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HPLC Principe et appareillage

Extrait du Biotechnologie & Biologie et Physiopathologie humaine - Acadmie de Rouen


http://biotech.spip.ac-rouen.fr/spip.php?article9

HPLC Principe et appareillage


- Ressources pdagogiques - Biochimie et Bio molculaire -

Date de mise en ligne : mercredi 20 janvier 2010

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HPLC Principe et appareillage

1. La chromatographie en phase liquide


La chromatographie permet la sparation ou la purification d'un ou de plusieurs composs d'un mlange en vue de
leur identification et de leur quantification.

La chromatographie en phase liquide a permis de raliser des analyses qui n'taient auparavant pas possible avec
les techniques sur couche mince ou en phase gazeuse.

A l'origine la chromatographie en phase liquide se faisait sur des colonnes en verre. Le liquide traversait la phase
stationnaire par gravit ou sous faible pression. Puis pour augmenter le dbit, des manipulations ont t ralises
sous pression plus forte. C'est ce que l'on a appelr la chromatographie liquide sous haute pression (HPLC). Trs
rapidement le P de pression est devenu le P de performance lorsque l'on a optimis la technique (diminution de la
taille de particules de la phase stationnaire, rgularit de cette phase...).

Principe :

Les composs sparer (soluts) sont mis en solution dans un solvant. Ce mlange est introduit dans la phase
mobile liquide (luant). Suivant la nature des molcules, elles interagissent plus ou moins avec la phase stationnaire
dans un tube appel colonne chromatographique.

La phase mobile pousse par une pompe sous haute pression, parcourt le systme chromatographique.

Le mlange analyser est inject puis transport au travers du systme chromatographique. Les composs en
solution se rpartissent alors suivant leur affinit entre la phase mobile et la phase stationnaire.

En sortie de colonne grce un dtecteur appropri les diffrents soluts sont caractriss par un pic. L'ensemble
des pics enregistrs est appel chromatogramme.

2. Notions fondamentales

La phase stationnaire est un support plus ou moins poreux recouvert d'un gel (liquide greff) qui a les proprits
dsires pour retenir les molcules de soluts.

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La phase mobile ou luant est un liquide qui entrane les soluts travers la colonne.

2.1. Notion de temps

t0 est le temps du dbut de l'injection


Le temps mort tm est le temps mis par un compos non retenu par la phase stationnaire pour traverser la
colonne (temps pass dans la phase mobile)
Le temps de rtention tr est le temps mis par un solut pour traverser la colonne. C'est le temps pass dans la
phase stationnaire et dans le volume mort de la colonne. Ce temps est caractristique d'un solut dans des
conditions d'analyse donne. La surface du pic est fonction de la quantit du constituant dont il est la trace.
Le temps de rtention rduit t'r est le temps pass par un solut dans la phase stationnaire, soit :

2.2. Notion de concentration

Le coefficient de partage K :

A un instant donn, le solut est la concentration Cm dans la phase mobile et Cs dans la phase stationnaire. Leur
rapport l'quilibre est appel coefficient de partage K

Ce coefficient est fonction de 3 types d'affinits :

celle entre le solut et la phase mobile


celle entre le solut et la phase stationnaire
celle entre les phases mobile et stationnaire

Le facteur de capacit K' est le rapport de la quantit d'un solut dans la phase stationnaire et dans la phase
mobile.

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Vs : volume de la phase stationnaire

Vm : volume de la phase mobile ou volume mort

K' est aussi le rapport du temps pass par un solut dans la phase stationnaire sur le temps pass par ce mme
solut dans la phase mobile.

2.3. Notion d'efficacit

La largeur d'un pic est caractristique de l'efficacit de la sparation : plus le pic est fin plus la chromatographie est
efficace. L'efficacit est mesure par :

le nombre de plateaux thoriques Nth

tr : temps de rtention

w 1/2 : largeur du pic mi-hauteur

Remarque :

Nth est trs utilis en HPLC. Pourtant il serait plus judicieux d'utiliser Neff (nombre de plateaux effectifs) puisqu'il
dpend vraiment du temps pass dans la phase stationnaire.

