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Escuela Profesional de Ingeniera Agroindustrial

OBTENCION Y EVALUACION DE BIOMASA Lactobacillus plantarum A PARTIR


DE SUSTRATOS VEGETALES

INTEGRANTES:

Liz Mary Zelay Alanoca Chavez


Gladys Zegarra Mandamiento
Marisol Palma
Alondra Espinosa
Andrea Velarde

CICLO: VII
OBTENCION DE BIOMASA DE Lactobacillus plantarum A PARTIR DE
SUSTRATOS VEGETALES
ANTECEDENTES DE LA INVESTIGACION

El presente trabajo corresponde a Henry Jurado-Gmez , Cristina Ramrez , Diana


Aguirre (2013) quienes realizaron Cintica de fermentacin de Lactobacillus
plantarum en un medio de cultivo enriquecido como potencial probitico y tuvo
como objetivo fue determinar la cintica de crecimiento de Lactobacillus plantarum en
medio de cultivo enriquecido como potencial probitico , Las cepas de L. plantarum 1
fueron probadas con el medio comercial MRS; y con 10 g/L azcar blanco, 15 g/L leche
de soya, 150 g/L suero de leche, 15 g/L salvado de trigo (Medio 4). Las variables
evaluadas durante la cintica fueron: determinacin de pH, viabilidad en placa (UFC/ml),
determinacin de azcar total, determinacin de la produccin de cidos orgnicos, y
evaluacin de la produccin de biomasa.
En el trabajo se demuestra que los mejores resultados para viabilidad en el Medio 4
(M4) fueron para L. plantarum 1 H1 y L. plantarum 1 H2 con valores de 31012 y 61011
UFC/ml a las 12 horas de efectuada la cintica. La evolucin de pH final fue de
4,21 4,07 respectivamente para cada cepa. El azcar total y la produccin de cido
lctico en el Medio 4 para L. plantarum 1 H1 present valores de 8, 90 / 17,66 /
respectivamente. Para L. plantarum 1 H2 present valores 10,8 / 13,16 /
respectivamente.
Un primer trabajo corresponde a (Henry Jurado Gmez, Cristina Ramirez, Diana
Aguirre, 2013) quienes realizaron la propuesta de la cintica de fermentacin de
Lactobacillus platarum en un medio de cultivo enriquecido como potencial probitico
cuyo objetivo es determinar la cinemtica de crecimiento utilizando fuentes de carbono
para maximizar la obtencin de biomasa, con este trabajo se puede afianzar que
algunas fuentes de carbono son sustratos muy efectivos que elevan la produccin de
biomasa a partir de lactobacillus plantarum.

En un segundo trabajo corresponde a (Mara Elizabeth Contreras Pinzon, Rosa


Maradlminguez Espinoza Araceli Gonzales Burgos , 2007) este trabajo tiene como
objetivo estudiar el bioproceso para la proliferacin de cepas probiticas de
Lactobacillus plantarum utilizando aloe vera como sustrato, evaluando los niveles de
produccin de cidos orgnicos, principalmente cido lctico en presencia de dos
fuentes de carbono a diferentes concentraciones. Con este trabajo se pudo determinar
cules seran los sustratos vegetales que se puede utilizar para mejorar la produccin
de biomasa y principalmente reducir costos en una produccin a gran escala. Este
trabajo determino como resultado, con las mejores concentraciones se puede llegar a
obtener hasta 10112 UFC/mL. Esto nos sirve como punto de inicio para comprobar y
determinar las caractersticas de crecimiento de lactobacillus plantarum

