Instituto Politcnico

Nacional
Escuela Nacional de Ciencias
Biolgicas
Laboratorio de Gentica Microbiana
Prctica No. 2 Induccin de mutantes en
Escherichia coli
Grupo: 5QV1

Secc. I Eq. 3

Integrantes: Cevada Santiago Karen Jazmin

Chvez Gngora Ayla Anyl

Fecha de entrega: 10 - Octubre - 17

OBJETIVOS

Conocer el manejo de algunas tcnicas para producir mutaciones

Analizar algunos parmetros que caracterizan el proceso de mutacin como la

frecuencia de mutacin y la relacin dosis-respuesta.

Caracterizar el dao producido por la luz ultravioleta y la hidroxilamina mediante

pruebas de reversin.

INTRODUCCIN

En 1943, Salvador Luria y Max Delbruck presentaron la primera prueba de

directa de que las mutaciones no se producen como parte de un mecanismo
adaptativo, sino que tienen lugar de forma espontnea y aleatoria.

A menudo los genetistas clasifican las mutaciones gnicas segn los cambios
nucleotdicos que generan la mutacin. El cambio de un par de bases por otro
en una molcula de ADN se denomina mutacin puntual o de sustitucin de
bases. El cambio de un nucletido de un triplete en una porcin de un gen que
codifica una protena puede resultar en la creacin de un nuevo triplete que
codifique un aminocido diferente en el producto proteico. Si ocurre esto, la
mutacin se denomina mutacin de cambio de sentido. Una segunda
posibilidad es que el triplete cambie a un codn de terminacin (stop), lo que
resulta en la terminacin de la traduccin de la protena, lo que se conoce como
mutacin sin sentido. Si la mutacin puntual altera un codn pero no resulta
en un cambio aminoacdico en esa posicin de la protena (debido a la
degeneracin del cdigo gentico) puede considerarse una mutacin
silenciosa.

Si una pirimidina remplaza a una pirimidina o una purina reemplaza a una

purina, se ha producido una transicin. Si se intercambian una purina y una
pirimidina, se ha producido una transversin.

Otro tipo de cambios que pueden producirse es la insercin o la delecin de

uno o ms nucletidos en cualquier lugar del gen. La prdida o la adicin de
un solo nucletido provoca el cambio de todos los codones de tres letras
posteriores. Estas mutaciones se denominan mutaciones de cambio de fase, ya
que se altera la puta de lectura de los tripletes durante la traduccin. Una
mutacin de cambio de fase se producir cuando se aada o se deleciones
cualquier nmero de bases, excepto los mltiplos de tres, que restablecern la
fase de lectura inicial. Es probable que uno de los muchos tripletes alterados
sea UAA, UAG, o UGA, los codones de terminacin de la traduccin. Cuando se
encuentra uno de estos tripletes durante la traduccin, se termina la sntesis
del polipptido. Obviamente, los resultados de las mutaciones de cambio de
fase pueden ser muy graves, especialmente si se producen cerca del principio
de la secuencia de codificacin.

Desarrollo (modificaciones)

Tratamiento con LUV e HA

De los tubos de cultivo con la dilucin 10-1 obtenidos despus de la incubacin

a 37C por 48 hrs con los tiempos de irradiacin 0-60 segundos y aquellos
tubos con las concentraciones 0.0-0.8 M, se sembraron alcuotas de 0.1 mL
sobre cajas con agar MacConkey por la tcnica de dispersin con varilla
acodada. Se sembraron dos cajas de las diluciones 10-6 y 10-7 y una caja de la
dilucin 10-8.

