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Introduccin
Los virus de la influenza causan epidemias anuales en muchas pandemias mundiales ocasionales.
Vacunas contra la gripe y medicamentos antivirales son dos medidas tiles para prevenir la influenza
y reduciendo el impacto de las epidemias. En la actualidad, ha habido dos clases de medicamentos
antivirales disponibles para prevenir y tratar enfermedad de la influenza: bloqueadores de los canales
inicos M2, adamantanos (amantadina y rimantadina), e inhibidores de neuraminidasa (oseltamivir,
zanamivir y peramivir). Desde la gripe 2005-2006 temporada, la mayora de los virus de influenza
humana A / H3N2 en todo el mundo se encontr que llevan S31N en la protena M2, confiriendo
resistencia al adamantano . En la temporada de 2007-2008, influenza estacional resistente al
oseltamivir A / H1N1 los virus portadores de H275Y (N1 numeracin) en la protena NA fueron
detectados en Europa y propagados a nivel mundial en ausencia de presin selectiva. Al final de la
temporada 2007-2008, el porcentaje medio de aislados resistentes a oseltamivir fue del 25% en
Europa, 12,3% en Estados Unidos, 26% en Canad, 12% en Hong Kong y 3% en Japn. Para la
temporada 2008-2009, la mayor parte los virus de la gripe estacional A / H1N1 han sido resistentes
oseltamivir. Emergencia y propagacin de virus antivirales plantean un reto en cuanto a las estrategias
para tratar y prevenir la gripe.
Hay tres factores clave que afectan los procesos evolutivos de los virus de la gripe resistentes a los
antivirales de su aparicin a la propagacin mundial. El primer factor es la frecuencia de mutantes
resistentes a frmacos que surgen de nuevo durante el tratamiento, segundo es la capacidad de superar
el obstculo de la aptitud viral causada por mutaciones resistentes y el ltimo es sustituir las cepas
existentes por mutaciones de reorganizacin (reassortment) y / o deriva. Basado en el ejemplo de
resistentes al adamantano A / H3N2 virus, estos virus han ocurrido de novo a una frecuencia alta en
aproximadamente 27-33% de los pacientes tratados y estos siguen siendo patgenos y transmisibles,
en comparacin con los virus de tipo salvaje. Los virus A / H3N2 resistentes a adamantano que
circulan por todo el 2005-2006 se generaron a travs de la reorganizacin y sustituciones adicionales.
En el ejemplo de oseltamivir-resistente virus de la gripe estacional A / H1N1, la frecuencia de los
virus resistentes a los frmacos que aparecieron durante los ensayos clnicos fue de 0,3 a 18% . Antes
de 2006, oseltamivir-resistente A / Los virus H1N1 se encontraron comprometidos para la
replicacin y transmisin in vitro e in vivo, en comparacin con la de tipo salvaje. En la temporada
de influenza 2007-2008, los virus A / H1N1 resistentes al oseltamivir probablemente su poblacin,
se hizo predominante y circul globalmente. En particular, los virus no difieren epidemiolgicamente
o clnicamente a partir de aislados susceptibles]. Por lo tanto, es un cuestin importante para la
comprensin de la evolucin de los virus antivirales que el (los) cambio (s) gentico (s) puede
conducir a la optimizacin de la permicion que un virus comprometido se convierta en predominante
y globalmente.
Veinticinco virus representativos aislados durante 2005-2009 en Taiwn, que fueron seleccionados
de diferentes virus HA clade (Tabla 2), ms tres resistentes al oseltamivir resistentes al virus de la
gripe A / H1N1 virus de otros pases, A / England / 494/2006, A / England / 594/2006 y A / Kansas /
UR06-0104 / 2007, y dos vacunas cepas A / Nueva Caledonia / 20/1999 y A / Brisbane / 59/2007
para el anlisis completo de secuencia (los ltimos cinco fueron obtenido de la base de datos NCBI),
y la filogentica se determinaron las topologas de cada uno de los segmentos del genoma. Las
topologas filogenticas de HA, NA, PB2 y PA genes fueron similar. En los rboles HA y NA, los
virus del clado 2B fueron ms estrechamente relacionado con el clado 2C que el 2A (Fig. 2A y Fig.
