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- Tema

OBTENCIN DE ENZIMAS DEL VENENO DE LA ARAA CAPULINA (Latrodectus

mactans) PARA LA ELABORACIN DE UN ANTIDOTO

Resumen

La viuda negra americana (Latrodectus mactans) es una especie del suborden de

los Araneomorphae, es el ms numeroso del orden Aranae, entre este orden estn
las araas ms tpicas y evolucionadas. Este suborden tiene posee registros desde
el periodo devnico hasta la actualidad, este subgrupo posee pocas especies
verdaderamente peligrosas en proporcin al nmero real de especies en este
orden. La ms conocida y de mayor distribucin mundial es la especie Latrodectus
mactan (viuda negra) teniendo tanto distribucin en regiones secas, hmedas, frias,
templadas, calientes y desde alturas de nivel del mar hasta a 3500 msnm o ms. La
viuda negra vive en ambientes protegidos por maleza y unicamente ataca de
manera defensiva por lo cual no son agresivas pero la respuesta defensiva es
inmediata.

El tipo de veneno es nurotxico, lo cual bloquea la transmisin de impulsos

nerviosos y paraliza el sistema nervioso central, provocando dolores musculares. El
objetivo del presente trabajo es el lograr separar los componentes para la
elaboracin de un anti veneno que no tenga efectos colaterales que perjudiquen a
los seres humanos.

Objetivos

Separacin de los componentes del veneno de Latrodectus mactans.

Elaboracin de un anti veneno que no tenga efectos colaterales que perjudiquen a

los seres humanos.

Justificacin

La viuda negra americana (Latrodectus mactans) es una especie de araa

araneomorfa. En este suborden, el ms numeroso del orden Araneae, se incluye a
las araas ms tpicas y evolucionadas: tienen un par de pulmones, los quelceros
muy evolucionados y en posicin oblicua, de manera que se cruzan sus extremos,
y el abdomen sin ningn tipo de segmentacin aparente.

Estas araas tienen registros fosiles de sus primeras apariciones desde el periodo
devnico, carbonfero, eoceno, oligoceno, mioceno.

Mecanismo de accin del veneno

La actividad toxica de este veneno est liderada por la latrotoxina (neurotoxinas)

cuyo mecanismo de accin se centra en la liberacin pre sinptica de calcio y otros
iones, estimulando la liberacin de acetilcolina en las terminales neuromusculares
y catecolaminas en cerebro, cordn espinal y ganglios autnomos, las cuales
causan una estimulacin de la exocitosis de neuronas y de clulas endocrinas.

Las latrotoxinas son diferencialmente selectivos sobres vertebrados, peces,

insectos o crustceos. La latrotoxina es una potente neurotoxina que a
concentraciones **picomolar causa una masiva secrecin de neurotransmisores
resultando en el bloqueo de la transmisin nerviosa y llevando a una parlisis
muscular.

La latrotoxina al parecer presenta tres tipos de mecanismos de accin en las

neuronas, que llevan a la liberacin de iones intracelulares como el calcio y el sodio
terminando en la activacin de las mismas.

El primer mecanismo es el realizado por la latrotoxina sobre la membrana

citoplasmtica, en la cual provoca la aparicin de poros que llevan a la salida de
cationes **divalentes y monovalentes como el Ca++, Mg++, K+ y Na+ de la clula.

El segundo mecanismo est relacionado con la latrofilina, una protena que sirve
como receptor de la latrotoxina independiente de calcio. Esta protena se
encuentra insertada en la membrana citoplasmtica y una vez unida la latrotoxina,
se activan los canales de Ca++; sin embargo, este mecanismo no est an muy
claro.

El tercer mecanismo es mediado por la neurexina, el primer receptor descubierto

para la latrotoxina, aunque el mecanismo exacto de accin por el cual la genera
la salida de iones de la clula no se conoce muy bien.