El trabajo corresponde a Gonzlez, B. A.; Domnguez-Espinosa, R.; Alcocer, B. R. de la


facultad de Ingeniera Qumica, Universidad Autnoma de Yucatn. Quienes realizaron
la investigacin Aloe vera como sustrato para el crecimiento de Lactobacillus plantarum
y L. casei en este estudi se determin el efecto del uso de jugo de Aloe vera (sbila)
como sustrato principal de fermentacin para obtener cultivos de alta concentracin de
clulas viables de dos bacterias con actividad probitica: Lactobacillus plantarum
(NCIMB 11718) y Lactobacillus casei (NRRL -1445). Se determin la velocidad
especfica de crecimiento () de cada microorganismo en medios con diferentes
concentraciones de Aloe vera comparndolos con aquellos obtenidos en cultivos
crecidos en medio estndar para cultivos lcticos (MRS). Utilizando el jugo de sbila al
100%, se obtuvieron altas cuentas viables para ambas cepas (1x109 y 1 x1011 UFC/mL
para L. plantarum y L. casei respectivamente) siendo la cintica de crecimiento de
ambos probiticos muy similar a la obtenida en medio estndar (= 2,85 h-1 en Aloe
vera y 3,16 h-1 en MRS para L. plantarum y = 2,71 h-1 y 2,89 h-1 para L. casei).

INTRODUCCIN

En los estudios recientes se est dando mayor importancia a los sustratos vegetales
para la obtencin de biomasa, las mismas que son un medio para combatir las diferentes
enfermedades gastrointestinales ya que pueden ser una fuente de ingreso
microorganismos probioticos.

Los lactobacillus tienen un metabolismo fermentativo, en crecimiento se da en un pH


DE 4.5 -5,8 son exigentes en cuanto aminocidos, carbohidratos, etc.; las caractersticas
que presenta esta bacteria hace se utilice los sustratos vegetales sean apropiados para
proliferar el crecimiento.

CAPTULO I: PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

1.1 Descripcin del problema

En la actualidad no se conoce una formulacin exacta para la produccin de


Lactobacillus plantarum como inoculo en la aceituna en la regin de Tacna para
obtener biomasa de manera econmica y rentable para la produccin de inoculo
sabiendo que los Lactobacillus plantarum tienen un metabolismo fermentativo, son
principalmente aerotolerantes.
Hoy en da no se han encontrado estudios sobre los microorganismos que
intervienen en la produccin de biomasa.
Debido a la gran demanda de combustibles fsiles que existe actualmente, el ser
humano busca una fuente de energa alterna para satisfacer sus necesidades
bsicas, para lo cual ha recurrido a las fuentes alternas de energas renovables
dentro de los cuales se encuentra la biomasa.
Cul es la diferencia en la produccin de biomasa Lactobacillus plantarum
utilizando diferentes sustratos vegetales?
Cul es la cantidad mxima de biomasa que se puede obtener, utilizando
sustratos vegetales?
Cul es la velocidad de crecimiento de Lactobacillus plantarum, en el
sustrato de mayor produccin de biomasa?

1.2 Justificacin e importancia


La produccin de Lactobacilllus plantarum utilizando medios sintticos no es
rentable para la produccin de inculos microbianos y por tal motivo se evaluaran
diferentes sustratos vegetales que sean una alternativa de bajo costo para la
produccin de inoculo. (Precio de MRS 600x 500gr) para un litro 22 g/l 1013 clulas
/ml nos estara costando 22 soles y se quiere obtener una biomasa rentable.

Se han encontrado informacin o antecedentes que indican que estos compuestos


pueden producir Lactobacillus plantarum
Se utilizarn sustratos que sean fciles de obtener como el aloe de vera que es fcil
de produccin en la zona, el suero de la leche entre otros componentes para el
crecimiento de Lactobacillus plantarum.
Para el crecimiento de Lactobacillus se emplean medios de cultivo estndar que
utilizados a nivel industrial poseen un elevado costo. Debido a esto se hace
necesario explorar alternativas de otras materias primas, como es el caso de
sustratos vegetales y adems el aprovechamiento de subproductos de la industria
alimentaria
Se evaluarn las cantidades de produccin de biomasa a partir de los sustratos
vegetales, se seleccionarn y optimizarn en la produccin de biomasa.
En este estudio se utiliza componentes adicionales para determinar si esta tiene
influencia sobre la cantidad de biomasa producida.
1.3 Objetivos