S1). En el PB2 y PA genes, clade 2A virus se agruparon con 2C en lugar que 2B (figura 2B y figura
S1). Por el contrario, la filogentica anlisis de PB1, NP, NS y M genes revel que el clado-2B los
virus clasificados por HA genes se desplazaron a clado 1 (Fig. 3 y Fig. S2), excepto para A / Taiwn
/ 2885/2008, cuyo gen M cay en clado 2 (figura 3B). El desajuste en estas topologas de rbol
fuertemente sugiere que los virus del clado 2B se generaron a travs de un 4 (PB1, NP, NS y M) +4
(HA, NA, PB2 y PA) reordenamiento entre los clados 1 y 2. Los 8 segmentos de clados 2A y 2C
fueron consistentemente en el clado 2, lo que indica que el reasentamiento no ha pero sucedi en estos
dos virus clade. Adems, los otros dos tipos de reorganizacin. El virus A / England / 594 / 2006
represent un evento de reordenamiento 6 + 2 entre el clado 1 y 2, es decir, sus segmentos PB2, PA,
PB1, NP, NS y M se localizaban en clado 1 y los segmentos HA y NA en el clado 2 (Tabla 2). Los
virus A / Taiwn / 2885/2008 represent un evento de reordenamiento 3 + 5 entre los clados 1 y 2.
Sus segmentos PB1, NP y NS se localizaron en los segmentos clade 1 y HA, NA, PB2, PA y M en el
clado 2 (Tabla 2).
Sustituciones de aminocidos asociadas con oseltamivir-resistant virus de la gripe estacional A /
H1N1
Para entender las diferencias genticas entre el oseltamivir-resistente y virus sensibles, sustituciones
de aminocidos de se compararon los virus representativos en el mismo clado HA. En clade 2B-1,
hubo slo un virus con H275Y, A / Taiwan / 3293/2008, identificado antes de mayo de 2008.
Sustitucin H275Y en la NA y ninguna sustitucin especfica fue encontrado por comparacin con el
tipo salvaje 2B-1 virus (Tabla 3). Cabe destacar que los otros cuatro virus clade 2B-1 con H275Y,
recogidas despus de octubre de 2008 durante la epidemia de 2008-2009, cinco sustituciones de
aminocidos adicionales situadas en tres genoma, incluyendo D354G en NA, L30R y H41P en PB1-
F2 y V411I y P453S en PB2 (Tabla 3). Entre los clados Virus 2B-2 en la temporada 2008-2009, todos
ellos cinco sustituciones en comparacin con el tipo salvaje 2B-1 virus.
Tambin se detectaron sustituciones adicionales en las posiciones 158, 200 y 202 en HA (numeracin
H1, referida a A / Nueva Caledonia / 20 / 1999 y la metionina de partida contada como 1, utilizada
en otras este estudio) y la posicin 642 en los genes PB1 (Tabla 3], que probablemente representaron
mutaciones de deriva y se asociaron menos con la propagacin de los virus del clado 2B-2. Para
investigar si estos sustituciones ocurrieron en los aislados globales, analizamos extensivamente los
92 virus pertenecieron al clado 2B en HA genes en todo el mundo durante 2006 a 2009 con el genoma
completo disponible en la base de datos de Recursos de Virus de la Influenza (Fig. 4 y Tabla S1).
Diferencias de sustituciones de aminocidos, especialmente aquellas entre el clado 2B-1 y 2B-2 se
centraron en y se muestra en la Fig. 4.
Las sustituciones, A206T en HA, D354G en NA, N642S en PB1, L30R y H41P en PB1-F2 y V411I
y P453S en PB2 fueron tambin altamente correlacionada con el H275Y en los genes de NA. Por lo
tanto, estas sustituciones generalizadas se observaron en los virus aislados tanto de Taiwn como del
mundo. Para los virus del clado 2C, el nico Se detect un aislado con H275Y, A / Taiwn /
2832/2008, y en octubre de 2008. Esto no haba adquirido ninguna , comparado con el virus de tipo
2C de tipo salvaje (Tabla 3). Tambin se analizaron las sustituciones S31N en M2, confiriendo
resistencia a la amantadina. Entre los virus representativos, el ocho virus en HA clados 1 y 2A no
tienen sustituciones S31N.
