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HPLC

1-Qu es la cromatografa de lquidos?

La historia de la cromatografa lquida (CL) se inici a principios del siglo XX. En 1906, un botnico
ruso Mikhail Tswett invento CL para separar varios pigmentos de plantas. El inyecto el extracto de
una planta y ter de petrleo a travs de una columna de vidrio lleno de carbonato de calcio. Dado
que esto fue hecho en una columna de vidrio, fue capaz de observar los cambios dentro de la
columna. Al principio, slo vio una capa de pigmento en la parte superior de la columna (figura
1.a). Pero a medida que pasa el tiempo, el pigmento se divide en cuatro capas de colores
diferentes (Figura 1.b). La investigacin descubri ms tarde que las cuatro capas eran (i) de color
verde azulado, clorofila a, (ii) de color verde amarillento, clorofila b, (iii) de color amarillo, xantina,
y (iv) de color naranja; caroteno. Todo el proceso de separacin dur varias horas y por lo tanto no
era un mtodo muy prctico. Este tiempo largo de anlisis fue una de las razones que la CL no se
convirti en una herramienta analtica popular hasta 1970, medio siglo despus de la invencin de
Mikhail Tswett.

A continuacin se presenta algunos de los trminos utilizados en el anlisis de cromatografa. La


cromatografa es una tcnica de separacin y la palabra cromatografa se origin de la
palabra chroma que significa color y graphein que significa escribir. Cromatgrafo es el equipo
de separacin y cromatograma es el grfico obtenido en el anlisis.

Tcnica Analtica

Cromatografa Cromatografo Cromatograma

Figure 2. Imgenes de cromatografa, chromatografo, and cromatograma.

2. Qu es el HPLC?

HPLC significa cromatografa lquida de alto rendimiento. Antes que el HPLC est disponible, el
anlisis de LC era llevado a cabo por el flujo gravitacional del eluyente (el disolvente utilizado para
el anlisis de CL), lo que requiere varias horas para que el anlisis sea completado. Incluso las
mejoras aadidas ms tarde fueron capaces solo de acortar el tiempo de anlisis un poco. Los
sistemas CL iniciales se llaman cromatografa de baja presin o cromatografa en columna.

En 1970 en los EE.UU., Jim Waters fund Waters Corporacin y comenz a vender instrumentos
de HPLC. Esto promovi el uso de HPLC en las reas de anlisis prcticos. Los sistemas de CL que
Waters Corporation desarroll utilizan bomba de alta presin que genera un rpido flujo de
eluyente, y por lo tanto result en una mejora dramtica en el tiempo de anlisis. Comparados
con la cromatografa de baja presin los nuevos tipos se llamaron cromatografa lquida de alta
presin. Por lo tanto, se sola pensar que HPLC significa cromatografa lquida de alta presin, sin
embargo hoy en da es entendido que las siglas HPLC se refieren a Cromatografa Lquida de Alto
Rendimiento. Otro gran cambio a partir de la fecha de Tswett fue los mtodos de adquisicin de
datos. En lugar de observar los cambios de las capas con los ojos, se acopl el sistema detector y la
informacin de datos fueron grabados en hojas de papel. Si tuviramos que demostrar el
resultado del anlisis de Tswett sera un grfico (cromatograma), como la figura 3.

1. Naranja

2. Amarillo

3. Amarillento

4. Verde Azulado

Figure 3. Representacin del anlisis LC de Tswett

Inicialmente, el Sistema HPLC se le refera como Waters Corporations System. Aun Ahora, Waters
Corporation es el pionero de HPLC, pero hay varias otras empresas que fabrican y venden
sistemas de HPLC. Tcnicamente Hablando, la Palabra CL representa toda la cromatografa de
Lquidos, incluyendo CL de baja presin, sin embargo, la mayora de los sistemas de CL utilizada en
estos das son HPLC lo que a menudo la palabra LC es utilizada para referirse al HPLC.

3. Los Componentes de HPLC

Tpicamente el sistema HPLC consta de lo siguiente (Figura 4). Los detalles de cada uno se explican
abajo.
Figure 4.