La activacin de canales inicos genera al inicio masiva liberacin de **acetilcolina

y luego de **catecolaminas de las terminaciones nerviosas del sistema nervioso
autnomo. El veneno de Latrodectus spp posee adems pptidos que potencian la
accin de la bradiquinina.

Como resultado de estos eventos ocurre la despolarizacin de la unin

neuromuscular con hiperreactividad autonmica y agotamiento de la acetilcolina, lo
que explica algunas de las manifestaciones clnicas que se describen en la
intoxicacin.

La mordedura de la araa capulina produce el sndrome llamado latrodectismo,

conocido tambin como araismo sistmico o neurotxico. El veneno que inyecta,
clasificado como una toxalbmina y se dice que tiene un tercio de la potencia del
veneno de la vbora de cascabel. En el lugar de la lesin, debido a la introduccin
de los **quelceros, se ven uno o dos puntos, rodeados de crculos rojos; pronto
empieza a aparecer una gran inflamacin. El dolor, que puede presentarse poco
despus de la mordedura o al cabo de una a tres horas, es siempre muy intenso, a
veces insoportable, con sensacin de ardor; se va extendiendo por los miembros y
el cuerpo a las axilas y las ingles. Esto va acompaado de diversos sntomas, que
varan en los pacientes, como nusea, vmito, espasmos musculares, rigidez
abdominal, convulsiones, seguidas de **postracin y delirio; tambin hay vrtigos,
intensa sudoracin fra y dolor de cabeza, dificultad en la respiracin y en el habla,
se dilatan las pupilas, se presenta hipertensin, pulso dbil, temblor en las piernas,
algo de fiebre y un gran nerviosismo, ansiedad y angustia; puede haber, adems,
retencin de la orina y estreimiento. En la ltima etapa aparece, generalmente, una
nefritis aguda antes de la muerte. En ocasiones, el desenlace fatal se produce antes
de las 24 horas de haber sido mordido el paciente; se presenta sobre todo, en nios,
ancianos, hipertensos o personas especialmente sensibles al veneno. Hay, sin
embargo, un buen porcentaje de individuos que sobreviven esta intoxicacin. La
mejora se presenta al cabo de dos o tres das de tratamiento. Los antdotos
tradicionales producen efectos colaterales y los dolores pueden seguir hasta 72
horas despus. El Instituto de Biotecnologa de la UNAM en Morelos desarroll entre
1998 y 2000, empleando la ingeniera gentica, un antiveneno llamado Aracmyn
que realiza su efecto en 15 minutos. Este antdoto ha sido aprobado en Colombia,
Mxico, Panam, Per, Venezuela y Estados Unidos.

Entre todas estas sustancias, de las cuales la mayor parte es an desconocida, hay
unas cuantas que son, o podran ser, de gran utilidad e inters en mbitos tan
diversos como la medicina y la farmacologa, o todo tipo de industrias, tecnologas
e ingenieras. Las sustancias producidas, o sintetizadas, por las clases de
artrpodos llamadas arcnidos e insectos (los artrpodos comprenden a ms del
80% de todas las especies animales que se conocen), y concretamente en las
sustancias que utilizan para el ataque, la defensa y la alimentacin (venenos,
reacciones o fibras fascinantes, como la tela de araa).

En cuanto a la utilidad de los venenos para uso mdico (analgsicos, antibiticos)

u otros posibles (pesticidas) se investiga sobre todo con tarntulas y grandes araas
(probablemente porque su mayor tamao facilita mucho el manejo, y porque las
cantidades de toxina extrada son tambin muchos mayores).

En los venenos neurotxicos de algunas tarntulas mexicanas se encuentran

toxinas polipeptdicas de bajo peso molecular (de 3 a 10 **KDa. 1 Dalton = 1 u.m.a).
Estas toxinas tienen como objetivo los canales inicos de membrana. Al unirse a
stos, impiden el flujo de iones en las neuronas, lo cual produce parlisis muscular
en insectos. Algunos de estos pptidos tambin son txicos para reptiles y
pequeos mamferos (ratones). Lo especfico de tales sustancias (algunas atacan
a insectos pero no a mamferos, y viceversa) las hace buenas candidatas para la
fabricacin de nuevos biopesticidas, pues es conocida la resistencia contra stos
que algunas plagas terminan desarrollando.