En el clado 2B, slo se encontr un aislado, A / Taiwan / 2885/2008 llevar la sustitucin S31N. Esta
doble resistencia a la amantadina y el oseltamivir result de la reasuncin 3 + 5 del virus (Tabla 2 y
Fig. 3B). En el clado 2C, todos los cinco aislamientos la sustitucin S31N en M2 (Tabla 2).
Figura 2. Relaciones filogenticas de los segmentos HA y PB2 de los virus de la influenza A / H1N1
en Taiwn. Los anlisis filogenticos se construyeron utilizando el mtodo de unin vecina con 1000
repeticiones de bootstrap. Se indican valores de ramificacin de ms de 75. Toda las filogenias se
arraigaron con la A / New Caledonia / 20/1999, que fue la cepa de la vacuna recomendada por la
OMS durante la gripe 2001-2007 estaciones. Las secuencias del genoma de A / Solomon Islands /
3/2006, A / Brisbane / 59/2007 y los aislamientos tempranos que llevan la sustitucin H275Y, A /
England / 494/2006, A / England / 594/2006 y A / Kansas / UR06-0104 / 2007, obtenidos de la base
de datos NCBI. Diferentes clados fueron mostrados por Colores diferentes.
Figura 3. Relaciones filogenticas de los segmentos PB1 y M de los virus de la influenza A / H1N1
en Taiwn. Los anlisis filogenticos se construyeron utilizando el mtodo de unin vecina con 1000
repeticiones de bootstrap. Se indican valores de ramificacin de ms de 75. Todas las filogenias
fueron arraigadas con el A / New Caledonia / 20/1999. Diferentes clados fueron mostrados por
diferentes colores.
La actividad de la neuraminidasa y el anlisis cuasi-especies del virus de la gripe estacional A / H1N1
275H, 275Y en el gen NA
Las concentraciones inhibidoras del 50% (IC50) para el oseltamivir se determinaron los 25 virus
representativos (Tabla 2). Entre los valores de IC50 de oseltamivir de los virus que codifican 275Y
estaban en el intervalo 139,9-821,7 nM, mientras que los valores de la 275H uno fueron de 0,26-1,15
nM. Adems, examinamos la posibilidad si los virus sensibles o resistentes probados por IC50
contenan quasiespecies de genotipos virales que se definieron como componentes de 275H y 275Y
poblaciones en un oseltamivir sensibles y resistente, por clonacin y secuenciacin de la PCR-
amplificado viral Secuencias NA. El virus sensible, A / Taiwan / 10092/2007, mostr todos los 275H
tipo (100%, 50/50) y tambin el virus resistente, A / Taiwan / 3293/2008, mostr todos los tipos 275Y
(100%, 50/50), indicando genotipos cuasi-especies no se detectaron en estos dos virus.
Discusin
La frecuencia global de virus resistentes aument del 44% (Abril 2008-septiembre 2008) al 96%
(octubre 2008-marzo 2009) [9, 24]. Basado en la distribucin espacial y espacial de los virus de la
influenza A / H1N1 resistentes al oseltamivir, propagacin de la los virus resistentes parecan partir
de Europa y migrar al hemisferio sur, seguido por Norteamrica y Asia.