RESULTADOS

Tabla 1. Tratamiento con Luz UV. Efecto letal

TRATAMIENTO DILUCIN No. TTULO %SOBREVIVENCIA
(LUZ UV) COLONIAS BACTERIANO
(UFC/mL)
Tubo 1 10-3 456/670
0 segundos 6.51 X 106 100%
10-4 92/215

Tubo 2 10-4 10/13

15 segundos 10-5 2/1 1.18X 106 18.12%

Tubo 3 10-4 7/9

30 segundos 10-5 0/0 7.27 X 105 11.16%

Tubo 4 10-4 0/0

45 segundos 10-5 2/4 3.0 X 106 46.08%

Tubo 5 10-4 9/6

60 segundos 10-5 0/0 6.81 X 104 1.04%

456 + 670 + 92 + 2015 1 1

= ( )( 3
) ( ) = 6.51106
2.2 10 0.1
6
% : 6.51106
100 %
1.1810 = 18.12 %
 Curva de Porcentaje de Sobrevivencia

120
Tiempo de
% de
irradiacin
100
sobrevivencia
(segundos)
0 100
80 15 18.12
30 11.16
45 46.08
60
60 1.04

40

20

0
0 10 20 30 40 50 60 70

Grfico 1. Curva de porcentaje de sobrevivencia con Luz UV. Efecto letal.

Tabla 2. Resultados del proceso de induccin de mutantes por radiacin UV en una cepa de E. coli
W3350, para observar el efecto mutagnico.

TRATAMIEN No. TTULO No. TTULO FRECUEN

TO DILUCIN COLONI BACTERIANO COLONIAS BACTERIANO CIA DE
(LUZ UV) AS (UFC/mL) MUTANTES DE MUTACIN
MUTANTES
Tubo 1 10-6 300/396 0
9
0 segundos 10-7 66/63 3.75 X 10 0 0 0
10-8 4 0
Tubo 2 10-6 416/312 0
15 segundos 10-7 79/62 3.97 X 109 1 5X 107 1.25 X 10-2
10-8 10 0
Tubo 3 10-4 1790 0
30 segundos 10-5 214/164 1.83 X 108 0 0 0
10-6 32/39 0
Tubo 4 10-4 1497 0
45 segundos 10-5 144/167 1.50 X 108 0 0 0
10-6 12/17 0
Tubo 5 10-4 1203 0
60 segundos 10-5 174/163 1.31 X 108 0 0 0
10-6 38/27 0
CLCULOS

Ttulo bacteriano ejemplo:

300+396+66+63+42.21 =8292.21= 375.11 ( 10.1)(11X10-6)= 3.75 X109

Se sigui la misma metodologa para los ttulos posteriores.

Ttulo de mutantes (tubo 2, dilucin 10-7, se sembr por duplicado):

0+12= 0.5 (10.1) (11X10-7)= 5 X 107

Frecuencia de mutacin:

=

FM= 5 X 107 3.97 X109 = 1.25 X 10-2

Nota: frecuencia de mutacin terica al utilizar un mutgeno = 1 X 10-4 1 X 10-7.

Figura 2. Curva dosis-respuesta de la frecuencia de mutacin en la cepa de E.coli

W3350 con diferentes tiempos de irradiacin UV en segundos.
TRATAMIENTO CON HIDROXILAMINA

Tabla 3.- Resultados de %Sobrevivencia con el tratamiento de Hidroxilamina a

diferentes concentraciones. (Datos tomados del equipo No. 2).

Tratamiento con Hidroxilamina (HA)

Tubo Concentracin Dilucin No. Titulo %Sobrevivencia
(M) Colonias (UFC/ml)
1 0 104 1236 1158 1.41x108 100
105 370 352
2 0.2 10 4
1126 1060 1.20x108 85.10
10 5
207 255
3 0.4 103 1284 1174 1.29x 107 9.14
104 174 211
4 0.6 10 3
688 714 7.6106 5.39
104 123 148
5 0.8 10 3
227 255 2.60x102 0.00018
4 44 46
10

Curva de porcentaje de Sobrevivencia

120

100
%Sobrevivencia

80

60

40

20

0
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9
Concentracin HA(M)

Figura 3.- Representacin grfica del %Sobrevivencia con el tratamiento de

Hidroxilamina a diferentes concentraciones aplicada en Escherichia coli. (Datos
tomados del equipo No.2).

Tabla 4.- Resultados de frecuencia de mutacin con el tratamiento de Hidroxilamina

en una cepa de Escherichia coli W3350. (Datos tomados del equipo No.2).

