La fonction alcool primaire des glucides peut facilement tre estrifie, notamment par de

l'acide phosphorique : les oses impliqus dans le mtabolisme sont le plus souvent sous

cette forme : glucose-6-P, fructose 1 ou 6 ou 1,6 P, etc., ce qui correspond en fait une

nergisation de ces composs.

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Oxydation des oses = caractre rducteur.

La fonction aldhydique ou ctonique des oses est susceptible d'tre oxyde, les oses

sont donc des composs rducteurs :

glucide rducteur + 2 Cu2+ glucide oxyd + 2 Cu+

Le cuivre prsent dans la liqueur de Felhing ragit ensuite avec la soude pour donner un

prcipit rouge brique caractristique :

2 Cu+ + 2 OH- 2 CuOH Cu2O + H2O

Action des acides concentrs.

Sous l'action d'un acide concentr chaud, les aldoses et les ctoses donnent naissance

au furfural ou des drivs de furfural. Celui-ci peut ensuite ragir avec divers phnols et

donner des colorations caractristiques et quantitatives. Par ailleurs, cest un des principes

de la raction de Maillard (coloration de la crote du pain, caramlisation, etc.)

Osides.

Holosides.

La liaison osidique.

Les fonctions hydroxyle de deux oses peuvent se condenser en librant une molcule

d'eau et former une liaison entre les oses :

R1-CH-OH + H-OCH-R2 R1-CH-O-CH-R2 + H2O

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La fonction rductrice peut tre libre ou engage dans la liaison osidique, donc le polyho-

loside ne sera pas forcment rducteur, mme si les osides qui le composent le sont.

Diholosides.

Composs forms de 2 oses lis par une liaison osidique :

Maltose : D glucopyrannosyl (1-4) D glucopyrannose ;

Cellobiose : D glucopyrannosyl (1-4) D glucopyrannose ;

Lactose : D galactopyrannosyl (1-4) D glucopyrannose ;

Saccharose : D glucopyrannosyl (1-2) D fructofurannose.

Maltose : Saccharose :
Dglucopyrannosyl (1-4)Dglucopyrannose Dglucopyrannosyl (1-2)Dfructofurannose

CH2OH CH2OH CH2OH OH


CH2OH
O O O
OH OH OH OH
HO O HO O O
CH2OH
OH OH OH
Lactose : Cellobiose :
Dgalactopyrannosyl (1-4)Dglucopyrannose Dglucopyrannosyl (1-4)Dglucopyrannose

CH2OH OH CH2OH OH

HO O O O O
OH OH
OH OH
O HO O
OH CH2OH OH CH2OH

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Polyholosides.

Amylopectine Amidon : rserve glucidique des vgtaux

O amylose : liaisons 1-4, MM 150 000 600 000

(1-6) amylopectine : liaisons 1-4 et 1-6 : ramifications


O
O (1-4)
O
possibles
O
Glycogne : rserve chez les animaux

O mme structure que l'amylopectine, mais plus ramifie


O
O Cellulose : constituant des parois vgtales
O
liaisons 1-4 ; structure fibreuse

Pectine Autres :

dextranes (bactries)
CH2OH Galactose
O chitine : polymre de N-actyl glucosa-
O ...
O mine
O OH O OMe
pectine : polymre dacides galacturoni-
O O O
... ques
O
O O

O OMe Acides galacturoniques

Htrosides.

Partie non osidique = aglycone strols, phnols,

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Lipides.

Introduction.

Les lipides sont des substances insolubles en milieu aqueux, mais solubles dans les sol-

vants organiques : thanol, chloroforme, ther, Ce sont les huiles (liquides) et les grais-

ses (glifies ou solides).

Il existe plusieurs classifications anciennes, bases sur les produits d'hydrolyse (lipides

simples ou complexes), mais elles sont abandonnes au profit d'une classification base

sur la structure.

Acides gras.

En petite quantit l'tat libre, mais en grande quantit engags dans des liaisons ester

ou amide. En gnral, acides monocarboxyliques chane linaire non ramifie contenant

un nombre pair d'atomes de carbone (4 - 30).

Par convention, on numrote les atomes de carbone

partir de celui qui porte la fonction carboxyle.

Acides gras saturs.

Formule.

CH3-(CH2)n-COOH = CnH2nO2

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Les plus frquents sont l'acide palmitique (C16, n = 14) et l'acide starique (C18 ; n = 16).

En moins grande quantit, on trouve des acides soit 14, soit 20 carbones. Les autres

sont plus rares et ne se rencontrent que dans des tissus spcialiss.

Les acides gras nombre impair de carbones sont trs rares, mais ils existent.

La chane carbone forme un zigzag.

H2 H2 H2 H2 H2 H2 H2 H2
C C C C C C C C COOH
Acide starique: C 18
H 3C C C C C C C C C
H2 H2 H2 H2 H2 H2 H2 H2

H2 H2 H2 H2 H2 H2 H2 H2
C C C C C C C C Acide olique: C 18:1
H 3C C C C C C C C C COOH
H2 H2 H2 H H H2 H2 H2

Nomenclature.

acide myristique = C14 = acide n ttradcanoque

acide palmitique = C16 = acide n hexadcanoque

acide starique = C18 = acide n octadcanoque

Acides gras insaturs.

Dits aussi dsaturs, ils comportent au moins une double liaison C = C, c'est dire qu'ils

ne sont pas saturs en hydrogne.

Acides gras monoinsaturs.

Ils ne comportent qu'une seule double liaison

acide olique= C18 :1 = acide 9-ne octadcanoque

CH3-(CH2)7-CH=CH-(CH2)7-COOH

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Acides gras polyinsaturs.

Ils comportent plusieurs doubles liaisons :

C18 :2 acide linolique CH3-(CH2)4-CH=CH-CH2-CH=CH-(CH2)7-COOH

C18 :3 acide linolnique CH3-CH2-CH=CH-CH2-CH=CH-CH2-CH=CH-(CH2)7-COOH

Les doubles liaisons ne sont gnralement pas conjugues (elles sont spares par un

mthylne -CH2-), mais on rencontre des cas de conjugaison chez certains vgtaux.

Acides gras spciaux.

Certaines structures particulires peuvent se rencontrer :

ramification

nombre impair de carbones

les deux : ramification et nombre impair de C

triple liaison

cyclisation

Proprits des acides gras.

Proprits physiques.

solubilit dans les solvants organiques

point de fusion : dpend de 2 facteurs :

- nombre de carbones : le point de fusion augmente avec le nombre de carbones, pour

une srie homologue.

- le degr d'insaturation : le point de fusion diminue avec l'insaturation, pour un nombre

constant d'atomes de C.

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Les lipides prsents en milieu aqueux s'asso-


Acide gras Point de fusion (C)
cient d'une faon stable thermodynamique-
C18 :0 69
ment : structure feuillete ou structure en
C18 :1 16
micelles. De toute faon, les ples hydropho-

C18 :2 -5 bes (apolaires) se font face, tandis que les

C18 :3 -11 ples hydrophiles (polaires) font face au mi-

lieu aqueux. Les micelles peuvent tre ren-

verss lorsque les lipides sont en plus grande

quantit que l'eau : celle-ci se trouve alors

pige dans des gouttelettes au sein de la

phase lipidique.

Proprits chimiques.

Saponification.

R-COOH + NaOH R-COO-, Na+ + H2O

Un acide gras en prsence d'une base forte, chaud, donne un sel ou savon, et de l'eau.

Le savon est soluble dans l'eau, et prsente des proprits dtergentes et un pouvoir

moussant.