La reorganizacin del segmento del genoma contribuye al diversidad de la influenza y se asocia con
epidemias y pandemias de desastres. Los virus de la gripe A causaron cuatro pandemia de influenza
en 1918 (subtipo H1N1), 1957 (H2N2 subtipo), 1968 (subtipo H3N2) y 2009 (subtipo H1N1), y todos
esos virus surgieron a travs de un complejo reordenamiento entre subtipos eventos [26, 27]. Adems,
los reordenamientos intra-subtipo como la deriva antignica han demostrado ser un factor importante
proceso en la evolucin y las epidemias anuales de influenza humana Virus A / H1N1 y fueron
responsables de varios epidemias de gravedad inusual en la dcada de 1940 y 1950 [28]. En este
estudio, investigamos las historias evolutivas y epidemiologa de los virus estacionales de la gripe A
/ H1N1 en Taiwn. Durante 2005-2009, hubo cuatro epidemias de influenza en Taiwn y tres de los
cuatro fueron causados por el subtipo H1N1y predomin por diferentes variantes, incluyendo HA
clades 2A,2B - 1 y 2B - 2, respectivamente (Figura 1C). La variante epidmica El volumen de
negocios del clado 2A al 2B-1 durante 2005-2007 se efecto de las mutaciones de reasentamiento intra-
subtipo y de deriva (Cuadro 2 y 3). Las siguientes dos epidemias sucesivas de influenza de 2007-
2008 y 2008-2009 en Taiwn fueron predominante variantes 2B-1 y 2B-2, respectivamente, y fueron
antignicamente en relacin con A / Brisbane / 59/2007, la gripe A / Componente H1N1 de la gripe
2008-2009 y 2009-2010 vacuna para el hemisferio norte (datos no presentados y [29]). Estas dos
variantes tenan segmentos genticos similares y mutaciones importantes localizadas en HA, NA,
PB1, PB1-F2 y PB2 (Tabla 3). Adems, los virus non-reassortant clade 2C, que no poda llegar a ser
dominante y extenderse ampliamente como el clado 2B virus, tambin coexistan y circulaban
continuamente a actividad durante 2005-2009 en Taiwn. Estos resultados destac la importancia de
la reorganizacin del segmento genmico y deriva de genes superficiales e internos en el predominio
y la recurrencia epidmica anual de los virus de la influenza. La propagacin mundial de los virus de
la gripe antivirales ha sido observado para los subtipos H3N2 y H1N1. Reorganizacin genmica y
sustituciones adicionales tambin se han considerado importantes procesos evolutivos de aparicin y
propagacin de adamantane-resistant virus de la influenza A / H3N2 en 2005-2006 y un hitch-hiking
se utiliz el mecanismo para explicar la ocurrencia del S31N sustitucin en la protena M2 de esta
variante en particular [14]. En esto estudio, se observ que la propagacin mundial de oseltamivir
resistente virus de influenza A / H1N1 durante 2007-2009 fueron generados reassortment y
mutaciones de deriva, y el H275Y en la protena NA tambin pareca extenderse en un mecanismo
de autostop. Analizamos la phylogenetic rboles de los cuatro principios oseltamivir resistente a los
virus recogidos antes de enero de 2007 y los virus representativos aislados en Taiwn durante 2005-
2009. Las filogenias resultantes revelaron que cada segmento de A / Taiwan / 0045/2006 estaba
estrechamente relacionado con clade 2C y las de A / England / 494/2006 y A / Kansas / UR06-0104
/2007 se ubicaron en el clado 1 (Tabla 2). Cabe destacar que el clado 2B A / England / 594/2006,
cuyos genes PB2 y PA todava caen en el clado 1, represent otro evento de reorganizacin-un patrn
6 + 2 entre clade 1 y 2 (Tabla 2). Los datos sugieren que los virus resistentes antes de 2007 ocurrieron
espordicamente en clado 1 y clado 2, y se generaron nuevas variantes (clado 2B) a travs de eventos
de reordenamiento intra-subtipo entre estos dos clados paso a paso (6 + 2 a 4 + 4) durante 2006-2007
y adquirieron sustituciones adicionales en los procesos evolutivos. Durante la rotacin epidmica de
variantes dominantes del clado 2B-1 a 2B-2 virus en las dos temporadas de influenza de 2007-2008
y 2008-2009 en Taiwn, varias sustituciones importantes se detectaron sin genmica reassortment,
incluyendo A206T en HA, H275Y y D354G en NA, N642S en PB1, L30R y H41P en PB1-F2 y
V411I y P453S en PB2 (Tabla 3). Algunas de estas sustituciones deberan mejorar la fitness y
contribuir a la recurrencia epidmica. En los estudios previos, se encontr que el residuo 354 en la
protena NA se localizaba en la parte superior del neuraminidasa, el resto 206 era el receptor que se
una dominio de la protena HA1 y el residuo 453 fue el ncleo nuclear localizacin de la seal de la
PB2 [20, 30, 31]. Sin embargo, el papel de estos sustituciones en la epidemiologa de la gripe siguen
siendo estudiados. Era merece la pena mencionar que estas sustituciones no se observaron en
resistentes al oseltamivir, a excepcin de A206T en HA y D354G en NA. Estos resultados revelaron
que la sustitucin H275Y NA coincidentemente con las sustituciones ventajosas y hicieron autostop
con una variante dominante durante los procesos de evolucin, resultando en los virus resistentes
generalizados.