1.3.1 Objetivo general


Obtener un medio de cultivo alternativo utilizando sustratos vegetales para
la produccin de biomasa de Lactobacillus plantarum

1.3.2 Objetivos especficos

Determinar la cantidad de biomasa de Lactobacillus plantarum obtenida en


diferentes sustratos vegetales.
Evaluar la velocidad de crecimiento en el sustrato con mayor produccin de
biomasa de Lactobacillus plantarum. Curva de crecimiento, hacer conteos
aprox. Cada hora por 48 horas (matemticamente).
1.4 Hiptesis
La cantidad en g/L en biomasa son:
Segn un artculo (biomasa microbiana en el suelo sometido a diferentes
manejos de labranza y rotacin) (Marysol Alvear Z M. P.-C.-S., 2006), la cantidad
de biomasa es (r=0.86**) con la frmula:

Si existen diferencias significativas entre los diferentes sustratos


vegetales.
Cantidad mxima de biomasa que se obtendr es 1012
Velocidad de crecimiento:

CAPTULO II: MARCO TERICO


En la actualidad la desnutricin y las enfermedades gastrointestinales son dos
de las principales causas de muerte infantil en el mundo, recientemente la
Organizacin Mundial de la Salud public que cerca del 22 % de las defunciones
anuales de nios menores de cinco aos son causadas por diarrea crnica y
enfermedades gastrointestinales particularmente en pases en vas de desarrollo
(Balam, Ochoa, & Sonda, 2002)
La medicina tradicional y moderna hace del uso de alimentos fermentados una
alternativa para la prevencin y tratamiento de estos y otros padecimientos ya
que el consumo de alimentos de este tipo proporciona una ruta de entrada comn
para agentes biolgicos que conforman la flora intestinal benfica, este tipo de
organismos son conocidos como agentes probiticos (Fitzgerald & Murray, 2006)
2.1 Aloe Vera
Tiene varias propiedades fundamentales que han sido estudiadas. Funciona
como un antiinflamatorio, un fungicida, un antibitico y un agente regenerativo.
Contiene elevados niveles de enzimas, esto lo hace un cultivo de gran valor, ya
que las enzimas ayudan al cuerpo a absorber los alimentos bsicos y a la vez
los purifica (Lawrence, 1998)
Debido a sus propiedades nutricionales y composicin qumica el Aloe vera tiene
un alto potencial como agente promotor del desarrollo de bacterias probiticas
(Contreras-Pinzn, 2003) Por tal motivo, para esta investigacin se seleccion
como fuente de carbono al jugo de la planta de sbila (Aloe vera), pues es un
producto regional de amplio consumo y cuya industrializacin como alimento ha
sido limitada. (Batista, 2002)
2.2 El gnero Lactobacillus
Es altamente apreciado por la capacidad que tienen las bacterias lcticas de
fermentar diversas fuentes de carbono simples y producir cido lctico. Muchas
de las bacterias del gnero Lactobacillus pueden sobrevivir las condiciones de
acidez y alcalinidad as como a las enzimas del tracto digestivo en diversos
animales, incluyendo al hombre (Boyle, 2006). Cuando las bacterias lcticas
llegan a los intestinos, empiezan a producir cido lctico, el cual acidifica la
regin intestinal haciendo que la flora patgena disminuya. Esta caracterstica
confiere a los lactobacilos propiedades probiticas.
2.3 El suero de leche lquido