Otras molculas son capaces de penetrar en las membranas celulares. Se investiga

en ellas la posibilidad de desarrollar antibiticos efectivos contra microorganismos
patgenos. Se han descubierto tambin algunos compuestos con poder analgsico
en pequeas cantidades (en ratones), que podran, en un futuro, formar parte del
arsenal farmacolgico.

Problema a investigar
Uno de los principales problemas con los anti venenos es que al no conocer la
composicin de todos los venenos de las diferentes especies, se utilizan venenos
generales universales para la picadura de algn organismo sin importar que tipo de
especies sea debido a que una enzima que es comn a todos los venenos, y cuya
funcin es la de facilitar la difusin del mismo, es la hialuronidasa, presente tambin
en los venenos de muchos insectos o serpientes. La principal responsable de las
lesiones cutneas necrticas en la mordedura de la reclusa es la esfingomielinasa-
D.
Todos los anti venenos producen reacciones adversas. Estas reacciones fueron
clasificadas por la Organizacin Mundial de la Salud como reacciones tardas y
reacciones tempranas, las cuales a su vez pueden ser de dos tipos: reacciones
tempranas **anafilcticas y reacciones tempranas anafilactoides.
Reacciones tardas (hipersensibilidad tipo III).
Las reacciones tardas corresponden al cuadro clnico conocido como enfermedad
del suero, una hipersensibilidad tipo III que ocurre de 7 a 15 das despus de la
administracin del anti veneno. En estas reacciones, el organismo del paciente
reconoce a las protenas heterlogas como extraas y produce una respuesta de
anticuerpos en su contra. En la fase inicial de esta respuesta hay un exceso de
antgeno, por lo que se forman complejos inmunes pequeos y solubles, que
difunden y se depositan en lugares como las membranas sinoviales y las
membranas basales de glomrulo y de endotelio.

Reacciones anafilcticas (hipersensibilidad tipo I).

Las reacciones anafilcticas o de hipersensibilidad tipo I ocurren en pacientes que
han sido tratados con anti venenos en ocasiones previas y que, como parte de su
respuesta inmunolgica contra las protenas del anti veneno, producen anticuerpos
de la clase IgE. Estos anticuerpos se unen a receptores presentes en mastocitos y
basfilos, de modo que en una posterior exposicin al anti veneno, las clulas
sensibilizadas se desgranulan y liberan diversos mediadores vasoactivos entre los
que destaca la histamina, favoreciendo la vasodilatacin y el aumento de la
permeabilidad vascular. El resultado final puede ser urticaria, hipotensin, choque,
espasmos en msculo liso, broncoconstriccin, obstruccin respiratoria, colapso
respiratorio y muerte. (1)

Reacciones anafilactoides
Son las que se observan con ms frecuencia durante la administracin de anti
venenos. Para que estas ocurran, a diferencia de las reacciones anafilcticas, no
se requiere exposicin previa al producto. Aunque las causas por las cuales ocurren
este tipo de reacciones no son del todo comprendidas, su induccin se ha
relacionado con la actividad anticomplementaria de los anti venenos y la presencia
de anticuerpos en el anti veneno contra antgenos celulares del paciente y
anticuerpos del paciente contra las protenas constituyentes del anti veneno.

