Biotecnología

Levaduras Vínicas:
Selección, modificación genética y control en la
elaboración de vinos.

Alumnos: KUMMRITZ; Silvana

RODRIGUEZ; Daniela

1
 Biotecnología

Introducción

El hombre ha producido vino y otros alimentos fermentados como el pan, la cerveza o ciertos
derivados lácteos desde tiempos remotos. Los restos arqueológicos relacionados con la
elaboración del vino más antiguos que se conocen datan de hace unos seis milenios. Esto implica
que la biotecnología, es decir, la utilización de organismos vivos o de sus partes en procesos
industriales, es casi tan antigua como el hombre, aunque, durante la mayor parte de la historia, la
base de estas prácticas biotecnológicas fuera puramente empírica. Hoy en día, debido
principalmente a los avances científicos, el conocimiento empírico está siendo reemplazado por
un adecuado conocimiento de los procesos que rigen estas transformaciones biotecnológicas.
Además, el desarrollo y aplicacion de las técnicas de la biología molecular y el DNA
recombinante ha abierto multitud de posibilidades nuevas para el control de los procesos
biotecnológicos y la mejora de los productos elaborados.

La producción del vino es un proceso biotecnológico en el que se aprovecha la capacidad

biosintética de un microorganismo, la levadura vínica, para obtener a partir del mosto de la uva,
el vino que se comercializa.
Muchos estudios se han realizado sobre las levaduras vínicas desde que Pasteur (1866) demostró
que éstas eran las responsables de la transformación de los azúcares del mosto en etanol algo
propio de las fermentaciones vínicas. Las fermentaciones alcohólicas realizadas
espontáneamente no se deben a la acción de una única especie ni de una única cepa de levadura,
sino que es el resultado de la acción combinada de diversas especies de levaduras.
Dentro de las levaduras que se pueden encontrar en una fermentación alcohólica (levaduras
procedentes de la propia uva o del material típico de bodega), se ha visto que Saccharomyces
cerevisiae es la más idónea para consumir todos los azúcares fermentables y por tanto, asegurar
el proceso. La transformación de los azúcares en etanol es el proceso básico en la producción de
vino pero también existen otras reacciones secundarias que pueden llegar a ser muy importantes.
Su importancia se debe sobretodo a sus aportaciones cualitativas al vino, ya que pueden
contribuir favoreciendo (producción de glicerol, ésteres, alcoholes superiores, etc.) o
perjudicando (producción de ácido acético, sulfhídrico o acetato de etilo) el producto final. El
estudio de la cuantificación y composición de la microbiota responsable de las fermentaciones
espontáneas ha mostrado diferencias tanto cualitativas como cuantitativas, en las levaduras
aisladas en una misma zona vitivinícola e incluso dentro de los depósitos de una misma bodega.
Las causas de esta variabilidad pueden ser: cambios en las técnicas de vinificación, diferencias
en las vendimias, cambios en las condiciones climáticas, etc. Por lo tanto, la necesidad de
asegurar la fermentación alcohólica, así como la tipicidad y reproducibilidad de los vinos,
requiere cada vez más el uso de cultivos iniciadores.

2
 Biotecnología

Selección de levaduras

La levadura responsable de la mayor parte de la transformación del azúcar del mosto de uva en
etanol durante la elaboración del vino es
Saccharomyces cerevisiae (fig. a la izq.). Sin
embargo, cuando la uva llega a la bodega tras la
vendimia, muchas otras especies de levaduras están
presentes (además de hongos filamentosos,
bacterias y virus) y, normalmente, en mayor
número que S. cerevisiae. Las cambiantes
condiciones meteorológicas, entre otros factores,
provocan una gran variabilidad de la calidad y
cantidad de la microbiota levaduriforme presente
en la uva durante las sucesivas campañas. Este
problema puede solventarse añadiendo al mosto un
cultivo iniciador de levadura seleccionada que
normalice la microbiota inicial y, de esta forma, dé lugar a una fermentación homogénea año tras
año. Las características que se le exigen a una levadura seleccionada son:

Algunas características deseables y no deseables en la selección de levaduras para la

producción de vinos de calidad
Características deseables Características no deseables
Alta tolerancia al etanol Producción de SO2
Total degradación de los azucares fermentables Producción de H2S
Resistencia al SO2 Producción de acidez volátil
Capacidad fermentativa a bajas temperaturas Producción de acetaldehído y piruvato
Degradación del acido málico Producción de espuma
Capacidad fermentativa a altas presiones Formación de precursores de carbamato de etilo
Producción de glicerol Producción de polifenol oxidasas
Producción de β -glucosidasas
Producción de fermentaciones vigorosas,
reproducibles y predecibles
Producción de un buen perfil aromático exento de
aromas no deseados

A pesar de que existen levaduras comerciales para realizar las fermentaciones, es más efectivo el
uso de cultivos puros de levaduras que procedan de la zona vitivinícola donde se van a utilizar,
lo que se conoce como levaduras locales seleccionadas, ya que las levaduras que se encuentran
en una microzona son:
- Específicas del área.
- Totalmente adaptadas a las condiciones climáticas de la zona.
- Totalmente adaptadas a la materia prima, es decir al mosto a fermentar.
- Responsables, parcialmente, de las características únicas de los vinos obtenidos.

Para realizar la selección de las cepas, primero se debe identificar las cepas presentes en la zona
a estudiar, realizando un seguimiento de las fermentaciones espontáneas. Una vez que se tiene
una colección de cepas aisladas de la zona, el siguiente paso es la identificación de estas cepas.

3
 Biotecnología

El ir probando cada una de las cepas en fermentaciones individuales y caracterizar todos los
productos finales obtenidos, parece arduo cuando se habla de un alto número de cepas, por tanto,
una posible solución es la selección de cepas en fermentaciones masivas por competencia.

Fermentaciones masivas por competencia

Se elige un número definido de cepas de Saccharomyces, se inoculan en un mismo fermentador
y se hace un seguimiento de cómo evolucionan estas cepas a lo largo de la fermentación. La
población inicial de todas las cepas es la misma, para que todas tengan las mismas posibilidades
de imposición. El número de cepas a analizar se aconseja que no se superior a 20.
Si se tiene un número superior, es recomendable descartar algunas cepas.
Las fermentaciones se hacen a escala de laboratorio, en pequeños fermentadores. Es importante
intentar simular las condiciones de fermentación que posteriormente se utilizarán en bodega.
Para ello, lo ideal es utilizar mosto concentrado diluido, que tiene todos los nutrientes necesarios
para una correcta fermentación.
Aparte de la propia competencia entre cepas, se puede aplicar algún otro criterio de selección, y
así acelerar el proceso de la selección.
La temperatura de fermentación puede ser uno de estos criterios ya que se trata de una variable
muy importante en vinificación. De hecho, las vinificaciones en blanco se llevan a cabo a una
temperatura baja favoreciendo, la retención de aromas y las fermentaciones de vinos tintos, en
cambio, se realizan a temperatura ambiente,
pero sin dejar que la temperatura supere los
30°C, favoreciendo la extracción de los
polifenoles, responsables del color de los vinos.
Para el análisis de la capacidad fermentativa de
las cepas a diferentes temperaturas, se puede,
probar 5 temperaturas diferentes a las que llevar
a cabo las fermentaciones: 15, 20, 25, 30 y
35°C. Cubriendo el rango habitual de
temperaturas de todo tipo de vinificaciones. En
estas fermentaciones, se hace el seguimiento de
las cepas mediante técnicas de Biología
Molecular (ADN mitocondrial). Así, se puede
ver como se comporta cada cepa en las
diferentes condiciones y si hay alguna/s que se
impongan sobre el resto. El estudio de este tipo
de fermentaciones supone la reducción del
número de cepas a un rango de 2 a 8 cepas.