Es un subproducto que durante muchos aos ha sido considerado como un


desecho; actual- mente es utilizado por sus mltiples nutrientes y propiedades
funcionales (Marshall, 2004) (Madureira, A. R., Pereira, C., Gomez, A., Pintado, M. y
Malcata, F, 2007). Este subproducto est compuesto por agua, lactosa, protenas,
minerales (calcio, fsforo, magnesio) y grasa. Las protenas son indiscutiblemente
el componente de mayor importancia del suero, sus propiedades y aplicaciones
son de gran inters en diversas reas. El espectro de beneficios confirmados y el
potencial que presenta la protena del suero para la salud cubre todo el ciclo de
la vida, desde la nutricin infantil hasta productos para ancianos. Asimismo, est
comprobado que la protena del suero es un ingrediente alimenticio dinmico,
capaz de des- empear un papel fundamental en reas de la salud tan diversas
como integridad y motilidad intestinal, funcionamiento y fortalecimiento del
sistema inmunolgico, cncer, sistema cardiovascular, mejora del desempeo
cardiorrespiratorio y participacin en el incremento del rendimiento deportivo
(Rhne-Poulenc, 1998) (Walzem, R. L., Dillard, C. J. y German, J. B., 2002)
(Mendes da Silva, 2011). Existe un inters creciente por la industria de lcteos y
otros alimentos e incluso industrias farmacuticas, por disear y formular pro-
ductos que incorporen componentes bioactivos especficos de protenas de suero
de leche (Mendes da Silva, 2011)

En trminos promedio, el suero de leche contiene ms de la mitad de los slidos


presentes en la leche original, incluyen- do alrededor del 20% de las protenas
(lactoalbminas y lactoglobulinas), la mayor parte de la lactosa, minerales (calcio,
fsforo, sodio y magnesio) y vitaminas hidrosolubles (tiamina, cido pantotnico,
riboflavina, piridoxina, cido nicotnico, cobalamina y cido ascrbico) (Londoo,
2006) (Guerrero, 2011)

Tabla 1. Composicin de los sueros de leche dulce y cido.

Componente Suero de leche Suero de


(g/L) dulce leche cido
Slidos 63.0 - 70.0 63.0 - 70.0
totales
Lactosa 46.0 - 52.0 44.0 - 46.0
Grasa 0.0 - 5.0 0.0 - 5.0
Protena 6.0 - 10.0 6.0 - 8.0
Calcio 0.4 - 0.6 1.2 - 1.6
Fsforo 0.4 - 0.7 0.5 - 0.8
Potasio 1.4 - 1.6 1.4 - 1.6
Cloruros 2.0 - 2.2 2.0 - 2.2

Adaptado de (Panesar, 2007) (Callejas, 2012)


2.4 Los biorreactores

De tanque agitado para la experimentacin surgieron (hace ms de medio siglo)


con el propsito de lidiar con muchas de estas limitaciones y se han ido
perfeccionando en busca del control ms preciso de los ambientes de desarrollo de
cultivos vivos, establecindose como un estndar en la industria biotecnolgica. El
empleo de sensores en el interior del vaso, conectados a dispositivos de control
automtico, permite mantener los valores de temperatura, pH, oxgeno disuelto y
otros parmetros de inters, dentro de los lmites estrechos necesarios para el xito
de las fermentaciones. Por otro lado, el empleo de sistemas eficientes de aireacin
y agitacin garantiza niveles ptimos en la transferencia de oxgeno y en el
mezclado. Dentro de estos, los biorreactores de pequea escala han resultado
vitales en procesos de escalado y desescalado, optimizacin de cepas,
caracterizacin y desarrollo de procesos. (MATTHEWS.)