Antecedentes
El veneno de Latrodectus mactans es neurotxico, lo que significa que bloquea la
transmisin de impulsos nerviosos, paralizando el sistema nervioso central y
produciendo dolores musculares intensos. Si la viuda negra es presionada contra la
piel humana, reacciona naturalmente mordiendo para su defensa.
Los efectos ms comunes de la mordedura comprenden dolor abdominal,
espasmos musculares abdominales e hipertensin. En algunos varones mordidos
se han reportado casos de priapismo, que cedieron con la administracin del
antdoto. Aunque el veneno de esta araa es peligroso, raramente llega a ser letal.
Si es correcta y puntualmente tratada, la vctima se recupera totalmente. La
mordedura de una viuda negra es distinguida por una herida doble. Los nios y los
adultos que no estn en buenas condiciones fsicas sufren ms la mordedura
pudiendo tener en estos casos consecuencias mortales.
El Sistema de Vigilancia de la Exposicin a Txicos del reporte anual de la
Asociacin Estadounidense de Centros de Control de Envenenamientos en 1997,
indic que se documentaron 2,757 picaduras por viuda negra en 66 centros de
control (Litovitz 1998). Estos centros abarcan 93% de la poblacin de Estados
Unidos con todos sus estados, excepto por Oklahoma, Arkansas, Mississippi,
Carolina del Sur, Vermont y Maine. De estas 2,757 picaduras, 783 fueron tratadas
en una clnica o centro de salud y se registr que 380 pacientes presentaron una
intoxicacin moderada o severa. No hubo muertes. No existen registros de
resultados con respecto al uso del antiveneno para L. mactans. Es muy difcil
calcular el nmero de pacientes que sufren envenenamiento significativo cada ao
y que no fueron reportados a un centro de envenenamiento.
En Mxico existen pocos datos confiables, pues apenas se inician los esfuerzos
para documentar adecuadamente la casustica de ste cada da ms importante
problema de salud. El Instituto Mexicano del Seguro Social (IMSS) es pionero en la
organizacin de estos datos y en 1998 determin separar del rubro global de
animales ponzoosos a la araa, como se hizo inicialmente con el alacrn y
despus con serpiente. Durante ese mismo ao se informaron 4,142 casos de
personas atacadas por araas que sufrieron una intoxicacin, lo que corresponde a
un 4.3 % de los pacientes atacados por algn animal ponzooso. La Secretaria de
Salud a nivel nacional acepta que aproximadamente el 11 % de las personas
agredidas por un animal ponzooso lo son por una araa.
En la Cruz Roja de Len, Guanajuato, se atendi durante ese ao a 48 pacientes
intoxicados por viuda negra, a 63 durante 1999, a 75 durante el 2000 y a 73 en el
2001. La ciudad de Guadalajara,
Jalisco, reporta un promedio anual de 500 pacientes intoxicados por la misma
causa. Con base en estas cifras es posible darse una idea sobre la magnitud de tan
importante problema de salud, pues se sabe que el registro an es bastante
deficiente. En cuanto a mortalidad, sta de cero en un total de cerca de 2000
pacientes manejados hasta el presente. Esta experiencia es muy similar a la de los
cientos de mdico que ya han tenido la fortuna de usar el antdoto.
Los antdotos tradicionales producen efectos colaterales y los dolores pueden seguir
hasta 72 horas despus. El Instituto de Biotecnologa de la UNAM en Morelos
desarroll entre 1998 y 2000, empleando la ingeniera gentica, un antiveneno
llamado Aracmyn que realiza su efecto en 15 minutos. Este antdoto ha sido
aprobado en Colombia, Mxico, Panam, Per, Venezuela y Estados Unidos.
Cabe mencionar que el Instituto Bioclon, filial del laboratorio Silanes, es dueo de
la patente del antiveneno Aracmyn, parte de cuyo desarrollo e investigacin
ocurrieron en las instalaciones del mencionado Instituto. Aracmyn, junto con otros
anti venenos faboterpicos, se exportan a frica, Centroamrica y Sudamrica. En
los Estados Unidos, la FDA ya autoriz la venta de Aracmyn, Alacramyn y
Antivipmyn.
Se han presentado protocolos para la recoleccin de veneno de araas utilizando
la estimulacin elctrica, lo que demuestra el procedimiento de la viuda negro
occidental (Viuda negra). El veneno de recogida es til para diversos anlisis aguas,
incluyendo la identificacin directa de protenas mediante espectrometra de masas,
ensayos funcionales, y la estimulacin de la expresin gnica veneno para los
estudios de transcriptmica. Esta tcnica tiene la ventaja sobre los protocolos
isofinales de veneno de homogeneizados de la glndula enteros, que no se separan
los componentes del veneno autnticos a partir de protenas celulares que no son
secretadas como parte del veneno. Los resultados representativos demuestran la
deteccin de pptidos del veneno conocido de la muestra recogida utilizando la
espectrometra de masas. El procedimiento de recogida de veneno es seguido por
un protocolo para la diseccin de las glndulas de veneno de araa, con resultados
que demuestran que esto conduce a la caracterizacin de las protenas y pptidos
del veneno-expresado en el nivel de secuencia.
La caracterizacin bioqumica de los venenos que muestran tpicamente se
componen de una amplia variedad de protenas y pptidos, que actan en gran
medida de los sistemas circulatorio y nervioso de los animales inyectados para
entregar rpidamente toxinas constituyentes. Una pequea fraccin de los animales
venenosos puede representar una amenaza para los seres humanos, en particular
las especies con distribuciones **sinantrpicas. El estudio de la composicin del
veneno y las actividades funcionales ha jugado un papel importante en la
caracterizacin funcional de los componentes celulares de vertebrados (en
particular los canales inicos neuronales) y en la elucidacin de los procesos
celulares fundamentales (por ejemplo **neurosecrecin). Por otra parte, seleccionar
pptidos del veneno tiene propiedades tiles en contextos biomdicos, incluyendo
sus usos como tratamientos para el cncer y el dolor, y se extraen para el desarrollo
de antiveneno. Los venenos tambin juegan un papel destacado en la investigacin
ecolgica y evolutiva, por tanto, la coleccin de estas secreciones peligrosas tiene
muchas utilidades.