Fermentaciones individuales en el laboratorio

Una vez delimitado el número de cepas, estas se deben probar de forma individual en una
fermentación a pequeña escala, en el laboratorio. Cada una de las cepas seleccionadas, se inocula
de forma individual en un fermentador con mosto concentrado diluido y se sigue la
fermentación. Este se trata de un paso básico, ya que el hecho de que una cepa se haya impuesto
en una fermentación masiva, no garantiza que pueda realizar una fermentación completa por ella
sola. Además, se tienen que analizar las características organolépticas del vino obtenido con cada
cepa. Después de haber hecho las pruebas en el laboratorio y por tanto, haber comprobado qué
cepas presentan las características descriptas en la tabla anterior. Se realiza una cata, y se eligen
las cepas que además de fermentar correctamente, tengan un mejor perfil cromático, aromático y
gustativo. Las cepas que hayan superado todas las fases de selección se probarán a nivel
industrial en una bodega.

4
 Biotecnología

Fermentaciones industriales
Estas cepas se inoculan de forma independiente en un depósito a escala industrial. Se hace el
seguimiento de la fermentación, controlando la imposición de nuestra cepa sobre la flora
autóctona de la zona. Las cepas que cumpla con este requisito serán aptas para ser seleccionadas.
Si se tienen varias, en la elección de una u otra se deberá valorar, principalmente, las
características organolépticas, es decir, aquélla que proporciona un vino de mayor calidad. Si las
cepas seleccionadas tienen un interés comercial, queda un último paso que es su deshidratación.
No todas las cepas resisten bien ni mantienen sus características tras el secado y la posterior
rehidratación y por tanto, aunque se trate de una cepa de características extraordinarias, sino se
puede deshidratar, no será una buena levadura para su uso industrial. La producción de levaduras
secas activas (LSA) es un proceso muy importante, ya que se producen en condiciones de
aerobiosis (es decir, en presencia de oxígeno), para conseguir una elevada biomasa, y una reserva
de ácidos grasos insaturados y esteroles muy necesarios durante el proceso fermentativo (en
semianaerobiosis) donde la síntesis de estos compuestos está inhibida. Este proceso hace que las
levaduras estén metabólicamente activas cuando se rehidratan y por tanto, su imposición sea más
rápida. Una vez que la levadura ha superado todas estas fases, aún se hace necesario el análisis
de su estabilidad genética. Es conocida una cierta inestabilidad de las cepas de levaduras, que
hace que después de muchas generaciones (que es el caso de la producción industrial de LSA), el
porcentaje de mutaciones sea elevado, por lo que dicho análisis es un requisito imprescindible.
Una vez superadas las diferentes fases del proceso de selección y de la producción industrial
(incluido el secado), queda la última fase y definitiva: su uso industrial en bodega y su
aceptación final.

5
 Biotecnología

Modificación genética

El uso de levaduras seleccionadas que se inoculan en los mostos para iniciar y conducir la
fermentación alcohólica imponiéndose al resto de levaduras presentes, junto con el mayor
conocimiento molecular de algunas rutas bioquímicas de interés biotecnológico, ha permitido
hacer ingeniería genética de la levadura vínica. El razonamiento es simple: la introducción de
uno o varios genes exógenos en la levadura implica la producción de una o varias nuevas
características de interés industrial. Su posterior inoculación e imposición asegura la expresión
de dichas características a lo largo del proceso fermentativo y, por tanto, su efecto en el producto
final.
Para poder modificar genéticamente un organismo es necesario disponer de un sistema de
transformación que permita introducir en él la información genética modificada in vitro. Durante
los últimos años se han desarrollado enormemente los sistemas de transformación y, finalmente,
se ha logrado construir levaduras vínicas recombinantes que portan un nuevo gen o genes
integrados en el genoma de la levadura y que carecen de los genes de resistencia a antibióticos
que se han empleado en los procesos previos de manipulación. Una vez que somos capaces de
introducir genes en la levadura vínica, el siguiente paso consiste en conseguir su expresión
durante la vinificación. La regulación de la expresión puede modularse de forma que los genes se
“enciendan” o “apaguen” en función de determinadas condiciones fisiológicas o ambientales, lo
que permite, por tanto, no sólo que los genes se expresen, sino que lo hagan en el momento más
idóneo del proceso de elaboración.
Con las herramientas descritas, se han obtenido diversas levaduras vínicas transgénicas. Para
vinos que presentan problemas de baja acidez se han construido levaduras que contienen un gen,
aislado de Lactobacillus casei, necesario para la producción de ácido láctico. Esta levadura
transgénica es así capaz de llevar a cabo la fermentación láctica y la alcohólica, con lo que se
solventa el problema. Para el caso contrario, es decir, vinos con excesiva acidez, se han
introducido en la levadura dos genes provenientes de Lactococcus lactis y Schizosaccharomyces
pombe, que han conseguido que la levadura modificada sea capaz de llevar a cabo la
fermentación maloláctica, es decir, la conversión del ácido málico en ácido láctico, la cual se
traduce en una disminución de la acidez y una mayor estabilidad microbiológica del vino.
Se han construido levaduras vínicas transgénicas capaces de incrementar aromas deseados en
vinos (fig. 4). Prestando especial atención al aroma afrutado. Que depende mayoritariamente de
la presencia de unos determinados terpenos, los cuales se encuentran en el mosto en dos
fracciones, una libre que da aroma por ser volátil, y otra ligada a restos de pared celular del
grano de uva por enlaces diglicosídicos. Esta última no contribuye al aroma a menos que se
corten los enlaces anteriormente mencionados mediante el empleo de glicosidasas. Se han
clonado genes de hongos filamentosos y levaduras oxidativas que codifican estas enzimas, y
dichos genes se han expresado en levaduras vínicas, obteniéndose resultados satisfactorios.
Otros ejemplos interesantes y de gran actualidad son el desarrollo de levaduras vínicas que
puedan actuar también como agentes de biocontrol inhibiendo el crecimiento de
microorganismos alterantes, lo que permitiría reducir las cantidades de sulfuroso que se
adicionan al mosto y vino como agente antimicrobiano.
Actualmente se sigue investigando en campos como el estudio de los genes que regulan la
floculación de las levaduras, la construcción de levaduras transgénicas incapaces de producir
urea o la modificación de las características metabólicas para optimizar las tasas de fermentación
y la producción de metabolitos de interés.