Tratamiento de Hidroxilamina (HA)

Tubo Concentr Dilucin No. Titulo No. Titulo FM
acin Colonias (UFC/ml) mutant Mutante
molar es s
7
1 0 106 3 3 3.8X10 0
107 2 0 0
10 8
0 0
 2 0.2 104 956 8.0X107 0
105 10 10 0
106 1 1 0
3 0.4 101 Inc. Inc. 9.6X105 0
102 1032 1028 0
103 45 44 0
4
4 0.6 101 Inc Inc 4.6X10 0
102 456 472 1 5 X 101 1.08X10-3
103 64 48 0
5 0.8 101 Inc Inc 7.4X104 0
102 872 712 0
10-3 40 37 0

Curva dosis respuesta del tratamiento con HA

0.000007
Frecuencia de Mutacin

0.000006
0.000005
0.000004
0.000003
0.000002
0.000001
0
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9
Concentracion de HA (M)

Figura 4.- Curva dosis respuesta del tratamiento con Hidroxilamina en una cepa de
Escherichia coli W3350.(datos obtenidos del equipo No.2).

Tabla 5. Comparacin de resultados del porcentaje del sobrevivencia con el

tratamiento de luz UV e Hidroxilamina en una cepa de Escherichia coli W3350.
Tabla 5. Porcentaje de sobrevivencia con tratamiento de HA y luz UV
Equipo Porcentaje de sobrevivencia
HA Concentracin UV Tiempo
(M) (min)
2 0.00018 % 0.8 -- --
3 -- -- 1.04% 60
Tabla 6. Comparacin de resultados del porcentaje de sobrevivencia con el
tratamiento de luz UV e Hidroxilamina en una cepa de Escherichia coli W3350.
Tabla 6. Frecuencia de mutacin con tratamiento de HA y luz UV
Equipo Frecuencia de mutacin
HA Concentracin UV Tiempo
(M) (min)
2 1.08X10-3 0.6 -- --
3 -- -- 1.25 X 10-2 15

Tabla 7. Resultados del proceso de reversin por mutgenos y antibitico en una cepa
de Escherichia coli W3350.
MUTGENO O ANTIBITICO REVERSIN
Estreotomicina -
9aminocridina -
nitrosoguanidina -
5-bromouracilo -
Hidroxilamina -
Agua esteril -

DISCUSIN

Se utiliz una cepa de Escherichia coli (W3350) que tiene como marcador de
seguimiento a la lactosa (Lac +) a la cual se le realizaron dos tratamientos
mutagnicos, uno qumico mediante el uso de hidroxilamina, y otro fsico con la luz
UV.

En el tratamiento fsico se expuso un cultivo de la cepa antes descrita en un medio