Hiptesis
Elaborar un anti veneno especfico para la araa capulina o viuda negra
(Latrodectus mactans) para su uso en personas que hayan sido picadas por este
organismo, evitando el uso de anti venenos que produzcan daos colaterales de
efecto temprano o tardo o en los pacientes atendidos.

Trminos
Picomolar: Medida de la concentracin de un soluto en una disolucin.
Divalente: Elemento o compuesto que ha perdido dos electrones y tiene dos
protones ms que el nmero total de electrones y una carga de +2, que
simboliza el exceso de los mencionados protones.
Acetilcolina: Sustancia qumica que acta en la transmisin de los impulsos
nerviosos.
Catecolaminas: Son un grupo de sustancias que incluyen la adrenalina, la
noradrenalina y la dopamina, las cuales son sintetizadas a partir del
aminocido tirosina.
 Quelceros: Piezas bucales de los quelicerados, un subfilo de artrpodos que
incluye los arcnidos.
Postracin: Estado de abatimiento o decaimiento en que se encuentra una
persona por causa de una enfermedad o un sentimiento de gran tristeza.
Nefritis: Inflamacin de los tejidos del rin.
KDa: Kilodalton.
Anafilaxia: reaccin alrgica grave en todo el cuerpo a un qumico que se ha
convertido en alergeno.
Sinantropia: capacidad de algunas especies de flora y fauna para habitar en
ecosistemas urbanos o antropizados, adaptndose a las condiciones
ambientales.
Neurosecrecin: Secrecin, por parte de las neuronas, de hormonas o
factores de liberacin.