Exprimentalement tm est difficile dterminer d'ou l'utilisation de Nth.

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La hauteur quivalente un plateau thorique : HEPT, qui est dfinit comme :

L : Longueur de la colonne

Nth : Nombre de plateaux thoriques

Quels sont les facteurs d'largissement des pics ?

La diffusion turbulente : l'largissement est expliqu par le fait qu'il existe diffrents chemins parcourus par les
molcules d'un solut. La longueur des chemins n'tant pas la mme, elles ne mettent pas toutes lemme temps
pour traverser la colonne : le pic s'largit. Ce phnomne est fonction des particules et de la rgularit du
remplissage.
La rsistance au transfert de masse : l'largissement est expliqu par l'accumulation de phase mobile dans les
infractuosits du support. Les molcules qui y diffusent vont moins vite que celle qui n'y diffusent pas.
La diffusion longitudinale. Ce phnomne diminue plus la vitesse de la phase mobile augmente. Dans la pratique
cette diffusion est ngligeable en HPLC.

En conclusion l'efficacit calcule d'une chromatographie, reprsente par la HEPT, est fonction de la vitesse de la
phase mobile donc du dbit, et de la qualit (rgularit, remplissage) de la phase stationnaire.

2.4. Qualit de la sparation

La slectivit (a)

Elle est dfinit comme le rapport des temps de rtention rduits

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a est toujours > 1 car on choisit t'rB > t'rA

La rsolution (R)

Elle quantifie la qualit de la sparation en caractrisant le fait qu'il y ait ou non chevauchement de 2 pics contigus.

R < 1 : mauvaise rsolution

1 < R < 1,4 : rsolution acceptable

1,4 < R < 1,6 : rsolution optimale

R > 1,6 : rsolution trop bonne car le temps d'analyse est rallong

Remarques :

Si les pics sont gaussiens w0 = 1,7 w 1/2


Il est parfois utile d'exprimer cette rsolution en fonction de la slectivit et de l'efficacit du dernier des 2 pics
tudis

2.5. Notion de pression

A l'intrieur d'une colonne la phase mobile frotte sur les parois de la colonne mais aussi sur les particules de phase
stationnaire. Ces frottements dfinissent la rsistance l'coulement.

Les particules de phase stationnaire sont sphriques. Si l'on divise leur diamtre par 10, on diminue leur surface d'un
facteur 100 et leur volume d'un facteur 1000. On peut donc placer dans la colonne 1000 fois plus de particules et
donc augmenter de 10 fois la surface en contact avec la phase mobile. La rsistance l'coulement est donc
augmente.

En consquence, pour maintenir le dbit constant dans la colonne il faut augmenter la pression plus la granulomtrie
de la phase stationnaire est faible.

En HPLC on travaille, en tte de colonne, des pressions entre 20 et 150 bars.

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3. Les diffrents modes de sparation


Il existe diffrents modes de sparation en chromatographie en phase liquide :

l'adsorption
le partage (80% des sparations)
l' change d'ions
l'exclusion

Les trois premiers types utilisent la polarit des soluts pour les sparer.

4. Polarit et chromatographie
4.1 Polarit d'une molcule

La polarit d'une molcule est une notion intrinsque. Certaines molcules tant dissymtriques, les lectrons ne
sont pas uniformment rpartis autour d'elles. De ce fait il existe un moment dipolaire permanent qui cre un champ
lectrique local. Ces molcules sont dites polaires.

4.2. Interactions entre molcules

Dans la nature, les molcules ne sont pas isoles. Entre elles il existe diffrents types d'interactions :

les interactions dilectriques ou ioniques


les liaisons " hydrogne "
les forces de Van Der Waals

4.3. Notion de polarisabilit

Sur certaines molcules isoles qui ne possdent pas de moment dipolaire permanent, un champ lectrique peut
crer un champ dipolaire induit, en dformant les orbites lectroniques ou en modifiant la position relative des
atomes. Ces molcules sont dites polarisables.