3.1 Bomba

En la primera etapa del desarrollo del HPLC, la bomba fue la parte ms importante del sistema. El
desarrollo del HPLC se puede decir que fue dado por el desarrollo del sistema de bombeo. La
bomba se colocaba en lo ms alto del sistema CL y generaba un flujo del reservorio del disolvente
al sistema. En esta etapa el requisito ms importante del sistema era poder generar una alta
presin. Sin embargo, hoy en da, la generacin de alta presin es normal y lo que ms preocupa
ms hoy en da es proporcionar una presin constante en cualquier condicin, para proporcionar
un caudal controlable y reproducible dado que el cambio en la proporcin del flujo puede influir el
anlisis en gran medida. La mayora de las bombas utilizadas en los sistemas LC actuales generan
el flujo con un movimiento de vaivn de un pistn de motor (bombas de pistn). Debido a este
movimiento del pistn, se produce pulsos. Ha habido grandes mejoras del sistema para reducir
esta pulsacin y las bombas recientes crean un pulso muy inferior a las antiguas bombas. Sin
embargo, los anlisis actuales requieren una sensibilidad muy alta para cuantificar una pequea
cantidad de analitos, e incluso un pequeo cambio en la velocidad del flujo puede influir en el
anlisis. Por lo tanto, las bombas necesarias para el anlisis de alta sensibilidad tienen que ser muy
precisas.

3.2 Inyector

Un inyector se coloca al lado de la bomba. El mtodo ms simple es utilizar una jeringa, y la


muestra se introduce en el flujo de eluyente. Ya que la precisin de la medicin por CL tiene
mucho que ver con la reproducibilidad de la inyeccin de la muestra, el diseo de los inyectores es
un factor importante. El mtodo de inyeccin ms utilizado se basa en lazos de muestreo. El uso
de muestreador automtico (auto-inyector) del sistema tambin es ampliamente utilizado ya que
permite una serie de inyecciones repetitivas en un tiempo programado.
3.3 Columna

La separacin se lleva a cabo dentro de la columna, por lo tanto, se puede decir que la columna es
el corazn de un sistema de CL. La teora de la cromatografa en columna no ha cambiado desde la
poca de Tswett, sin embargo ha habido una continua mejora en el desarrollo de la columna. Las
columnas recientes suelen estar preparados en una carcasa de acero inoxidable, en lugar de
columnas de vidrio utilizadas en el experimento de Tswett. En general, el material de relleno que se
utiliza es de gel de slice o de polmeros en comparacin con el carbonato de calcio utilizado por
Tswett. El eluyente utilizado para la CL vara de cido a solventes bsicos. La mayora de la cubierta
de la columna es de acero inoxidable y es tolerante a una gran variedad de disolventes. Sin
embargo, para el anlisis de algunos analitos como las biomolculas y los compuestos inicos, el
contacto con el metal no es deseable, por lo tanto columnas con cubierta de politer ter cetona
(PEEK) se utiliza en su lugar.

4.4 Detector

La separacin de los analitos se realiza dentro de la columna, mientras que un detector se utiliza
para observar la separacin obtenida. La composicin del eluyente es consistente cuando no hay
analito est presente, en cambio la presencia del analito cambia la composicin del eluyente. Lo que
el detector hace es medir estas diferencias. Esta diferencia se observa como una forma de seal
electrnica. Hay diferentes tipos de detectores disponibles. Diferentes tipos detector y se explican
en la leccin 6.

Registracin de Datos

3.5 El cambio en eluyente detectado por un detector es una forma de seal electrnica, y as no es
visibles a nuestros ojos. En otros tiempos, la pluma- papel-registrador grfico se utilizaba muy
popularmente. Hoy en da, una computadora con un posesor de base de datos (integrador) es ms
comn. Hay varios tipos de procesadores de datos, e incluye un sistema simple que consiste en
construir la impresora y el procesador de textos, y un tipo de computadora personal que consta de
monitor, teclado e impresora. Tambin hay programas que estn diseados especficamente para
el sistema LC. Ofrece no slo la adquisicin de datos, pero tambin caterticas como mximo de
ajuste, la correccin de lnea base, el clculo automtico de la concentracin, la determinacin del
peso molecular, etc Los componentes introducidos hasta el momento son los fundamentos del
sistema LC. A continuacin se presentan algunos equipos opcionales se utiliza con el sistema bsico
de LC.