Modelo Lgico
Tipo de investigacin:
Investigacin explicativa: En el mbito de la Investigacin, se conoce con el nombre
de Investigacin Explicativa al proceso orientado, no slo a describir o hacer un
mero acercamiento en torno a un fenmeno o hecho especfico, sino que busca
establecer las causas que se encuentran detrs de ste. Es aquella que tiene
relacin causal; no slo persigue describir o acercarse a un problema, sino que
intenta encontrar las causas del mismo. Este trabajo entra dentro del subtipo de la
investigacin explicativa de diseos experimentales los cuales aplican experimentos
"puros", entendiendo por tales los que renen tres requisitos fundamentales:
 1) Manipulacin de una o ms variables independientes.
2) Medir el efecto de la variable independiente sobre la variable dependiente.
3) Validacin interna de la situacin experimental.
Los estudios de este tipo implican esfuerzos del investigador y una gran capacidad
de anlisis, sntesis e interpretacin. Asimismo, debe sealar las razones por las
cuales el estudio puede considerarse explicativo. Su realizacin supone el nimo de
contribuir al desarrollo del conocimiento cientfico".
Para definir este tipo de estudio, debern tenerse en cuenta las siguientes
interrogantes:
Los resultados de la investigacin se orientan a la comprobacin de hiptesis de
tercer grado?
Las hiptesis que se ha planteado estn construidas con variables que a su vez
contienen otras variables?
Las hiptesis que se ha planteado establecen la manera como una determinada
caracterstica u ocurrencia es determinada por otra?
Los resultados del trabajo pueden constituirse en un aporte al modelo terico de
la explicacin de hechos y fenmenos que puedan generalizarse a partir del
problema de investigacin?

Protocolo
1.- Preparacin del aparato electro-estimulador
1) Conecte el cable de alimentacin electro-estimulador a la salida y adjuntar
pedal externo para la entrada de seal externa.
Nota: Los cables elctricos deben estar aislados correctamente y metal expuesto
actual entrega no se deben tocar. Use guantes de ltex o nitrilo para la
proteccin. Interruptor de energa electro-estimulador debe estar en la posicin
OFF al conectar el cable de alimentacin y fijar los cables.
2) Conecte el electrodo positivo al terminal de salida de rojo en electro-
estimulador (cuando el interruptor de polaridad est en modo normal) y
conectar el electrodo negativo al terminal de salida negro. Nota: Cada
alambre electrodo debe terminar en una pinza.
3) Establecer estimulador para los siguientes ajustes iniciales recomendados:
Tensin = 7 V, Frecuencia = 1 pulsos por segundo, retardo = 0 milisegundos,
duracin = 200 milisegundos, pulsos individuales cambian = regular, y el
interruptor de modo = apagado.
 4) Prueba de salida de electrodos adjuntando pinzas de cocodrilo a voltmeter
cables de prueba positivos y negativos. Encienda el interruptor de
alimentacin estimulador y suministrar corriente con pedal de pie.
2. Preparacin de inmovilizar frceps y Otros Materiales