On peut doser les acides gras l'aide d'une solution de potasse (KOH) alcoolique, en

prsence de phnolphtaline. Ceci permet d'valuer la quantit globale d'acides gras li-

bres. On obtient un indice d'acide, correspondant aux mg de potasse ncessaires pour

neutraliser l'acidit libre contenue dans 1 g de matire grasse.

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Glycrolipides.

On distingue deux grands groupes : les glycrides et les phospholipides. Leur structure

est commune : un glycrol est estrifi par plusieurs acides gras.

Glycrides.

Nature.

Neutres, ils ne contiennent que C,H et O. Ce sont des esters d'acide gras et de glycrol :

CH2OH R1-COOH CH2-O-C=O-R1

CHOH + R2-COOH CH-O-C=O-R2

CH2OH R3-COOH CH2-O-C=O-R3

Une ou plusieurs des trois fonctions alcool du glycrol peuvent tre estrifies, et ceci par

le mme acide gras ou par des acides gras diffrents. Les Triglycrides sont les consti-

tuants majeurs du tissu adipeux des animaux, et des huiles et graisses vgtales.

R1 = R2 = R3 = C17H33 homogne : triolate de glycryle (olique = C18 :1) ;

R1 = R3 = C17H33 ; R2 = C17H35 htrogne : olate-1 starate-2 olate-3 de glycryle.

Proprits physiques.

Le point de fusion dpend des acides gras estrifiant le glycrol. Mmes rgles.

Les glycrides sont insolubles dans l'eau.

Proprits chimiques.

Hydrolyse - Saponification.

Hydrolyse enzymatique (lipases) glycrol + acides gras ;

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ou en milieu alcalin chaud glycrol + savons (sels d'acides gras).

indice d'estrification = mg de NaOH ncessaires pour estrifier 1 g de matire grasse.

Indice de saponification

= indice d'acidit + indice d'estrification

Ractions lies l'insaturation.

hydrognation = ajout de H des acides insaturs : sous pression, avec un catalyseur ;

addition d'halognes : l'iode se fixe uniquement sur les doubles liaisons. L'indice d'iode

correspond aux mg d'I2 que peuvent fixer 100 g de matires grasses. L'indice d'iode

permet de calculer l'insaturation des lipides.

oxygnation : donne le got rance aux matires grasses.

Phospholipides (Glycrophospholipides).

Nature.

Ce sont des glycrolipides dont un des carbones du glycrol porte non un acide gras,

mais un acide phosphorique, ce qui donne un acide phosphatydique.

CH2-O-C=O-R1
Phosphatidyl choline
H 2C O C R1
Choline (Les flches indiquent
R2 C O CH les liaisons susceptibles CH2-O-C=O-R2
CH 3
d'tre hydrolyses par
C O P O C C N+ CH 3 des enzymes.)
H2 H2 H2 CH 3 CH2-O-PO3H2

Le groupement phosphoryle peut tre port soit par le carbone , soit par le carbone .

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La fonction acide du phosphoryle peut tre elle-mme estrifie, par diverses molcules

alcooliques : choline, thanolamine, srine. Les phospholipides sont des intermdiaires

importants du mtabolisme.

Rles.

Une molcule ayant deux charges opposes des proprits tensioactives, c'est dire

qu'elle permet de stabiliser des mulsions.

Ce sont les phospholipides de la membrane plasmique. Alors que les acides gras consti-

tuent la partie hydrophobe, l'acide phosphorique constitue la partie hydrophile. Ces acides

gras s'arrangent naturellement en structure feuillete bicouche lipidique.

Si on agite, la structure feuillete est dsordonne et les lipides peuvent se rarranger en

micelles.

Action des enzymes sur les phospholipides.

L'action des enzymes permet, par les produits qu'elle libre, de dterminer prcisment la

composition de lipides inconnus.

Autres types de lipides.

Sphingolipides.

Les acides gras ne sont plus lis une molcule de glycrol, mais une sphingosine :

Comme dans le cas des phospholipides, l'acide phosphorique peut tre estrifi (par la

choline sphingomyline).

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L'un des H de la fonction amine est substitu et porte donc un radical li par une amide

(ce n'est plus un ester).

Importants

Crides.

Esters d'acide gras et d'alcool chane non ramifie ayant un nombre pair d'atomes de

carbone.

Constituants majeurs de la cire des abeilles.

Strides et composs isoprniques.

La structure isoprne se rpte


Cholestrol
un certain nombre de fois, ven-
H 2C
C C CH 2
H 3C H tuellement en formant des cycles.
isoprne

HO
carotne : pigment important

des vgtaux, inclus dans les

membranes des thylakodes du fait de son caractre hydrophobe fort.

Strides : esters d'acides gras et de strol. Entrent dans le mtabolisme des strodes

(hormones).

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Mthodes d'analyse.

Extraction.

L'extraction des lipides se fait au moyen de solvants organiques, tels que le chloroforme,

le mthanol, etc.

Aprs broyage du matriel biologique, on ajoute le solvant, et agite et on laisse reposer.

Les phases aqueuses (contenue dans le matriel) et organique se sparent par dcanta-

tion.

On recueille la phase organique.

Sparation et dosage.

La sparation des lipides du solvant de dpart ainsi qu'entre eux se fait par des techni-

ques chromatographiques.

Le principe est que chaque molcule possde une affinit propre pour une certaine autre

molcule (solide, liquide ou gazeuse). Si on fait passer un mlange complexe sur cette

molcule, les constituants du mlange seront d'autant plus retenus que leur affinit sera

grande. En utilisant des jeux de colonnes et de solvants adapts, on peut donc sparer

les diffrents lments du mlange.

Grce un systme de dtection appropri, on peut ensuite quantifier chaque espce

molculaire sortant de l'appareillage.

Chromatographie basse pression sur colonne

Chromatographie liquide haute pression

Chromatographie sur couche mince

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Chromatographie en phase gazeuse (demandant une drivation pralable, mais de loin

la mieux adapte aux lipides).

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Peptides.

Acides amins.

COOH Formule gnrale.


HC NH 2
R
Le carbone portant la fonction carboxylique acide est dit "0", donc le car-

bone suivant est le carbone . Il porte la fonction amine NH2. Ce sont donc des acides

amins. On trouve en gros 20 AA naturels protinognes, combins ou non soit entre

eux, soit avec d'autres molcules.

Principaux acides amins naturels.

Acides amins aliphatiques.

Le radical R est une chane carbone, ramifie ou non :

Acides amins chane hydrocarbone:


Glycine (Gly; G) Alanine (Ala; A) Valine (Val; V) Leucine (Leu; L) Isoleucine (Ile; I)
H3 C H3 C
H CH COOH H3 C CH COOH COOH H3 C C CH CH COOH
CH CH CH C CH COOH H2
NH 2 NH 2 H3 C H2
NH 2 H3 C CH 3 NH 2
NH 2

Acides amins hydroxyls / Acides amins soufrs


Srine (Ser; S) Thronine (Thr; T) Cystine (Cys; C) Mthionine (Met; M)
H2
H2 C CH COOH H3 C CH CH COOH HS C CH COOH C C CH COOH
H2 H2
S
OH NH 2 OH NH 2 NH 2 NH 2
CH 2

Acides amins dicarboxyliques et leurs amides:


Ac. aspartique HOOC C CH COOH Asparagine OC C CH COOH
H2 H2
(Asp; D) NH 2 (Asn; N) NH 2 NH 2

Ac. glutamique HOOC C C CH COOH Glutamine OC C C CH COOH


H2 H2 H2 H2
(Glu; E) NH 2
(Gln; Q)
NH 2 NH 2

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Acides amins basiques


Lysine (Lys; K) Arginine (Arg; R) Histidine (His; H)
H
H2 C C C C CH COOH H2 N C N C C C CH COOH C C C CH COOH
H2 H2 H2 H H2 H2 H2 H2
NH 2 NH 2 NH NH 2 N NH NH 2
C
H

Acides amins cycliques.