CAPTULO III: MARCO METODOLGCO


3.1 Tipo y Nivel de la investigacin
Experimental
3.2 Poblacin y/o muestra de estudio
Sustratos vegetales
3.3 Operacionalizacin de variables

Variable Definicin conceptual

Dependiente Cantidad de biomasa


Celulas/ ml

Independiente Formulacin del medio de cultivo o


Sustratos vegetales

3.4 Tcnicas e instrumentos para la recoleccin de datos


MATERIALES
Placas Petri
Aza de Drigalski
Mechero
Matraz 250 ml
Algodn
Alcohol
Tubos de ensayo

REACTIVOS
Citrato de amonio
Caldo MRS

INSUMOS
Miel
Sacarosa
Leche de soja
Salvado de Trigo
Suero de leche
Aloe vera
EQUIPOS
Autoclave
Incubadora
Biorreactor
Microscopio
Cmara de biodawer.

3.5 Procesamiento y anlisis de datos


El presente estudio se realizar en el laboratorio de Microbiologa de la Universidad
Privada de Tacna.
Reactivar las cepas en Agar MRS
Pasar 1 mL de la suspensin a los tubos para preparar las respectivas diluciones, de
acuerdo a lo que se requiera realizar.
De cada dilucin se procede a la purificacin sembrando Lactobacillus plantarum en el
medio respectivo para la cepa y luego se procede a la incubacin.
Una vez realizada la incubacin, se procede a registrar las caractersticas de la cepa
(Morfologa, fisiologa) en un informe realizado en UNIVERSIDAD CENTRAL DEL
ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS de curso de biotecnologa (Vsquez)
Construccin del biorreactor.
Los materiales de construccin posibles, segn las especificaciones descritas son
Para el cuerpo del reactor:
Acero inoxidable
Frascos de vidrio
Manguera de silicona
Pegamento
Motor de pecera
Filtro de 0.2 micras
Tcnica:
El sistema consiste de dos recipientes de vidrio autoclavable translcidos, mangueras
de silicona esterilizables en autoclave, filtro de aire de 0.2 micras, motor de pecera. Un
frasco es el vaso de cultivo para los explantes y el otro, el recipiente para el medio de
cultivo.
Ambos frascos se comunican a travs de mangueras de silicona. Las condiciones de
esterilidad se logran mediante el empleo de filtros. Las bateras de cultivo (formadas por
un frasco para el cultivo de los explantes y un frasco para el almacenamiento de medio)
La distribucin de aire desde el compresor a los frascos se realiza a travs de una
conexin de PVC.
Preparacin del pre-inoculo
Se centrifugar para saber la concentracin para ingresar 107 clulas/ml.
Se trabajar con aireacin 0.5 vvm y luego encubar a 35C por 72 horas, despus se
realizar el recuento en cmara de Neubawer para determinar la concentracin y la
cantidad de biomasa obtenida.
Para el aislamiento de Lactobacillus
La fuente de obtencin de bacterias de Lactobacillus ser a partir de la salmuera. Se
diluyeran en agua peptonada al 0.1%, al menos 5 diluciones y de las cuales se esperar
que salgan colonias y se miraran en el microscopio, a estas colonias aisladas se les
realizara las pruebas de la catalasa, coloracin de Gram y produccin de esporas.
Metodologa para hacer el recuento en la cmara de newbawer.
PASO 1. Preparacin de la muestra
Dependiendo del tipo de muestra a medir, se ha de habr de preparar una muestra con
una concentracin apta para su recuento.
Tpicamente, el rango de concentraciones que permite contar el hematocitmetro est
entre 250.000 clulas y 2,5 millones de clulas por ml.
Intentaremos que la muestra tenga una concentracin en torno a 106 (1 milln)
aplicando las diluciones correspondientes.