1) Sumerja una punta de pinzas de peso pluma en revestimiento de plstico

lquido y esperar cuatro horas para dejar secar recubrimiento. Envuelva bien
15 mm de la punta de la pa de oposicin con una sola capa de hilo de coser
de algodn, y asegurar el hilo de atar el extremo de un nudo.
Nota: El hilo se utiliza para absorber una solucin salina aplicada que promueve
la conductividad elctrica, mientras que el revestimiento de plstico proporciona
aislamiento para retardar actual.
2) Cortar la punta de la aguja hipodrmica roma con tijeras afiladas y suavizar
la apertura con papel de lija. Coloque la aguja a una trampa de residuos de
vaco (por ejemplo, matraz de filtracin al vaco) a travs de la tubera.
Nota: La aguja de distancia succionar agua y regurgitar, y servir para completar
el circuito creado por los electrodos del estimulador. La abertura de la aguja
deber ser lo suficientemente pequeo para no perjudicar la araa, pero lo
suficientemente grande como para solucin de vaco sin la obstruccin (por
ejemplo, 25 G x 1 en calibre).
3) Frceps Posicin de peso pluma horizontalmente en una posicin bien
cerrado utilizando una pinza de doble vertiente cubierto de vinilo asegurada
a una base magntica o un aparato de soporte fijado en el campo de un
microscopio de diseccin de vista, con plstico recubierto puntas de unas
pinzas en la parte superior y el hilo recubiertos pa en la parte inferior.
Nota: La abrazadera de dos puntas se mantiene en una posicin estacionaria a
la base magntica por un soporte de abrazadera (ver Lista de Materiales). Una
banda de goma puede ser fijada firmemente alrededor puntas de las pinzas de
peso pluma, al lado del soporte de pinzas, para aadir presin adicional para
mantener las pinzas de peso pluma en una posicin cerrada alrededor de la
araa una vez introducido.
4) Adjuntar pinza electrodo positivo a punta inferior frceps 'aguas arriba de la
rosca y adjuntar pinza negativa a despuntar la aguja de vaco de metal.
Circuito de prueba actual con voltmetro colocando el cable positivo en
frceps pa entre hilo y pinza y colocar el cable negativo en la aguja de vaco
embotado. Presione el pedal para asegurar que se detecte suficiente
corriente y retire los cables si se detecta corriente suficiente.
 5) Prepare varios tubos microcapilares para la recoleccin de veneno. Sostenga
un solo tubo microcapilar en un extremo con una mano enguantada y en el
otro extremo con una pinza de metal estriles, colocando el extremo frceps
en posicin horizontal sobre una llama de mechero Bunsen. Tire del
microcapillary con las pinzas de metal lejos de la llama para crear una punta
alargada, mientras mantiene el otro extremo en una posicin estacionaria.
Nota: usar gafas de proteccin como microcapilares pueden fracturarse
fcilmente.
6) Descanse microcapilares preparados en una tira de masilla de montaje en
una placa de Petri. Examinar microcapillary termina bajo un microscopio de
diseccin y crear un pequeo, la apertura biselada en el extremo
desmenuzado con pinzas de metal esterilizada.
7) Label nmero variable de tubos estriles de 0,5 ml. Aadir agua desionizada
estril a tubos estriles (por ejemplo, 5 l de agua desionizada en autoclave).
Cerrar los tubos y colocar tubos en el hielo.
Preparar la solucin salina en un vaso de precipitados y llenar un segundo vaso de
precipitados con agua tratada en autoclave

3. Inmovilizacin de la araa en el frceps

1) A su vez en CO2 tanque y transferir araa de plstico recoger vial cerrado

(ver Lista de Materiales) en la cmara de CO2 utilizando pinzas metlicas
largas.
Nota: las araas viuda negra tienen veneno peligroso; Siempre use guantes durante
este protocolo.
2) Mantenga araa en la cmara durante 5-10 minutos o hasta que anestesiado
y ya no se mueve cuando pinch suavemente con unas pinzas largas. Use
la pipeta de transferencia para mojar hilo en pinzas con solucin salina.
Nota: Para obtener instrucciones sobre el CO 2 parmetros de anestesia para las
viudas negras, consulte Spagna y Moore 19.
3) Recuperar araa anestesiado de CO 2cmara por recogerlo por sus patas
anteriores utilizando pinzas de diseccin roma y las manos enguantadas.
Mueva araa anestesiado a peso pluma aparato frceps. Puntas separadas
de frceps de peso pluma cerrados y lugar cefalotrax de la araa en entre
los dientes y permitir que los dientes se cierren cerrada para garantizar la
araa se mantiene firmemente en su lugar, pero no est siendo aplastado.
Asegrese de que la araa se coloca lado dorso del caparazn hacia abajo
(ver Foelix 20 de gua a la anatoma de la araa), que descansa sobre hilo
 recubierto de pa, y parte ventral del caparazn de cara al revestimiento de
plstico, mientras que el electrodo positivo permanece unido a la punta
inferior. Trabaje con rapidez al manipular araa.
4) Ajuste la diseccin de magnificacin del microscopio, el enfoque, y la fuente
de luz hasta quelceros de la araa y colmillos son claramente visibles.