L'atome d'azote des acides htrocycliques est en fait une imine : acides imins.

Acides amins aromatiques:


Phnylalanine (Phe; F) Tyrosine (Tyr; Y) Tryptophane (Trp; W)
H2
C CH COOH HO C CH COOH C CH COOH
H2 H2
NH 2 NH 2 NH 2
N
H

Acides amins htrocycliques:


HO

Proline COOH Hydroxyproline Ac. pipcolique


COOH
(Pro; P) N COOH
N
H N H
H

Proprits.

Carbone asymtrique.

Glycraldhyde Alanine
CHO CHO COOH COOH

H C OH HO C H H C NH 2 H 2N C H

CH 2OH CH 2OH CH 3 CH 3

D L D L

A l'exception de la glycine, tous les acides amins comportent au moins un carbone asy-

mtrique. Comme dans le cas des glucides, on distinguera les deux sries, D et L, mais

les acides amins naturels sont de la srie L (glucides de la srie D).

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Pour les mmes raisons, ces molcules sont dotes d'un pouvoir rotatoire.

Dissociation.

En fonction du pH du milieu, les fonctions acides ou basiques se dissocient. Par exemple,

en milieu acide, un excs de protons bloque la fonction carboxyle, qui ne se dissocie pas,

tandis que la fonction amine peut accepter un proton supplmentaire :

acide R-CH-NH2-COOH + H+ R-CH-NH3(+)-COOH (1)

neutre R-CH-NH2-COOH + OH- R-CH-NH2-COO-

basique R-CH-NH2-COOH R-CH-NH3(+)-COO- (2)

Les constantes de dissociation des deux


pH
12
fonctions sont elles aussi caractristiques de
9 l'acide amin :

6 [ R NH 2 ][ H + ]
[ R COO ][ H + ]
K1 = et K 2 =
R COOH [ R NH 3+ ]
3
Bien que les valeurs exactes varient d'un
1 0,5 0 0,5 1
+ H+ + OH- compos l'autre, on peut considrer que

K1 10-4 10-6 et K2 10-8 10-10. A pH =

7, pour des valeurs moyennes de K1 = 10-5 et K2 = 10-9, on a :

5 [ R COO ] 10 7 [ R COO ] 2
10 = = 10
[ R COOH ] [ R COOH ]

Ce qui revient dire qu' pH = 7, il y a une molcule non dissocie pour 100 molcules

ionises. De la mme faon, on calcule :

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9 [ R NH 2 ] 10 7 [ R NH 2 ] 2 Il y a l aussi 1% de formes non dissocies.


10 = = 10
[ R NH 3+ ] [ R NH 3+ ]
Lorsque la concentration en H+ est gale

K1, c'est dire quand pK1 = pH, il y a autant de molcules non dissocies que d'anions.

Le pK correspond au pH de demi-dissociation.

Les acides amins sont donc des composs amphotres, les deux fonctions sont ionisa-

bles. On dfinit le point isolectrique ou pHi comme la valeur du pH pour laquelle on

obtient une forme comportant les deux fonctions ionise et appele amphiion. Le pHi est

une valeur caractristique de l'acide amin.

pK 1 + pK 2 La prsence de plusieurs groupes carboxyles ou amins sur une mme


pH i =
2
molcule entrane une modification du pHi par rapport une molcule

n'ayant qu'un seul de chaque groupement. Le pHi est alors calcul sur l'ensemble des

groupements.

En fonction de l'ionisation de l'acide amin, il se dplacera dans un champ lectrique soit

vers la cathode (s'il est charg positivement), soit vers l'anode (charge ngative).

Solubilit.

Les acides amins sont solubles dans l'eau, pas dans les solvants organiques (la nature

du radical peut cependant modifier cette solubilit).

Ractivit.

Liaison peptidique.

Elle est lie la prsence des deux groupements qui peuvent ragir ensemble pour for-

mer une liaison peptidique :

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R1 CH NH 2 + HOOC CH R2 R1 CH N C C R2
H O H
COOH NH 2 COOH NH 2

Les atomes engags dans la liaison peptidique sont tous placs dans le mme plan.

Grce cette liaison peptidique, des polymres de taille parfois trs grande peuvent tre

forms :

acide amin = 1 < oligopeptide < 4 - 5 < polypeptide < 100 < protine

sujet des chapitres suivants.

Ractions lies au carboxyle.

A pH trs lev, il peut donner un sel.

La dcarboxylation peut tre ralise chimiquement ou par une enzyme. Elle conduit la

formation d'une amine simple (R-CH2-NH2), et elle intervient frquemment dans le mta-

bolisme (interconversion de composs).

Ractions lies l'amine.

Les hydrognes de l'amine peuvent tre substitu par d'autres radicaux, aliphatiques,

aromatiques, etc.

Les acides dicarboxyliques et leurs amines sont importants pour le transfert des groupe-

ments amins : intervention de transaminases :

R1-CO-NH2 + R2-CO-COOH R1-CO-COOH + R2-CO-NH2

Glu + AOA KG + Asp Glu + Pyr KG + Ala

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Biochimie structurale Peptides

Le formol agit sur la fonction amine primaire pour conduire la formation d'une amine ter-

tiaire :

COO - O COO - Raction la ninhydrine.


R CH +2 H C R CH CH 2OH
NH 2 H N
Les acides amins ragissent avec la
CH 2OH

ninhydrine oxyde pour former un com-

plexe de deux molcules de ninhydrine (rduites) lies par l'azote de l'AA. Ce complexe

absorbe fortement 570 nm environ et la raction sert au dosage des acides amins.

Mthodes d'analyse.

L'extraction des acides amins libres peut se faire simplement l'eau, puisqu'ils sont so-

lubles.

On les spare sur des colonnes changeuses d'anions ou de cations, c'est dire en fonc-

tion de leur caractre acide ou basique un pH donn : on recueille ainsi trois fractions,

acide, basique et neutre. La fraction neutre contient en plus les glucides solubles.

La sparation fine se fait gnralement par chromatographie (papier, basse ou haute

pression, CCM,). On utilise frquemment l'lectrophorse (sur papier ou sur gel) pour

analyser les acides amins. Le support est plac dans une solution tamponne ( pH

choisi convenablement) et soumis un champ lectrique. En fonction du pH et du champ,

les AA migrent dans un sens, dans l'autre, ou restent au niveau du dpt.

L'analyse et la quantification se font gnralement soit par raction colore (ninhydrine),

soit par dtection dans l'UV des longueurs d'onde gnralement infrieures 230 nm

(les glucides, par exemple, n'absorbent pas dans l'UV et donc n'interfrent pas dans le

dosage).

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Biochimie structurale Peptides

Peptides et protines.

Les peptides sont de petits polymres d'acides amins, lis entre eux par des liaisons

peptidiques. La raction du biuret permet le dosage des peptides en milieu alcalin : les

liaisons peptidiques forment un complexe violet en prsence d'ions cuivriques.

Leurs proprits sont intermdiaires entre celles des acides amins et celles des proti-

nes.

Ils sont plus ou moins solubles dans l'eau, et prsentent un caractre amphotre, li leur

pHi

Gnralits.

Polymres d'acides amins relis par des liaisons peptidiques. Il existe 20 AA majeurs

entrant dans la composition des protines (plus quelques autres, un peu originaux).

Les conventions d'criture placent la fonction N terminale gauche, et la fonction C termi-

nale droite.

