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REPUBLIQUE DU CAMEROUN REPUBLIC OF CAMEROUN

MINISTERE DE LENSEIGNEMENT SUPERIEUR MINISTRY OF HIGHER EDUCATION

UNIVERSITE DE NGAOUNDERE UNIVERSITY OF NGAOUNDERE


CAMEROUNTMENT OF BIOMEDICAL
FACULTE DES SCIENCES FACULTY OF SCIENCES

DEPARTEMENT DES SCIENCES BIOMEDICALES DEPARTMENT OF BIOMEDICAL SCIENCES

TRAVAIL PERSONNEL DE LETUDIANT

(TPE)

ELISA DIRECT POUR 5 PATIENTS DE VIH

Rdig par :

MOULU Jean-Patrick 08N082FS


MUNSHILI NJIFON Hermann Landry 08M290FS
NENBA SAMBO Jean Jacques 08N112FS
OBAMA Joseph Willy Brice 08N056FS
SIRA Jackson 08N054FS
SITTY EGUESSA Pierre Claver 07L083FS

Enseignant : Pr. NGAKOU Albert

Anne acadmique 2013-2014


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PLAN

IINTRODUCTION ...................................................................................................................................... 4
I- ELISA : Dosage immunoenzymatique dun antigne ....................................................................... 5
1- PRINCIPE: ..................................................................................................................................... 5
II- SERODIAGNOSTIC DE LINFECTION A HIV :...................................................................................... 6
1- Test ELISA : .................................................................................................................................. 7
III- Dpistage de cinq individus : cas du VIH ................................................................................. 10
CONCLUSION ......................................................................................................................................... 11
Rfrence bibliographique : .................................................................................................................. 12

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IINTRODUCTION

ELISA-direct (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) est une mthode de diagnostic


permettant la dtection de lantigne dans un chantillon. La bioinformatique quant elle, est
le traitement des donnes biologiques en utilisant les mthodes informatiques et
mathmatiques. Elle est aussi lensemble des mthodes, des logiciels en ligne permettant de
grer, danalyser et de manipuler les donnes biologiques. Cette discipline est venue
rvolutionner et rendre plus collaboratif lapplication et lapprciation des mthodes
techniques et informatiques. Les techniques de diagnostique aux laboratoires se sont
confrontes de nombreuses limites do son insertion. Nous allons dans un premier temps
dcrire lapplication technique dElisa direct pour cinq patients VIH et par la suite ressortir
lutilisation de la bioinformatique dans la praticabilit de cette mthode.

But :

Montrer la place de la bioinformatique dans le diagnostic du VIH par la mthode Elisa direct.

Objectif :

prsenter limplication de la bioinformatique dans le processus du diagnostic du VIH


par la mthode Elisa direct.
Montrer limportance de la bioinformatique ;

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I- ELISA : Dosage immunoenzymatique dun antigne

L'immunoenzymologie est vraisemblablement la plus sensible et la plus polyvalente


des techniques immunologiques. Deux principales configurations sy dtachent.

Dans la premire, des antignes du germe recouvrant le fond des puits sont mis en
contact avec des dilutions des srums. La dtection des complexes antigne-anticorps se fait
par adjonction d'un anticorps coupl une enzyme approprie. En utilisant des conjugus
enzymatiques, on dtecte les complexe immun prcdemment mis en place.

ELISA Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay est une technique, principalement


utilise en immunologie, mais pas uniquement, afin de dtecter la prsence d'un anticorps ou
d'un antigne dans un chantillon. On en distingue 2 grandes techniques en faisant appel un
principe immunologique bas sur lutilisation dun ou de deux anticorps. Dont le premier,
tant spcifique un antigne donn, tandis que l'autre destin ragir aux complexes
immuns (antigne-anticorps) et ensuite coupl le tout une enzyme.

Le second anticorps est le plus souvent responsable du nom de la technique. On peut


aussi causer l'mission d'un signal par un substrat chromogne ou fluorogne.

ELISA direct repose simplement sur la formation du complexe Ac-Ag aprs fixation
dune quantit ou de la totalit de lantigne prsent dans lchantillon doser sur la paroi
dun tube ou dune plaque de polystyrne ncessitant une tape de sparation ; elle sera donc
toujours ralise en phase htrogne.

Ces supports physiques possdent une affinit leve pour les protines. Ces protines inertes
adsorbes sur le support noccupent quune petite fraction de la surface afin dviter des
fixations non spcifiques danticorps et/ou dantignes (albumine, collagnes).