lquido y se irradi con Luz UV a diferentes periodos de tiempo, como factor a tomar
en cuenta se debe tener un testigo negativo de prueba el cual es el tiempo cero debido
a que este tuvo no fue irradiado; los tubos utilizados para cada tiempo de irradiacin
se encontraban envueltos con papel aluminio, esto para evitar la reparacin por foto
reparacin que por accin de la enzima phr que elimina los efectos premutagnicos
inducidos con la luz UV, posteriormente se realizaron una serie de diluciones y se
sembr en cajas con agar MacConkey, ya que en este medio las bacterias que sufrieron
una mutacin en el gen que codifica para la Beta-galactosidasa (marcador de a seguir
Lac) se vieron de color blancas ya que al no haber utilizado la lactosa, no la
fermentaban y por tanto no haba vire del indicador mientras que las a si lo
fermentaban se vieron color rosas intenso, sin embargo como parte primordial de este
tratamiento era la observacin del efecto letal de la luz UV, donde esta radiacin es
absorbida por los nucletidos que promueven la formacin de foto productos
(dmeros de pirimidinas y puentes intercatenarios), los cuales impiden la replicacin
del DNA inhibiendo su crecimiento. Este efecto se puede observar en la grfica 1 donde
se observa una disminucin del % de sobrevivencia hasta el tubo 4 con tiempo de
exposicin de 45 segundos, donde la teora marca que la curva de porcentaje de
sobrevivencia debe tener un decaimiento exponencial ideal (Journal of Experimental
Microbiology and Immunology (JEMI)), en este resultado se tienen como posibilidades
de error un tiempo de exposicin menor al indicado porque la luz radiante absorbida
fue menor y por tanto se generaron menores daos a la estructura del DNA
permitiendo a las clulas utilizar mtodos de reparacin exceptuando a la
fotorreactivacin; una alcuota mayor a la que mencionaba el protocolo (500L) que
representa a la poblacin bacteriana para todo el experimento y si esta se encuentra
aumentada, los procesos y resultados posteriores tambin se encontraran
aumentados; una mala realizacin de diluciones y finalmente un etiquetado de tubo
errneo , ya que parece que el tubo 4 correspondera al 2. Como punto final de la
dosis letal se tiene que es de 98.96% y comparado con la dosis letal terica que
menciona que la radiacin UV mata aproximadamente entre un 50-90% de la
poblacin celular este porcentaje se encuentra aumentado pudindose deber a un
tiempo de exposicin de luz UV mayor, donde la luz radiante absorbida es mayor y
por tanto se generaron mayores daos a la estructura del DNA, lo que obliga a las
clulas a utilizar mtodos de reparacin del DNA exceptuando a la fotorreactivacin,
pero siendo estos insuficientes.
Posteriormente se realiz la determinacin del efecto mutagnico en donde el tubo
nmero 1 (15 segundos) de cada tiempo de exposicin fue incubado 37 de 18 hrs y se
le realizaron las diluciones e incubaciones en agar MacConkey, esto para permitir la
expresin de posibles mutantes, obtenindose como resultado una colonia mutante
en el tubo 2 de tiempo de irradiacin de 30 segundos de la dilucin 1X 10-7, donde a
partir de clculos se obtuvo un ttulo de mutantes de 5X 107 , tambin se calcul el
ttulo bacteriano de la poblacin sobreviviente a la radiacin UV y se calcul la
frecuencia de mutacin, que representa a las bacterias mutantes de la utilizacin de
un mutgeno a partir de las bacterias sobrevivientes a. este mismo tratamiento
(mutantes de los sobrevivientes), resultando en 1.25 X 10-2 , observando que este valor
se encuentra elevado pues la frecuencia de mutacin terica al utilizar un mutgeno
es de 1 X 10-4 1 X 10-7 (biloga de los microorganismos, Brock), pero que tiene sentido
debido a que al comparar los porcentajes de sobrevivencia estos se encuentran
elevados, lo que indica una poblacin pequea de bacterias sobrevivientes y esta
poblacin se tienen mayores probabilidades de elevar la frecuencia de mutacin.

En el tratamiento con hidroxilamina se someti la cepa E. coli W3350 a diferentes

concentraciones del mutgeno, se expusieron los microorganismo durante una 30 min
a diferentes concentraciones de HA, envueltos en papel aluminio esto para evitar que
la fotoliasa se active y con esto poder aumentar el ndice de mutacin. El tipo de
mutacin no fue dirigida especialmente a un gen sino a en general a todo el
cromosoma pero se tom como indicador el fenotipo de utilizacin de lactosa en el
medio por lo que las clulas se cultivaron en el agar Mc Conkey por los factores
descritos anteriormente. Cabe seala que no se realiz el procedimiento por lo que se
tomaron los resultados del equipo 2 de porcentaje de sobrevivencia y frecuencia de
mutacin, pues en este equipo si se pudo obtener una colonia mutante y se compar
con lo descrito en la teora, donde la grfica y tendencia de sobrevivencia debe ser
parecida a la de radiacin con luz UV (la curva de porcentaje de sobrevivencia debe
tener un decaimiento exponencial ideal segn Journal of Experimental Microbiology
and Immunology (JEMI)), y como se puede observar este resultado tampoco cumple
con lo terico pues si se observa un decaimiento lineal pero no ideal, pues el
decaimiento lineal cae de manera brusca, se observa que la hidroxilamina tiene un
efecto ms letal con un resultado de 99.99982 % y de manera terica debera ser del
90% este valor elevado pueden ser debido al trabajo del analista; el efecto mutagnico
resulto de 1.08X10-3, y tericamente debe ser de 1 X 10-4 1 X 10-7 (biloga de los
microorganismos, Brock), que pueden deberse al mecanismo de accin de la
hidroxilamina que acta selectivamente sobre los residuos de citosina formando
citosina oxima, que se aparearan con una timina generando transiciones
unidireccionales de CG a TA.