Les protines jouent diffrents rles dans l'organisme : structure (maintien de la mem-

brane plasmique) ou mtabolisme (enzymes ; protines porteuses,)

Structure primaire.

C'est la squence en acides amins.

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Biochimie structurale Peptides

Composition en acides amins.

Hydrolyse.

La composition brute en AA peut tre dtermine par hydrolyse chimique (HCl 6N, 105C,

24 h, ampoule scelle). Le mlange obtenu est ensuite analys par chromatographie (pa-

pier 2 dimensions, HPLC, ). Cette mthode pose problme car elle conduit la destruc-

tion de certains AA, l'isomrisation D - L d'autres, etc.

L'hydrolyse peut aussi tre ralise par voie enzymatique (protases), mais on n'obtient

gnralement que des polypeptides, et non les AA eux-mmes.

Nombre d'acides amins - Titration au formol.

Une protine ne contient thoriquement qu'une seule fonction acide libre et une seule

fonction amine libre, les autres tant engages dans les liaisons peptidiques. Cependant

les acides dicarboxyliques ou diamins ventuels prsentent une fonction libre chacun.

On prend l'exemple d'une protine n'ayant ni acide dicarboxylique, ni acide diamin. On

bloque la fonction amine terminale par raction au formol. Il ne reste que la fonction acide

libre. Un dosage acide - base donne un certain volume de base ncessaire la neutralisa-

tion de la fonction acide. On refait la mme exprience avec la protine hydrolyse. Cette

fois, toutes les fonctions acides sont disponibles, et il faut d'autant plus de base pour les

neutraliser. Le rapport entre les deux volumes donne une approximation du nombre d'aci-

des amins composant la protine.

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Biochimie structurale Peptides

Dtermination de la squence propre en AA.

Mthodes chimiques.

F + H2 N CH COOH HN CH COOH + HF Mthode de Sanger : Rsidu


O2 N R O2 N R
N terminal.

Le dinitrofluorobenzne
NO 2 NO 2
(NDFB) forme, avec la

fonction N terminale, un driv avec libration d'acide fluorhydrique. L'hydrolyse de la pro-

tine libre ensuite le compos driv, qui prsente des caractristiques propres de colo-

ration et de migration en chromatographie ou en lectrophorse. En comparant le rsultat

de l'analyse aux standards connue et l'hydrolyse "simple" pratique plus haut, on peut

connatre l'acide amin N terminal.

Dansylation : Rsidu N terminal.

Le chlorure de 1-dinthyl-amino-naphtalne-5-sulfonyle (DANS) ragit avec le NH2 termi-

nal et donne un driv (dansyl-amino-acide) dcelable par sa fluorescence jaune. La m-

thodologie est la mme que dans le cas de la mthode de Sanger, mais la raction est

100 fois plus sensible. La dansylation est utilise pour doser les acides amins par HPLC

car elle permet une meilleure dtection et une meilleure quantification.

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Biochimie structurale Peptides

Mthode d'Edman :
R1
R2 R1 C H
S R2 CH N Rsidu N terminal.
C C N C C NH 2 + N C C N C C S
O H H O H O H H O
N Le phnylthioi-
Peptide 1 Phnylthioisocyanate
R1
H socyanate
CH N
R3 R2
OC C S donne une ph-
C C N C C NH 2 + N
O H H O H
Phnylthiodantoine nylthiodantoine
Peptide 2 = peptide 1 (-) AA 1
avec l'acide N

terminal. Il libre un nouveau polypeptide, ayant un AA de moins que le prcdent, avec

lequel il peut alors ragir. Cette dtermination est donc dite rcurrente. En l'arrtant

temps, ou en utilisant diverses mthodes mathmatiques, on peut ainsi connatre de pro-

che en proche la composition complte de la molcule. Cette technique a t utilise dans

un appareil automatis.

Raction l'hydrazine : Rsidu C terminal.

HN CH C N CH COOH + H2 N NH 2 H2 N CH C N NH 2 + H2 N CH COOH
O H O H
R R1
n R R1
n n

Un traitement l'hydrazine 100C hydrolyse toutes les liaisons peptidiques, et libre des

hydrazides de tous les AA sauf le C terminal, qui se prsente comme un AA libre normal.

Il est alors facile isoler et identifier.

Mthodes enzymatiques.

Pour chacune des extrmits, il existe une enzyme particulire qui hydrolyse les acides

terminaux. Il s'agit de la carboxypeptidase et de l'aminopeptidase, qui librent respecti-

vement l'acide C-terminal et l'acide N-terminal. Il s'agit de mthodes rcurrentes, qui d-

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Biochimie structurale Peptides

gradent le polypeptide dans toute sa longueur. On parvient connatre la squence grce

la vitesse de libration des acides amins.

Structure secondaire.

L'encombrement strique des acides amins et les angles des liaisons font que l'encha-

nement n'est pas linaire, mais prsente un certain nombre de replis. En outre, les diff-

rentes portions des replis peuvent tablir entre elles des liaisons qui vont contribuer

consolider la structure.

Liaisons intervenant dans la structure spatiale.

Liaison disulfure.

C'est une liaison covalente forte tablie entre deux rsidus cystine appartenant une

seule chane ou deux chanes diffrentes.

Liaison ionique (ou saline).

C'est une liaison lectrovalente (plus faible) tablie entre deux charges de signe oppos :

NH3+ et COO-. Ce type d'interaction permet la liaison de deux molcules de type diffrent

dans les htroprotines.

Liaison hydrogne.

Ce type de liaison non covalente se forme lorsque sont proximit l'un de l'autre d'une

part un atome d'hydrogne li un azote ou un oxygne, et d'autre part un doublet lec-

tronique non partag d'un autre azote ou d'un autre oxygne.

Ces liaisons peuvent s'tablir entre :

les C=O et les N-H des liaisons peptidiques ;

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Biochimie structurale Peptides

les radicaux des rsidus d'acides amins, impliquant par exemple les noyaux phnoli-

ques, le carboxyle du glutamate, etc.

Liaison hydrophobe.

Les chanes latrales hydrophobes de certains acides amins (Ala ; Val ; Leu ; Ile ; Phe)

sont repousses par l'eau et ont donc tendance se rapprocher les unes des autres (inte-

ractions de type Van der Waals).

2. Proprits spatiales de la liaison peptidique.

R1 H O

C C H
C H C H
N C
C N C N+ H

O C -O C R2
H H

La liaison peptidique peut s'crire sous deux formes : elle possde donc un caractre

de double liaison, ce qui implique que les atomes soient tous dans le mme plan. Il

existe une possibilit d'isomrie cis - trans pour les rsidus de part et d'autre de la liaison.

Ces proprits entranent trois possibilits de conformation spatiale :

les plans successifs alternent de part et d'autre selon deux orientations privilgies, et

on parlera de structure en feuillet pliss ;

les plans successifs tournent rgulirement dans le mme sens, et on parlera de struc-

ture hlicodale ;

il n'y a pas de direction privilgie, et on parlera de pelote statistique.

Feuillets plisss.

Protines fibreuses. Liaisons hydrognes inter-chanes

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Biochimie structurale Peptides

Hlices .

Protines globulaires. Liaisons hydrogne intra-chane.

Structure tertiaire.

Dfinition.

Une protine peut en fait adopter les diffrents types de structure secondaire en diffrents

endroits de sa structure primaire, ou selon les conditions extrieures. Il s'ensuit que la mo-

lcule acquiert un encombrement strique particulier : la conformation de la protine.

Notion de site actif.

Le volume est rempli par les acides amins. Des acides loigns dans la structure pri-

maire peuvent se placer proximit les uns des autres, voire tablir de nouvelles liaisons.