3.6 Desgasificador

El eluyente utilizado para anlisis con LC puede contener gases como oxgeno que son no visibles a
nuestros ojos. Cuando el gas est presente en eluyente, este se detecta como un ruido y causas una
lnea base inestable. Generalmente los mtodos que se utilizan incluye el burbujeo (burbujeo de gas
inerte), uso de bomba de vacio, sistema destilacin, y / o calentamiento y agitacin. Sin embargo,
estos mtodos no son convenientes cuando el disolvente se deja por un perodo de tiempo
determinado (por ejemplo, durante un anlisis largo). El desgasificador usa unos tubos de
membrana de polmero especial para eliminar los gases. Los numerosos pequeos poros en la
superficie del tubo de polmero permite que el aire pase a travs mientras que previene cualquier
otro lquido pasar a travs del poro. Mediante la colocacin de esta tubera bajo el contenedor de
baja presin, crea las diferencias de presin dentro y fuera de la tubera (mayor en el interior del
tubo). Esta diferencia hace que el gas disuelto se mueva a travs de los poros y eliminar el gas. En
comparacin con el tipo clsico de desgasificacin por lotes, el desgasificador se puede utilizar on-
line, es ms conveniente y eficiente. Muchos de los nuevos sistemas HPLC contienen un
desgasificador.

3.7 Horno de columna

La separacin con LC es a menudo muy influenciada por la temperatura de la columna. Con el fin de
obtener resultados repetibles, es importante mantener una temperatura constante. Tambin para
algunos anlisis, como el azcar y los cidos orgnicos, se puede obtener mejor resolucin a
temperatura elevada (50 ~ 80 C). Tambin es importante mantener una temperatura estable para
obtener resultados repetibles, incluso cuando se analiza a una temperatura de ambiente. Hay
posibilidades de que los diferentes cambios de temperatura haga que los resultados de la
separacin sean diferentes. Generalmente las columnas se mantienen dentro del horno de columna
(calentador columna).

3.8 Otro tipos de Cromatografa

Otro miembro de la cromatografa, que se utiliza a menudo como el LC, es la cromatografa a gas
(GC). Mientras LC utiliza eluyente (flujo generado por un sistema de bombeo), GC utiliza el gas (gas
portador), siempre desde un tanque de gas, por lo que no requiere sistema de bombeo. Por lo tanto,
el sistema de GC es ms simple que el sistema LC y por esa razn, era ampliamente disponible antes
de que el sistema LC llegara a ser popular. En ese momento, palabra cromatografa se refiere al GC.
La sencillez del sistema GC es una ventaja pero tambin una desventaja. Las muestras que se
analizaron tienen que estar en forma gaseosa antes de ser introducido en el flujo del gas portador.
Por lo tanto, si la muestra original esta en forma gaseosa, el GC es una herramienta conveniente. Sin
embargo, la mayora de las muestras son en forma lquida o slida y requiere calentamiento a alta
temperatura para convertirlo en gas. Algunos analitos se alternan por el calor, por lo que el mtodo
de GC no es ideal para ese caso. Problema relacionado es que GC tiene un lmite superior para el
anlisis de compuestos de gran peso molecular. En comparacin, las muestras lquidas pueden ser
analizadas directamente por LC. Adems, si la muestra slida puede ser disuelta en un solvente, esta
puede ser analizada por LC. Algunas muestras son insolubles en agua, pero la mayora de ellos son
solubles en disolventes orgnicos, hay una alta probabilidad de que podemos encontrar un solvente
que disuelve la muestra. Por lo tanto, LC se puede utilizar a temperatura de ambiente (es decir, sin
causar alteracin de la sustancia analizada) para una amplia gama de anlisis. Esto hizo que el
mtodo de LC pueda ser ms popular que el mtodo de GC. Hay otros tipos de cromatografa como
la cromatografa en capa fina, super-crtica cromatografa de fluidos, papel, etc, pero sus usos son
an menos populares que el GC