4. Coleccin de Veneno

1) Encienda el vaco y spray quelceros araa con una solucin de agua con
una segunda punta roma de la jeringa nEedle. Succionar el agua con la aguja
de vaco para eliminar las impurezas.
2) Toque la aguja de vaco con electrodo negativo unido a tribuna araa y
entregar impulsos con pedal de pie una o ms veces. Vaco regurgitar de
inmediato si es necesario.
Nota: tribuna araa se encuentra dentro de la boca posterior a queliceras en la
superficie dorsal entre quelceros y enditos (ver Foelix 20 para la anatoma detallada
de araa). Nota: Con cada impulso, el contrato de las piernas de la araa, y el
veneno ser visible en forma de gotas claras que salen de los colmillos.
3) Recoger las gotitas de veneno con punta microcapilar y punta capilar de
transferencia en el tubo de 0.5 ml con agua o solucin tampn (solucin ser
absorbido por capilaridad).
Nota: evitar perforar araa con capilar que puede conducir a la contaminacin de la
hemolinfa y la muerte. Tambin evitar la contaminacin de los capilares con seda y
cola de hileras.
4) Adjuntar transferencia jeringa con adaptador de tubo para microcapilar (en el
extremo opuesto a la punta de la coleccin) y dsolucin de veneno ispense
de nuevo en el tubo. Ponga el tubo en hielo.
Nota: Deshgase de los capilares de residuos en un contenedor de objetos
punzantes cerca.
5) Coloque plstico recoger abierto el vial, junto con su tapa, cerca de la araa.
Sujete cuidadosamente las patas de araa con pinzas de diseccin roma a
cabo en una mano y pluma cuidadosamente abierta frceps dientes con la
otra mano, araa cayendo en la recogida de vial con unas pinzas romas y
rpidamente cierre la tapa. Continuar con los tubos que contienen veneno de
araa-siguiente y almacenar en -80 C congelador cuando haya terminado.
Nota: seguir ejerciendo cuidado al mover la araa de las pinzas de nuevo en el vial.
Asegrese de que el vial colector y la tapa es cercana a la araa para su rpida
transferencia y usan guantes.

5. Disecciones de la Glndula de Veneno

1) De dos a tres das despus de la recoleccin de veneno, anestesiar araa en

la cmara de CO2 (consulte el paso 3.1). Rellene portador de nitrgeno
lquido y el lugar junto al microscopio de diseccin.
Nota: Cuando se trabaje con nitrgeno lquido, usar proteccin ocular y guantes de
uso criognicos.
2) rea de diseccin limpia y pinzas de diseccin con una solucin que elimina
RNasa y ADN contaminacin. Llene una pequea placa de Petri puesto bajo
microscopio de diseccin con la diseccin de tampn (por ejemplo, citrato
salino-sdico 1x (SSC) de amortiguacin).
3) Araa de transferencia de CO 2 cmara de placa de Petri y el uso de frceps
para separar rpidamente el cefalotrax del abdomen.
4) Mantenga el cefalotrax bajo el microscopio de diseccin con una pinza y la
posicin de los quelceros en el campo de vista. Utilice los afilados extremos
de un segundo par de pinzas para cortar la cutcula de unirse a la caparazn
de las caras laterales de los quelceros. Lateralmente captar los quelceros
utilizando el segundo par de pinzas, y tirar suavemente hacia atrs y hacia
delante hasta que las glndulas de veneno se sacan.
5) Glndulas separadas de los quelceros (o salir unidos a queliceras si se
desea) y la transferencia a un tubo de 0,5 ml cyrosafe. Coloque closed tubo
en nitrgeno lquido.
Nota: cada diseccin no debe tardar ms de 15 min.
6) Repita la diseccin con araas adicionales hasta que termine. Tubos de
transferencia de nitrgeno lquido en -80 C congelador.