L'environnement lectronique des acides est donc modifi. Des cryptes peuvent se for-

mer : en fonction de la nature des acides amins et de l'espace vide qu'ils entourent, cer-

taines molcules extrieures pourront venir s'y placer, mais pas d'autres. Parmi les mol-

cules pouvant se fixer, certaines subiront des modifications : site de fixation et site actif

des enzymes.

Structure quaternaire.

Il arrive qu'une protine seule ne soit pas fonctionnelle. Il faut que plusieurs molcules de

la mme protine s'associent pour que la fonction soit assure. On parle alors de mono-

mres s'associant en oligomres ou en polymres.

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Biochimie structurale Peptides

Dans certains cas, l'association concerne plusieurs oligomres d'une mme protine,

mais parfois il s'agit de monomres de molcules diffrentes : cas des porines (8 fois la

mme protine, formant canal) ou de la RubisCO (2 x 4 protines)

La dnaturation d'une protine peut correspondre la rupture des liaisons entre les cha-

nes. Sans atteinte aux liaisons peptidiques, la protine perd alors ses proprits fonction-

nelles.

Principales proprits des protines.

Solubilit.

Elle est trs variable, et dpend de plusieurs facteurs :

Electrolytes.

Les sels neutres faible concentration ont un effet dissolvant, tandis qu' forte concentra-

tion, ils provoquent la prcipitation des protines. On peut alors sparer les diffrentes

classes de protines en fonction de la concentration laquelle elles prcipitent. On ajoute

progressivement du sel (ex. sulfate d'ammonium) dans le milieu. Entre chaque ajout, on

centrifuge et on recueille la fraction ayant prcipit.

pH.

La solubilit d'une protine est minimale au voisinage de son pHi. Dans certains cas, on

peut obtenir la cristallisation d'une protine en augmentant progressivement sa concentra-

tion tout en la maintenant son pHi.

Solvant organiques.

L'thanol, le mthanol et l'actone peuvent tre utiliss pour faire prcipiter les protines.

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Biochimie structurale Peptides

Dtermination de la masse molculaire.

Les masses molculaires peuvent varier de 10 000 plus de 1 000 000.

Filtration sur gel de dextrane.

Les gels utiliss sont de type Sephadex. Ce sont des polymres glucidiques synthtiques

ayant des liaisons croises. Ces liaisons dterminent une certaine porosit. On parle de

tamisage molculaire : les plus grosses molcules, exclues du gel, passent rapidement,

tandis que les plus petites sont retenues par le rseau. On commence par talonner le gel

en faisant passer des molcules de masse connues et en mesurant leur temps de rten-

tion, puis on fait passer des chantillons de masse inconnue, et on compare leur temps de

rtention ceux mesurs.

Ultracentrifugation. Sdimentation.

La centrifugation haute vitesse d'une solution de protine provoque sa sdimentation en

fonction de sa densit (qui est ncessairement suprieure celle du solvant). Grce des

systmes optiques, on peut suivre cette sdimentation au cours du temps. On parvient

sparer les diffrentes protines de la solution, et les comparer des tmoins.

On peut aussi utiliser un solvant de densit variable, et les protines vont alors se placer

dans la zone correspondant leur densit. Cette mthode est aussi applique la spa-

ration des organites cellulaires.

Electrophorse.

L'lectrophorse, notamment sur gel de polyacrylamide (PAGE), utilise le caractre am-

photre des protines. Places dans un champ lectrique, elles se dplacent vers l'lec-

trode qui les attire. Comme dans les autres cas, la comparaison des protines de rf-

rence permet de savoir leur masse molculaire.

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Biochimie structurale Peptides

Classification des protines.

Classification selon la forme des molcules.

Protines fibreuses ou sclroprotines.

Pratiquement insolubles. Fibrones de la soie ; collagnes (tissus conjonctifs transfor-

mables par la chaleur en glatines) ; kratines.

Protines globulaires ou sphroprotines.

Forme gnrale sphrique ou ovode.

Classification selon la solubilit.

Albumines.

Solubles dans l'eau distille. Prcipitent par addition de sulfate d'ammonium entre 70 et

100% de la saturation. pHi < 7 (caractre acide).

Globulines.

insolubles dans l'eau pure, mais solubles dans les solutions salines dilues (NaCl 5%),

prcipitent par addition de sulfate d'ammonium 50% de la saturation. Souvent des gly-

coprotines ou lipoprotines.

Protamines et histones.

Solubles, taille petite (plutt polypeptides que protines) ; trs basiques (lysine et arginine)

pHi lev.

Globines.

solubles dans l'eau.

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Biochimie structurale Peptides

Prolamines et glutlines

Protines vgtales insolubles dans l'eau, mais solubles dans les acides et les bases di-

lus.

Classification selon la composition.

Holoprotines.

Elles ne sont constitues que d'acides amins.

Htroprotines.

Elles comportent une ou plusieurs chanes peptidiques associes (homoprotine) lies

par covalence un groupement prosthtique de nature non glucidique. La nature de ce

groupement est extrmement varie :

glucide glycoprotines

lipide lipoprotines

phosphate phosphoprotines

ion mtallique chromoprotines (hmoglobines, cytochromes)

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Acides nucliques

Introduction

Constituants universels de la matire vivante, reprsentant 10 20 % de la masse sche.

Caractre acide

Regroups en deux classes :

acides dsoxyribonucliques = ADN

acides ribonucliques = ARN

Composition

HOH 2 C O OH HOH 2 C O OH Oses

Deux pentoses peuvent entrer dans


HO OH HO H

la composition des acides nucli-


D ribose 2 dsoxy D ribose
ques : le ribose ou sa forme 2 d-

soxy.

Bases azotes

Les constituants de base des acides nucliques sont des composs portant plusieurs

fonctions amines, ce qui leur confre un caractre basique. On distingue deux groupes :

les bases puriques et les bases pyrimidiques.

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Biochimie structurale Acides nucliques

Bases puriques

Deux bases puriques principales sont trouves dans les acides nucliques : la guanine et

l'adnine.

NH 2 O

N N N
N N N

N N N
N H N H H2 N N H

Purine Adnine = 6 amino-purine Guanine = 2-amino-6-oxy-purine

Il existe d'autres bases naturelles, que l'on trouve par exemple dans certains ARNt, ainsi

que des drivs ayant des fonctions particulires, notamment des hormones vgtales

(cytokinines, impliques dans la division cellulaire).

Bases pyrimidiques

Elles drivent de la pyrimidine.

NH 2 O O

CH 3
N N HN HN

N O N O N O N
H H H H

Pyrimidine Cytosine Uracile Thymine


(2-oxy-4-amino-pyrimidine) (2,4-dioxy-pyrimidine) (2,4 dioxy-5-mthyl pyrimidine
ou 5-mthyl-uracile)

Comme dans le cas des bases puriques, il en existe d'autres, par exemple dans l'ADN de

certains bactriophages (virus infectant des bactries).

La cytosine et l'uracile se trouvent dans les ARN, mais la thymine remplace l'uracile dans

les ADN.

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Biochimie structurale Acides nucliques

NH 2 NH 2 Nuclosides
6 N7
N1 5 N
8 La liaison d'une base et d'un pentose forme
2 4
N9
N3 O N1
HOH 2 C5 ' O
O
un nucloside. On numrote les atomes de
4' 1' HOH 2 C5 '
4' 1'
H H H la base de 1 9 (bases puriques) ou de 1
3' 2' H
3' 2'
OH H
6 (bases pyrimidique). Pour ne pas les
Adnosine dCytosine
confondre, les atomes du pentose sont nu-

mrots de 1' 5'.

Nuclotides.

Nuclotides monophosphate.