6
 Biotecnología

Figura 4. Esquema de la construcción de

una levadura transgénica con capacidad
para incrementar el aroma del vino. La
levadura se transforma con dos genes
exógenos: una arabinofuranosidasa del
hongo filamentoso Aspergillus niger
(ABF) corta el enlace entre la arabinosa
(A) y la glucosa (G). Así se posibilita la
acción del segundo enzima, una -
glucosidasa aislada de la levadura Candida
molischiana (BGL) capaz de cortar el
enlace entre la glucosa y el terpeno (T), el
cual queda libre y pasa a formar parte del
aroma.

7
 Biotecnología

Métodos moleculares de identificación para

el control de cepas

Tras el empleo de levaduras seleccionadas como práctica habitual en muchas bodegas,

inevitablemente se planteó un importante interrogante. ¿Cómo saber si la inoculación es exitosa
y la levadura añadida conduce la fermentación y transmite al vino las características por las que
fue seleccionada? Las técnicas clásicas de identificación, basadas en las características
morfológicas y fisiológicas, aparte de ser lentas, no podían contestar a esta cuestión ya que eran
incapaces de discernir entre las numerosas cepas de la especie S. cerevisiae presentes en el mosto
o vino y, por tanto, la levadura seleccionada se hacía indistinguible del resto. El problema se
resolvió con el empleo de los métodos moleculares de identificación. En concreto, el empleo de
ciertas enzimas de restricción que cortan selectivamente el ADN, y la posterior separación de los
fragmentos resultantes en geles de agarosa, permitió obtener patrones de bandas
correspondientes a fragmentos del ADN mitocondrial de las levaduras. Estos patrones resultaron
ser distintos entre las distintas cepas de levadura vínica y, por tanto, la técnica permitió de forma
rápida conocer qué cepas y en qué proporción se hallan en cada momento creciendo en los
fermentadores (fig. 2). Esta herramienta de identificación permite además realizar un análisis de
las distintas levaduras comerciales que se encuentran en el mercado y comprobar si las cepas que
se venden como distintas lo son en realidad, pudiéndose detectar los fraudes que no mucho
tiempo atrás pasaban desapercibidos. Además de esta técnica, existen otras cuya aplicabilidad
varía en función de los objetivos que se persigan. Por ejemplo, la separación de los cromosomas
(cariotipo) en función de su migración electroforética en geles de agarosa puede ser igualmente
útil para diferenciar entre distintas cepas de S. cerevisiae, y la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) para amplificar selectivamente fragmentos del ADN ribosomal se utiliza para
diferenciar entre distintos géneros y especies de levaduras que forman parte de la microbiota
natural de la uva y el vino.
La utilización de este tipo de técnicas se está imponiendo con rapidez en las bodegas, ya que
permiten un control microbiológico del proceso fermentativo más rápido y efectivo, sobre todo
cuando se utilizan levaduras seleccionadas para producir vinos de características homogéneas
año tras año.