Se realizaron dos cuadros comparativos de los tratamientos empleados, en la tabla 6

se tiene el porcentaje de sobrevivencia por radiacin de luz UV a diferentes tiempos
de exposicin y por hidroxilamina a diferentes concentraciones, resultando que la HA
es ms letal en una cepa de E. coli, en la tabla 6 se tiene la frecuencia de mutacin por
radiacin de luz UV a diferentes tiempos de exposicin y por hidroxilamina a
diferentes concentraciones en la cual se observa que la luz UV tiene un mayor efecto
mutagnico, los resultados se podran deber a que en el genoma de E. coli se
encuentran muchos nucletidos de Timina adyacentes o cercanos y dado que la luz
UV tiene el efecto de generar dmeros de timina, es ms probable inducir un dao en
los genes que tiene como el estudiado que fue la lactosa.

Como parte final, despus de haber realizado la modificacin del fenotipo en la cepa,
se trat por medio de una reversin en donde la cepa mutante regrese nuevamente a
su estado silvestre restaurando su fenotipo nativo de Lac- a Lac+, con ayuda de otros
mutgenos y un antibitico (estreptomicina), cuyos resultados arrojaron que no hubo
procesos de reversin para ningn mutgeno y antibitico utilizado, esto es debido al
tiempo de incubacin de ms de una semana por cuestiones externas, de manera
terica se podra haber presentado revertantes en la 9-aminoacridina debido a que es
un mutgeno de tipo intercalante, que se inserta la molcula plana entre dos pares de
bases y genera microinserciones y microdeleciones ; el 5-bromouracilo un mutgeno
anlogo de base de la timina, sufre un cambio tautomrico desde su forma ceto
normal a la forma enol con mucha mayor frecuencia que una base normal, la forma
enol establece puentes de hidrgeno como la citosina y dirige la incorporacin de
guanina en vez de la de adenina, lo que genera transiciones bidireccionales de TA a
CG; y la nitrosoguanidina que es un agente alquilante bifuncional que entrecruza las
cadenas de DNA y genera mutaciones puntuales y deleciones, las cuales pueden ser
en el genotipo codificante de la lactosa y los nicos que no debe presentar reversin
es la hidroxilamina ya que es una agente qumico modificador de bases que es
unidireccional CG a TA y la estreptomicina por que impide el desarrollo de la clula
(debido a que la cepa tiene como marcador que es estreptomicina sensible)
modificando la subunidad 30S del ribosoma.

CONCLUSIN
La frecuencia de mutacin aumenta con forme la dosis del mutgeno es ms alta.

Los mutgenos fsicos y qumicos tienen un efecto letal y mutagnico.

La hidroxilamina es un mutgeno que forma transiciones en el DNA.

La radiacin UV tiene como efecto mutagnico la induccin de transiciones,

transverciones, deleciones e insercisiones.

La radiacin UV es ms eficiente para producir una mutacin en un organismo.

Un tratamiento con hidroxilamina es ms letal para una de cepa de Escherichia coli.

BIBLIOGRAFA

Klug, W., Cummings, M., Spencer, C. and Palladino, M. (2013). Conceptos de

genetica. Madrid: Pearson Educacion.
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Journal of Experimental Microbiology and Immunology (JEMI). [internet].
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Klug, W.S., Cummings, M.R., Spencer, C.A., (2006).. Conceptos de Gentica.

Madrid: PEARSON EDUCACIN. (8a edicin).