La fonction alcool primaire du carbone 5' du pentose peut tre estrifie par un acide

phosphorique. On obtient alors un nuclotide. Il peut tre monophosphate s'il n'y a qu'un

seul phosphore.

Base Ribonucloside Ribonuclotide

Adnine Adnosine Adnylate Adnosine monophosphate (AMP)

Guanine Guanosine Guanylate Guanosine monophosphate (GMP)

Uracile Uridine Uridylate Uridine monophosphate (UMP)

Cyto- Cytidine Cytidylate Cytosine monophosphate (CMP)

sine

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Biochimie structurale Acides nucliques

Base Dsoxyribo- Dsoxyribonuclotide

nucloside

Adnine Dsoxyadnosine Dsoxyadny- Dsoxyadnosine monophosphate

late (dAMP)

Guanine Dsoxyguanosine Dsoxyguany- Dsoxyguanosine monophosphate

late (dGMP)

Uracile Dsoxyuridine Dsoxyuridylate Dsoxyuridine monophosphate

(dUMP)

Thy- Thymidine Thymidylate Thymidine monophosphate (TMP)

mine

Nuclotides diphosphate et triphosphate.

Les molcules d'acide phosphorique portes par le pentose peuvent se lier d'autres mo-

lcules du mme acide par une liaison dite phosphodiester. Ces liaisons demandent une

grande nergie pour leur formation, mais peuvent restituer cette nergie lors de leur hy-

drolyse.

O
O

ATP O
O P OH
O
O P OH
P
OH
OH UTP P OH
O NH 2 OH
O O
O P OH N N O P OH
NH
O Adnine
O Uracile
CH 2 O N N
CH 2 O N O

H
H
OH OH
OH OH

Ribose Ribose

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Biochimie structurale Acides nucliques

Structure

Structure primaire

L'alternance pentose - phosphate cre le sque-


O
lette de l'acide nuclique (ADN et ARN).
HN
O
HO P O O N
H2 Structure secondaire de
O C O
NH2 l'ADN
O N
N
HO P O Watson et Crick, 1953.
H2 N N
O C O
A G A +G
NH2 = = 1 et = 1 ou A + G = T + C , c'est
T C T+C

O N
dire qu'il y a autant de bases puriques que de
HO P O O
H2 N
O C O bases pyrimidiques.

A +T
En revanche, est trs variable et spci-
G+C
O
fique.

Les tudes en Rx (aprs cristallisation) mon-

trent qu'il s'agit d'une hlice.

Il existe des liaisons hydrogne.

La structure est celle d'une double hlice. ; il y a appariement des bases homologues.

La molcule hlicodale est dextrogyre. Le pas de l'hlice est de 30, le diamtre de 20.

Il y a toujours la mme quantit d'ADN dans un noyau, et une composition fixe en bases

azotes pour tous les types cellulaires d'un espce donne.

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Biochimie structurale Acides nucliques

La complmentarit des bases st essentielle la stabilit de la double hlice. Les deux

chanes sont opposes, ou anti-parallles.

Proprits de l'ADN

L'ADN est soluble dans l'eau sous forme de sels de sodium (en donnant une solution vis-

queuse). Il prcipite dans l'thanol ( moyen efficace pour l'isoler puis l'tudier).

La prsence des bases provoque une absorption caractristique dans l'UV 260 nm.

Cette absorption est de 30% infrieure celle d'un mlange comportant la mme quantit

de bases et les mmes proportions que l'ADN tudi : c'est l'effet hypochrome, d aux

liaisons hydrognes entre les bases des deux brins.

Dnaturation thermique. A partir d'une solution d'ADN natif, lorsqu'on augmente progres-

sivement la temprature, on constate une lvation de la DO260 courbe de fusion de

l'ADN.

Cette augmentation brusque de la DO est appe-


DO
260
le effet hyperchrome. En mme temps, on note

une diminution de la viscosit de la solution.

La courbe de fusion correspond la sparation

des deux brins qui forment l'hlice. La rupture

des liaisons hydrogne provoque une dspirali-


T
sation de la molcule. L'ADN devient monoca-

tnaire, il est dnatur.

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Biochimie structurale Acides nucliques

Les courbes de fusion de deux molcules d'ADN prsentent des valeurs diffrentes de

temprature de demi-dissociation cause d'une composition diffrente en bases : lorsque

la teneur en G+C augmente, la temprature augmente aussi.

Le phnomne est rversible par simple refroidissement progressif de la solution. L'ADN

reforme la double hlice et redevient donc bicatnaire. Si le refroidissement est brusque,

les chanes restent monocatnaires.

La reformation de la double hlice est d'autant meilleure que la complmentarit entre les

brins est plus grande. En consquence, si on place dans la solution deux brins bicatnai-

res diffrents, et qu'on chauffe, les deux donnent chacun deux brins. Lors du refroidisse-

ment, les sections ayant des bases homologues pourront s'apparier, tandis que les sec-

tions non homologues ne le pourront pas. Il y a formation de portions bicatnaires, et de

portions en boucles non apparies. C'est l'hybridation des acides nucliques.

Structure secondaire des ARN

Structure et proprits gnrales

Leur masse molculaire est plus faible que celle des ADN : ils sont plus petits. Ce sont

des chanes monocatnaires de nuclotides : A, G, C, U. Il peut y avoir des portions com-

plmentaires de parties diffrentes de la chane crant des replis : zones bicatnaires,

stabilises par des liaisons hydrognes.

Leur solubilit et leur absorption dans l'UV sont proches de celles de l'ADN. On n'obtient

pas dans leur cas de courbe de fusion directement comparable celle de l'ADN, mais en

revanche, on peut provoquer l'hybridation d'un ADN et d'un ARN. IL n'y a pas d'effet hy-

perchrome ni d'effet hypochrome.

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Biochimie structurale Acides nucliques

Diffrents types d'ARN

A part dans le cas des Virus, le cellules prsentent trois types diffrent d'ARN au moins.

ARN messagers = ARNm

Il s'agit de la squence complmentaire d'une portion de l'ADN de la cellule. Il est obtenu

par transcription partir de l'ADN.

Transcription : on garde le mme langage (c'est dire le code gntique), mais on change

d'alphabet (T -> U).

Traduction : on change de langage du code gntique en codon, on passe aux proti-

nes constitues d'acides amins. Moyen mnmotechnique : les oprations se font dans

l'ordre alphabtique inverse.

Les ARN messagers sont "linaires". Leur masse molculaire est trs leve, en liaison

avec la taille de la protine qu'ils codent. Elle volue au cours de leur maturation (matura-

tion post transcriptionnelle) : une partie de ce qui a t transcrit est limin. En particulier,

ils sont souvent prcds, leur extrmit 3' d'une chane de plusieurs adnosines (30

200) : ARNm poly A. Cette squence une rle signal intervenant dans la reconnaissance

avec les ribosomes.

Les ARNm ont une dure de vie courte (demi-vie de quelques heures pour la plupart),

sauf dans des cas particuliers, par exemple dans les formes de vie ralentie comme les

graines des vgtaux.

ARN de transfert = ARNt

Les ARNt ont gnralement une configuration en feuille de trfle. Ils prsentent des replis

et des zones apparies. Une des boucle porte l'anti-codon, c'est dire le triplet de bases

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Biochimie structurale Acides nucliques

complmentaires du triplet codant de l'ARN messager. L'extrmit 3' porte l'acide amin

pour lequel code le codon.

ARN ribosomiaux = ARNr

Ils reprsentent 80% de l'ARN total de la cellule. Leur masse molculaire est trs impor-

tante. On les distingue sur la base de leur coefficient de sdimentation. Un ribosome est

form de plusieurs chanes d'acide nuclique.