Por debajo de 250.000 clulas / ml (2,5 * 105 ) la cantidad de clulas contadas no es


suficiente para poder dar una estimacin lo suficientemente fiable de la concentracin
celular.
La concentracin ptima para conteo en hematocitmetro es de 1 milln de clulas por
ml = 106 clulas /ml
PASO 2. Introduccin de la muestra en la cmara de Neubauer
Se toman 10 uL de la mezcla preparada en el paso 1 con la micropipeta.
1) Se coloca un cubreobjetos sobre la cmara de Neubauer, y se coloca en
posicin horizontal sobre la mesa, en un lugar donde nos sea cmodo pipetear.
2) Se introduce una punta desechable en el extremo de la micropipeta.
3) Se ajusta la micropipeta para succionar 10 uL de lquido. Generalmente este
ajuste se realiza guirando el botn del embolo para seleccionar el volumen
deseado.
4) se introduce la punta de la micropipeta en la muestra
5) Se pulsa el pistn o embolo superior de la pipeta suavemente hasta que se
siente como el pistn llega al final de su recorrido.
6) Se saca la punta de la pipeta de la muestra, y siempre mantenindola en
posicin vertical se lleva hasta la cmara de Neubauer.
7) Se coloca la punta de la pipeta en el borde del cubreobjetos, en el extremo de
la cmara de Neubauer. Se trata de dejar que el lquido penetre entre la cmara
y el cubreobjetos desde el lateral, por capilaridad.
8) Se suelta el pistn suavemente mientras se supervisa que el lquido est
entrando correctamente y de forma uniforme en la cmara. (Ver Fig.1)
9) En caso de que aparezcan burbujas, el cubreobjetos se haya movido o algo
no haya salido bien, repetir la operacin Ya tenemos la cmara de Neubauer
cargada, lista para el recuento celular.
Ya tenemos la cmara de Neubauer cargada, lista para el recuento celular.

Fig 1. Introduccin de la muestra en la cmara de Neubauer

PASO 3. Preparacin y enfoque del microscopio.


1. Colocar la cmara de Neubauer en la bandeja del microscopio. Si el
microscopio dispone de pinza de sujecin, fijar la cmara con ella.
2. Encender la luz del microscopio.
3. Enfocar el microscopio hasta que pueden verse ntidas las clulas mirando por
el binocular.
4. Buscar el primer cuadro donde vaya a realizarse el recuento. En este ejemplo
vamos a contar 5 cuadros grandes de una cmara de Neubauer Improved de
0,1mm de profundidad. (Ver Fig. 2)
5. Realizar el recuento de clulas en el primer cuadro. Existe una convencin por
la cual, si las clulas tocan el lmite superior o el lmite izquierdo del cuadro,
deben contabilizarse, pero no se contabilizan si tocan el lmite inferior o el lmite
derecho.
Fig. 2. Recuento de 5 cuadros grandes de cmara de Neubauer Improved. (Bastidas)
DISEO EXPERIMENTIAL
Seleccin del mejor tratamiento (SUSTRATO)
Para determinar el mejor tratamiento en la produccin de lactobacillus plantarum
se realizar un diseo experimental con cuatro tratamientos y tres repeticiones.

TRATAMIENTO COMPOSICION CANTIDAD


T1 Caldo MRS
Extracto de
levadura
Glucosa
T2 Citrato de amonio
Suero de leche 150gr/l
Sacarosa 10 gr/l
Leche de soya 15gr/l
sbila 25,50,75, 100%
Leche de soya 15gr/l
Sacarosa 10 gr/l
T3
Salvado de trigo 15gr/l
Suero de leche 150gr/l
Sbila 25,50,75, 100%
T4 glucosa 1%-5% m/v
miel 1%-5% m/v
Fuente: Elaboracin propia
Una vez obtenido las cepas de lactobacilllus plantarum estas se inocularn en
los sustratos (TRATAMIENTO), luego se llevar a una incubadora a 37C por 48
horas y luego tomar la lectura correspondiente. Posteriormente se realizar el
conteo de las UFC en cada tratamiento en la cmara de biodawer
Optimizacin de parmetros para la produccin de biomasa
Despus de seleccionar el tratamiento con mayor concentracin de biomasa, se
optimizarn los parmetros ms relevantes que intervienen en la produccin de
biomasa. Estos parmetros son: fuentes de carbono y pH.
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

Bibliografa
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ANEXOS