1- PRINCIPE:

Consiste fixer sur un support lantigne prsent dans lchantillon doser, puis den rvler
la molcule par soit un anticorps marqu ou soit un anticorps spcifique lui-mme rvl par
un anticorps anti-Ac marqu :

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Ac marqu :

Fig1 : dtection dAg avec utilisation des Ac marqus

Ou par l'Ac spcifique lui-mme rvl par un Ac anti-Ac marqu :

Fig2 : dtection dAg avec utilisation de deux Ac marqus

II- SERODIAGNOSTIC DE LINFECTION A HIV :

La srologie sera utile pour le diagnostic la phase aigu lorsque lvolution du titre
des Ac est suffisamment rapide. Elle sera utile au diagnostic rtrospectif des primo-infections
(sroconversion) et dans le diagnostic des viroses chroniques telles que HIV, CMV

Demander en premiers intention et faisant partis des tests utilisant les proprits
gnrales des Ac lis un Ag. Le test ELISA est la mthode la plus rpandue actuellement du
fait de sa sensibilit leve mme chez les enfants (des mres sropositives) et sa capacit de
distinction des classes dimmunoglobulines et la capture des IgM intervenant lors de la 1re
rponse immunitaire, empchant ainsi :

- lapparition faux positifs dus aux Facteurs Rhumatodes (FR) et


- de faux ngatifs dus lencombrement des IgG produits en grande quantit lors de
la 2e rponse immunitaire.

Elle peut tre automatisable ou semi-automatisable et de ce fait applicable en utilisant la Bio-


informatique.

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Fig3 : ELISA en sandwich

L'antigne doit possder deux pitopes diffrents; il est pris en "sandwich" entre deux
anticorps.

1- Test ELISA :

L'ELISA est une variante moins commune (en clinique) de cette technique, utilise
afin de dtecter un chantillon d'antigne dans le srum ou tout autre chantillon. Cette
technique est par contre d'un usage trs courant en recherche.

Le procd se droule, dans ces grandes lignes, comme suit :

1. Recouvrement et prparation dans les puits des anticorps dit de capture :

En gnral les plaques de tests ELISA comprennent au total 96 puits organiss comme suit :

- 3 puits servant vrifier la qualit des tampons et des anticorps. Le premier puits
sert de blanc (blank) afin dtablir la valeur de rfrence pour la lecture des
densits optiques. Aucune suspension bactrienne ou extrait de plante nest
dpose dans ces puits.
- 3 puits pour le tmoin ngatif : Suspension autre que celle de lespce recherche.
- 3 puits pour le tmoin positif : Suspension dune souche type de lespce virale
recherche ayant une concentration connue.
- chantillons : Suspension destin recueillir une quantit ncessaire la
ralisation du test. Il est important de prparer la solution danticorps dite de
capture juste avant son utilisation. Dposer 100 l de lAc de capture dans chacun
des puits. La concentration lanticorps de capture dposer dans les puits doit tenir
compte des spcifications de la compagnie fournissant les Ac (ex. : 1,0 ug/mL).
La plaque de polystyrne doit tre recouverte dun scellant afin dviter
lvaporation.

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- Selon la bactrie identifier ou le virus recherch, lincubation des plaques est de
4 heures la temprature de la pice ou 4 heures 37C ou toute la nuit 4C.
- Aprs la priode dincubation, la plaque est lave 3 fois avec un tampon de
lavage. Il est des plus importants de bien asscher la plaque en la frappant
vigoureusement sur un papier absorbant. Un rsidu de tampons et danticorps
demeurant dans les puits peut induire une fausse raction positive.

2. Addition de lantigne :

Il se fait toujours par lajout dans les puits de la suspension virale prpare pralablement. Au
mme titre que les tmoins ngatif et positif prpars juste avant leur utilisation ou ressortir a
temprature ambiante et passer lincubation. Aprs incubation, la plaque est lave 3 fois
avec un tampon de lavage.

3. Addition de lAc li lenzyme :

Lanticorps li lenzyme est prpar que 10 15 minutes avant son utilisation. Une quantit
de 100 l de lAc li lenzyme est dpose dans chacun des puits. Il est important de tenir
compte des spcifications de la compagnie fournissant les Ac en regard de la concentration
de lAc conjugu.

La plaque de polystyrne doit tre recouverte dun scellant afin dviter lvaporation.
Lincubation est de 2 heures la temprature de la pice ou 37C selon les produits
pathologiques et aprs laver plusieurs fois au tampon de lavage. Il est toujours des plus
importants de bien asscher la plaque en la frappant vigoureusement sur un papier absorbant.
Un rsidu de tampons et danticorps demeurant dans les puits peut induire une fausse raction
positive.

4. Addition du substrat de lenzyme :

- Peroxydase = OPD (ortho-phnylne diamine)


- Phosphatase = P-nitrophnyl phosphate

Le substrat de lenzyme est prpar juste avant son utilisation. Le substrat peut se
conserver seulement quelques heures la temprature de la pice ainsi qu la noirceur car il
est photosensible. Une quantit de 100 l de la solution substrat, ayant une concentration de

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1,5 mg/ml de P-nitrophnyl phosphate et de 1,0 mg/ml de OPD (ortho-phnylne diamine),
est dpose dans chacun des puits.

La plaque doit tre recouverte dun papier daluminium ou mise dans une chambre noire
puisque lincubation doit se faire la noirceur. Lincubation se fait la temprature de la
pice pour une dure de 20 30minutes.