Les acides nucliques particuliers

Les bactries et les virus (procaryotes), d'une part, ainsi que les chloroplastes et les mito-

chondries ont des acides nucliques comparables ceux des autres cellules d'un point de

vue gnral, mais prsentant un certain nombre de particularits connatre.

L'ADN n'est par organis en chromatine ni en chromosome ; il n'est pas enferm dans une

enveloppe nuclaire.

Le code gntique est lgrement diffrent. C'est chez ces organismes qu'on rencontre le

plus de bases rares.

Les ribosomes ont des coefficients de sdimentation diffrents.

Les rtrovirus prsentent la particularit de possder uniquement une molcule d'ARN,

mais pas d'ADN. Cet ARN doit d'abord tre transcrit en ADN par la cellule hte. L'enzyme

implique est la transcriptase reverse.

Mthodes d'tude

L'extraction se fait partir d'un matriel riche en acide nuclique : de prfrence des cel-

lules jeunes, en division. Aprs broyage (fort, de faon faire clater les noyaux) et sou-

Ph. Collas UCO Bretagne Nord 45


Biochimie structurale Acides nucliques

vent dlipidation, l'extraction se fait dans une solution saline. L'extrait contient alors g-

nralement un mlange de protines et d'acides nucliques.

Les protines sont limines par centrifugation, puis les acides nucliques sont prcipits

par l'thanol.

On peut effectuer un dosage colorimtrique portant soit sur le phosphore, soit sur le pen-

tose.

La sparation des diffrentes classes d'acides se fait gnralement par lectrophorse sur

gel, avec des techniques varie (biologie molculaire). On parvient caractriser des

groupes d'ARN, par exemple, caractristiques de telle ou telle phase du dveloppement

de l'organisme, c'est dire que les protines correspondantes ne sont synthtises qu'

certaines priodes de la vie.

La localisation cellulaire peut tre faite par diverses mthodes.

Une coloration de type Feulgen colore spcifiquement l'ADN en rose.

Aprs l'ajout d'une molcule marque (par exemple thymine tricie), certaines molcules

d'ADN seront marques. La prparation cellulaire est fixe, puis on la place sous une pla-

que photographique. Les grains d'argent de l'mulsion photographique sont impression-

ns par l'mission radioactive, ce qui permet de localiser les compartiments cellulaires

dans lesquels s'est fait l'incorporation.

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Mthodes d'tude

Prparation de l'chantillon :

Fractionnement cellulaire

Constitution gnrale des tissus et des

cellules

De l'extrieur vers l'intrieur :

Tissu = de cellules, entre lesquelles il n'y a pas de vide, mais des parois vgtales, des

constituants interstitiels animaux, le tout baignant dans un liquide complexe on peut

avoir besoin d'analyser les constituants en question.

Cellule :

membrane plasmique : lipides, protines

cytoplasme / cytosol : gel de protines, de sels minraux, de toutes sortes de molcules

organites : enveloppe de 2 membranes + matrice (stroma) propres.

Fractionnement

Lorsque le compartiment cellulaire n'est pas abordable directement, il faut commencer par

le sparer des autres parties du tissu ou de la cellule (le sang est directement isolable, par

exemple).

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Broyage

fin, mais trop long = pertes / polytron, Moulinex, mortier - pilon, sable de Fontainebleau,

poudre fine de prfrence

pH fix / tampon

anti-oxydant (pb phnols)

froid (enzymes en gnral)

BSA : protases

osmoticum : organites

qualitatif / quantitatif : les impratifs ne sont pas les mmes

Sparation

Solubilisation

selon le compos isoler :

solvant organique lipides et composs apolaires

solvant aqueux composs polaires : glucides, acides amins, peptides, ARN de pe-

tite taille,

insolubles nombreuses substances de composition particulire, ou encore de taille

importante

Mlanges ou successions de solvants :

Un premier passage d'un solvant organique peut par exemple liminer les lipides (dlipi-

dation), et laisser les autres composs. Une limination spcifique d'un compos est par-

fois plus efficace qu'une tentative de purification directe du compos cherch.

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Filtration

La mthode la plus simple de sparer un lment soluble des lments insolubles (exem-

ple type : la percolation du caf!)

Aprs fractionnement, il reste : des dbris cellulaires, des cellules, des organites de taille

variable, qui resteront sur le papier filtre.

Centrifugation

L'application d'une force centrifuge un chantillon (liquide ou pteux) quivaut l'appli-

cation d'une force gravitationnelle contrle. On spare donc les composs en fonction de

leur masse et de leur densit.

Milieu de sparation : tous les composs de densit suprieure celle du milieu surnage-

ront, tandis que tous les composs de densit infrieure sdimenteront. Le rsultat est le

mme que celui de la filtration.

Centrifugation sur gradient : il est possible de crer un gradient de densit le long du tube

centrifuger. Les composs / organites se placent dans la zone correspondant leur

densit.

Exemple : fractionnement du foie de Rat

Homognat

10 min. 600 g culot

10 min. 600 g

surnageant culot : noyaux et dbris cellulaires

10 min. 8 000 g culot : mitochondries

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10 min. 15 000 g culot : lysosomes

60 min. 100 000 g culot : microsomes

surnageant : molcules

Purification

Solubilit diffrentielle

Exemple : purification des chlorophylles partir de feuilles d'orties :

Broyage, extraction dans l'actone 85% : solubilisation de tous les composs apolaires,

plus une partie des composs polaires.

Filtration sur papier

Chlorure d'ammonium 10% : prcipitation des protines

Ether : les chlorophylles passent prfrentiellement dans l'ther, la phase actone - eau

devient limpide limination

Lavages l'eau : certaines impurets peuvent rester dans la phase thre, les lavages

permettent de les reprendre et de les liminer

Mthanol : la chlorophylle b est plus soluble dans l'thanol que dans l'ther, inverse pour

la chlorophylle a les deux chlorophylles sont spares et peuvent tre (thoriquement)

tudies sparment.

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Techniques chromatographiques

Lorsque plusieurs composs prsentent les mmes caractristiques de solubilit, on peut

les sparer par chromatographie : exemple de mlange de composs polaires :

broyage, extraction l'eau, filtration : les lipides et les grosses protines restent sur le fil-

tre, les glucides et les acides amins passent dans le filtrat.

Chromatographie d'exclusion : les plus grosses molcules (polypeptides, polyosides) pas-

sent rapidement et sont exclues, les petites (acides amins et glucides simples) sont re-

cueillies ensuite.

Chromatographie d'change ionique :

une colonne changeuse d'anions retient tous les composs cationiques (chargs posi-

tivement) : acides amins dibasiques notamment

une colonne changeuse de cations retient tous les composs chargs ngativement :

acides diacides notamment

l'utilisation conscutive des deux colonnes permet de sparer le mlange en trois clas-

ses : acide, basique et neutre, la dernire correspondant aux glucides et aux acides

amins neutres.

Caractrisation

Techniques chromatographiques

Les chromatographies d'adsorption (sur papier, sur couche mince de cellulose ou d'alumi-

nium), en phase gazeuse, d'change d'ions ou d'exclusion permettent soit de faire une

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sparation grossire, soit de faire une sparation fine, en fonction des conditions d'utilisa-

tion.

Exemple : chromatographie bidimensionnelle sur papier d'un mlange de composs polai-

res

dpt d'un chantillon dans un des coins de la feuille

migration dans un premier solvant, volatil ; vaporation du solvant (une nuit 40C)

migration dans un second solvant, aprs retournement de la feuille 90

schage, rvlation

Electrophorse

L'lectrophorse permet de sparer et de caractriser diverses classes de molcules :

glucides simples ou composs, acides amins, peptides et protines. Elle convient un peu

moins aux lipides.