Figura 2. Aspecto de los fragmentos de

ADN mitocondrial separados por
electroforesis en gel de agarosa. En cada
columna o carrera electroforética se ha
cargado el ADN correspondiente a una
cepa de Saccharomyces cerevisiae. Así
se han podido observar patrones de
bandas iguales cuando se trata de la
misma cepa o distintos en caso contrario.

8
 Biotecnología

Conclusión

Las cepas seleccionadas de una zona pueden ser una buena solución para mantener las
características típicas de los vinos de una región vitivinícola y así, garantizar una uniformidad
del producto a lo largo de los años.
Los avances en las técnicas de ADN recombinante han hecho posible introducir nuevas
propiedades en cepas industriales de levadura. Las ventajas de la aplicación de las técnicas de
ingeniería genética son especificidad, versatilidad y rapidez.
En los últimos años, se ha intentado mejorar varios aspectos en levaduras vínicas, tratando de
conseguir: que tengan una mayor capacidad fermentativa y que rindan un producto de mayor
calidad, en relación con sus características organolépticas, funcionales y/o de seguridad.
Hoy en día es posible conseguir levaduras que produzcan o dejen de producir una determinada
enzima, que expresen de nuevo una, o más de una, determinada actividad enzimática y/o que
expresen una enzima propia pero modificada para tener nuevas características más adecuadas al
proceso de vinificación.
La biotecnología enológica podría proporcionar a los bodegueros nuevos desarrollos que
permitieran elaborar “vinos a la carta”. Sin embargo, en estos momentos es sabido, que la
aplicación de la ingeniería genética en la alimentación plantea problemas de aceptación por parte
del consumidor, fundamentalmente en la Unión Europea.
Es por ello que los estudios de tipo toxicológico, unidos a los de impacto ambiental, resultan
imprescindibles para convencer al consumidor de la bondad de este tipo de alimentos.
Son tantos y tan diferentes los posibles beneficios que para la industria del vino supondría la
aplicación de la ingeniería genética y metabólica en levaduras vínicas. Sin embargo, no hay que
olvidar que todos estos posibles beneficios sólo se harán realidad si estas nuevas tecnologías se
aplican respetando la naturaleza propia de un producto tan característico y único como el vino.

9
 Biotecnología

Bibliografía
• Revista: Tecnología del vino- marzo/abril 02
A. Mas, M. J. Torija, G. Beltrán, M. Novo, N. Hierro, M.
Poblet, N. Rozés y J. M. Guillamón
Unitat d’enologia del Centre de Referència en
Tecnologia dels Aliments. Facultad de Enología de Tarragona
Universidad Rovira i Virgili

• Modificación genética de levaduras vínicas

Dr. José Vicente Gil Ponce
Departamento de Biotecnología
Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos (CSIC)

• SEMINARIO
INSTITUTO DE BIOLOGÍA VEGETAL Y BIOTECNOLOGÍA
Rosa Roa
Uso de levaduras genéticamente modificadas en enología

• http://72.30.186.56/search/cache?ei=UTF-8&p=+%09la+nueva+biotecnologia+
%09enologica&y=Buscar&rd=r1&fr=yfp-t-
340&u=www.ctnc.es:81/noticias/pdf/AGROCSIC/13_AGROCSIC-
Vinificacion.pdf&w=la+nueva+biotecnologia+enologica&d=KSMGlbXiP7q6&icp=1&.i
ntl=ar

• http://www.acenologia.com/ciencia86.htm

• http://www.uv.es/metode/anuario2001/58_2001.html

• http://www.inta.gov.ar/mendoza/info/documentos/TemasCEE/CEE004.htm

10