5. Lecture :

Le test ELISA permet dobtenir un rsultat quantitatif qui se visualise par la prsence dune
coloration dans les puits o lorganisme pathogne est prsent. Plus la coloration est intense
plus grande est la quantit de la particule virale. La prsence dune coloration dans un puits
indique que lAc li lenzyme sest fix lAg, lequel stait fix antrieurement lAc de
capture. En prsence de la phosphatase, le substrat P-nitrophnyl phosphate est hydrolys en
P-nitrophnol, lequel est un compos jaune.

Quant la peroxydase, cet enzyme dgrade le peroxyde (H2O2) et par la suite il y a une
oxydation du substrat ortho-phnylne diamine (OPD) et formation dun compos orang
(OPD) 2H2).

Lutilisation dun lecteur de densit optique permet lobtention dun rsultat quantitatif.
Pour la lecture de la densit optique les filtres utiliss sont de 405 nm avec le P-nitrophnyl
phosphate et de 490 nm avec lortho-phnylne Diamine.

Le premier puits est utilis comme <blanc>. Ce puits contient tous les tampons et les Ac.
Lutilisation dun anticorps li la peroxydase en prsence du substrat ortho-phnylne
diamine ncessite larrt de la raction en ajoutant 50 l (1 gtte) dacide sulfurique. Une
premire lecture est ralise avant laddition de lacide sulfurique. la suite de laddition de
lacide sulfurique une seconde lecture est faite.

Les valeurs de la densit optique des puits contenant les solutions tampons et les tmoins
ngatif et positif doivent tre vrifies rigoureusement pour sassurer quelles correspondent
lintensit de la coloration des puits.

Lexamen visuel de la coloration des puits aide linterprtation des rsultats :


Phosphatase : jaune avec le substrat P-nitrophnyl phosphate

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Peroxydase : jaune orange avec le substrat ortho-phnylne diamine (OPD).

III- Dpistage de cinq individus : cas du VIH


Le principe gnral consiste tablir une courbe talon avec des solutions contenant des
concentrations connues d'Ag. Le rsultat final sera donc obtenu selon la faction

DO standard ou chantillon
Concentration de lchantillon = x100
DO talon

Deux principes de lecture des rsultats existent :

Le rsultat est obtenu en comparant la couleur de l'essai celle d'un tmoin de


concentration connue. Cette apprciation est visuelle, elle se fait sur un fond blanc. Si l'essai
est plus color que le tmoin, il contient moins dAg HIV que la valeur indicative du tmoin.
Pour plus de sret, l'apprciation peut se faire l'aide d'un lecteur de microplaques.
La procdure est sensiblement la mme mais un seul talon 1 ppm est fourni (tmoin
2ppm optionnel), la couleur obtenue pour un chantillon positif varie du bleu au rose et la
lecture photomtrique se fait 650 nm (donnes non contractuelles).

Aprs lecture et quantification de nos cinq (05) chantillons, il ressort que :


- Echantillon 1 = srologie positive
- Echantillon 2 = srologie ngative
- Echantillon 3 = rsultat positive
- Echantillon 4 = srologie positive
- Echantillon 5 = srologie indtermin
NB : les cas indtermin sont confirms par western blot. Ce test est bien plus spcifique que
lELISA.

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CONCLUSION
Au terme de ce travail dont il tait question de prsenter la mthode de diagnostic
ELISA-direct chez 5 patients VIH en montrant limplication de la bioinformatique, il en
ressort que cette discipline occupe une place importante notamment dans linterprtation et la
lecture des rsultats qui se fait base dun spectrophotomtre lecteur de microplaque qui est
programm pour apprcier lintensit des colorations et permet en mme temps de les
quantifier. Il faut galement noter quil existe des automates dELISA qui permettent de faire
tout le travail automatiquement.

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Rfrence bibliographique :

Engvall E, Perlman P. "Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative


assay of immunoglobulin G", Immunochemistry, 1971 Sep;8(9):871-4 PMID: 5135623
Goldsby, R.A., Kindt, T.J., Osborne, B.A. & Kuby, J. Enzyme-Linked Immunosorbent
Assay. In: Immunology, 5th ed.(2003), pp. 148-150. W. H. Freeman, New York.
rapport de stage au cpcag (Fab, Sira, Fadi, Aicha), juillet 2011
Introduction la bioinformatique INFO-F-208, 2013
Mthodes physiques de sparation et d'analyse et mthodes de dosage des biomolcules
Engvall E, Perlman P. "Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of
immunoglobulin G", Immunochemistry, 1971 Sep;8(9):871-4 PMID: 5135623
Goldsby, R.A., Kindt, T.J., Osborne, B.A. & Kuby, J. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay.
In: Immunology, 5th ed.(2003), pp. 148-150. W. H. Freeman, New York.
guide-utilisation-kits-elisa
Guide d'utilisation des kits immunoenzymatiques format microplaques (kits ELISA)

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