Techniques colorimtriques

Rvlation par coloration

Aprs une chromatographie ou une lectrophorse, les composs n'tant gnralement

pas colors, on cherche leur emplacement sur la feuille grce une coloration : rvlation

la ninhydrine pour les acides amins, au bleu de Coomassie ou au nitrate d'argent pour

les protines, l'anthrone pour les glucides, etc.

Dosages par colorimtrie

Lorsque la raction est quantitative, on peut appliquer la loi de Beer-Lambert :

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I = I0e- c l log(I/I0) = D. O. = c l

avec = coefficient d'extinction molaire, dpendant - de la longueur d'onde ; - de la na-

ture des liaisons du compos tudi

c = concentration de la solution

l = longueur du trajet optique, fixe 1 cm

Puisque l, et sont fixs, on a la relation simple : D. O. = f([c]).

On choisit une gamme de concentrations, laquelle on fait subir la raction, et on trace la

courbe obtenue :

DO Il ne faut pas oublier de

faire un blanc : il corres-


saturation
pond la valeur zro de la

concentration, et il permet

de savoir quelle est l'ab-

sorption due spcifique-

ment au ractif, et non au


bruit de fond [C]
produit doser. L' blanc

doit accompagner toute

srie de dterminations, car les conditions peuvent varier (par exemple dure de passage

et temprature du bain-marie).

Spectromtrie

Une autre application de la loi de Beer-Lambert est l'obtention de spectres. Dans ce cas,

la concentration est fixe, mais on fait varier la longueur d'onde. La disparition des rayon-

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nements d'une longueur d'onde correspond l'absorption de l'nergie des photons

concerns par une liaison particulire. Un pic d'absorption caractrise donc la prsence

d'une liaison dans la solution tudie. Si la prparation est pure, on est donc mme de

caractriser parfaitement le compos, en fonction des pics obtenus.

Techniques immunologiques

La facult de reconnaissance antigne - anticorps est de plus en plus utilise. La spcifici-

t de la raction est gnralement totale, mais dans le mme temps, elle ne donne pas de

rponse d'une grande ampleur. A la dtection est alors associe une amplification, sous

forme d'une raction enzymatique dont le produit est color.

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Index

Index

acide amin, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 30, 31, nergisation, 6
32, 36, 44, 45, 48, 51, 52 pimres, 3
acide gras, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 thanolamine, 16
acide linolique, 12 vaporation, 52
acide linolnique, 12 fluorescence, 28
acide olique, 11 fonction amine, 17, 20, 22, 25, 27
acide palmitique, 11 fonction carboxyle, 10, 22
acide phosphatydique, 15 fructose, 3
acide phosphorique, 6, 15, 16, 39, 40 furannose, 5, 6
acide starique, 11 furfural, 7
adnine, 38 galactosamine, 4
ADN, 37, 38, 41, 42, 43, 44, 45, 46 galactose, 3
aglycone, 1, 9 galacturonique, 4
Ala, 24, 31 Glu, 24
alcool, 4, 6, 14, 17 glucide, 1, 2, 3, 6, 7, 21, 25, 36, 48, 51, 52
alcool primaire, 2, 6, 39 glucosamine, 4, 9
alcool secondaire, 2 glucose, 3, 5
polyol, 4 glucose-6-phosphate, 6
aldhyde glycrique, 2 glucuronique, 4
aldose, 2, 3, 7 glutamate, 31
amidon, 1, 9 glycraldhyde, 2, 3
amphiion, 23 glycrides, 14
amylopectine, 9 Glycrides, 14
amylose, 9 glycrol, 14, 15, 16
AOA, 24 glycine, 21
arabinose, 3 Glycogne, 9
ARN, 37, 38, 41, 43, 44, 45, 46, 48 graines, 44
ARNm, 44 graisses, 10, 14
ARNt, 38, 44 guanine, 38
Asp, 24 htrosides, 1
bactries, 9, 38, 45 holosides, 1
bateau, 6 huiles, 10, 14
carotne, 17 isomres, 3
Cellobiose, 8 Kiliani, 3
Cellulose, 9 Lactose, 8
ctose, 2, 3, 7 lvogyres, 2
chaise, 6 liaison osidique, 7, 8
chlorophylle, 50 liaison peptidique, 23, 24, 31
chloroplastes, 45 Liaison peptidique, 23
choline, 16 liaisons peptidiques, 26, 27, 29, 30, 33
Chromatographie, 18, 19, 51 lipases, 14
cystine, 30 lipides, 10, 13, 15, 16, 18, 19, 47, 48, 51, 52
cytochromes, 36 longueur d'onde, 53
cytokinines, 38 lumire, 2
cytosine, 38 Maltose, 8
cytosol, 47 mannose, 3
dextrogyres, 2 membrane, 16, 26, 47
dihydroxyactone, 3 membrane plasmique, 16, 26, 47
dissociation, 22, 23, 43 membranes, 17, 47
disulfure, 30 mitochondries, 45, 49
eau, 5, 6, 7, 13, 14, 23, 25, 26, 31, 35, 36, 42, 50, 51 oligopeptide, 24
nantiomres, 2, 3 Osamines, 4
encombrement strique, 6, 30, 32 ose, 1, 4, 5, 6, 7, 8, 37

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Index

oside, 1 ribose, 3, 37
osides, 7, 8 ribosomes, 44, 45
oxygne, 5, 30 ribulose, 3
parois, 9, 47 RubisCO, 33
pectine, 9 saccharose, 1
pectines, 4 Saccharose, 8
pH, 2, 22, 23, 24, 25, 33, 48 savon, 13
pHi, 23, 26, 33, 35 srine, 16
phospholipides, 14, 16 site actif, 32
Phospholipides, 15 stroma, 47
phosphoryle, 15, 16 techniques chromatographiques, 18
photons, 54 temprature, 42, 43, 53
pigment, 17 thylakodes, 17
polypeptide, 24, 29, 30 thymine, 38, 46
pouvoir rotatoire, 2, 3, 5, 22 traduction, 1
procaryotes, 45 transcription, 44
protine, 24, 27, 28, 32, 33, 34, 44 Triglycrides, 14
protines, 26, 33, 34, 35, 44, 46, 47, 50, 51, 52 uracile, 38
proton, 22 virus, 38, 45
protons, 22 xylose, 3
Pyr, 24 KG, 24
pyrannose, 5, 6
raction de Maillard, 7

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Index

Table des matires

Biochimie structurale ...................................................................................................................................... 1


Glucides. ..................................................................................................................................................... 1
Introduction. ........................................................................................................................................... 1
Oses. ................................................................................................................................................... 1
Osides.................................................................................................................................................... 7
Lipides....................................................................................................................................................... 10
Introduction. ......................................................................................................................................... 10
Acides gras. ......................................................................................................................................... 10
Glycrolipides....................................................................................................................................... 14
Autres types de lipides.......................................................................................................................... 16
Mthodes d'analyse. ............................................................................................................................. 18
Peptides. ................................................................................................................................................... 20
Acides amins. ..................................................................................................................................... 20
Peptides et protines. ........................................................................................................................... 26
Acides nucliques ...................................................................................................................................... 37
Introduction .......................................................................................................................................... 37
Composition ......................................................................................................................................... 37
Structure .............................................................................................................................................. 41
Mthodes d'tude....................................................................................................................................... 47
Prparation de l'chantillon : Fractionnement cellulaire .......................................................................... 47
Purification ........................................................................................................................................... 50
Caractrisation ..................................................................................................................................... 51
Index ............................................................................................................................................................ 55
Table des matires ........................................................................................................................................ 57

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