4.4. Application la chromatographie

Il existe des chelles de polarit, mais de manire on utilise la notion de polarit comme une donne comparative
entre molcules. On dit que tel compos est plus polaire ou moins polaire qu'un autre. De mme on dit que la phase
mobile et la phase stationnaire sont polaires, peu polaires ou apolaires.

Pour qu'il y ait sparation chromatographique de composs, il faut que leurs molcules interagissent de manires
diffrentes avec au moins une des phases (stationnaire et mobile). Ces phases doivent avoir des polarits
diffrentes.

On peut appliquer la rgle "qui se ressemble s'assemble" l'ensemble solut - phase stationnaire.

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Si la phase stationnaire est polaire, les composs polaires seront plus retenus que les composs non polaires.
Si la phase stationnaire est apolaire, les composs apolaires seront plus retenus que les composs polaires.

Polarit de phase

A l'origine, les colonnes taient remplies de silice (phase stationnaire polaire). Elle doit sa polarit aux groupements
silanols Si-OH qui sont polaires. Pour que la sparation soit efficace, la phase mobile doit alors tre peu polaire.
L'ensemble "phase stationnaire polaire et phase mobile peu polaire" forme la chromatographie polarit de phase
normale.

Par la suite, les particules de silice (support) ont t enrobes de paraffine en C 18 pour faire une phase apolaire.
Dans ce cas, pour que la sparation soit efficace, la phase mobile est polaire (gnralement base d'eau).
L'ensemble "phase stationnaire apolaire et phase mobile polaire" forme la chromatographie polarit de phase
inverse.

Aujourd'hui, les phases stationnaires sont greffes chimiquement pour la plupart sur de la silice sphrique et
calibre.

Composition de la phase mobile

Dans la pratique, chaque sparation ncessite une polarit de la phase mobile qui lui est propre. Chaque solvant
ayant une polarit donne, on ajuste la polarit globale de la phase mobile en mlangeant plusieurs solvants
miscibles. A cette composition de phase mobile correspond une force luante qui caractrise le pouvoir d'entraner
les soluts.

Il faut ajuster la force luante en fonction des soluts sparer. Pour cela, on peut utiliser un solvant pur ou un
mlange de solvants : on dit travailler en mode isocratique.

Dans certains cas il est utile de faire varier la force luante au cours de l'analyse. Si le mlange de diffrents
solvants varie au cours de la sparation, on ralise alors un gradient d'lution, car la meilleure force luante pour le
dbut de l'analyse n'est pas forcment adapte pour une bonne sparation des soluts sortant en fin de
chromatogramme.

Ces 2 modes sont utiliss pour des analyses en chromatographie polarit de phase normale ou inverse.

5. Appareillage

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La phase mobile est pompe partir d'une bouteille et parcourt en permanence le chromatographe : l'injecteur, la
colonne dans le four et le dtecteur. La temprature du four est maintenue constante.

Le signal du dtecteur est amplifi et enregistr.

5.1. Rservoir de la phase mobile (solvant)

Le plus souvent ce rservoir est une bouteille en verre dans lequel plonge un tube avec une extrmit filtrante en
tflon. S'il est ncessaire le dgazage peut se faire par agitation puis conservation du solvant sous atmosphre
d'hlium.

5.2. Pompe

Elle dlivre en continu la phase mobile. Elle est dfinit par la pression qu'elle permet d'atteindre dans la colonne, son
dbit, et la stabilit du flux. Actuellement les paramtres d'une pompe sont

* dbit : 0,01 10 mL/min


* stabilit < 1% (<0,2% pour des chromatographies d'exclusion diffusion)
* pression maximale > 350 bars

Certaines sont pilotes par informatique (bien utile lors de l'utilisation de gradient d'lution).

5.3. Injecteur

Le type d'injecteur le plus couramment utilis comporte une vanne boucle d'chantillonnage d'une capacit fixe
(10, 20, 50 L...). Cette boucle permet d'introduire l'chantillon sans modifier la pression dans la colonne.

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Vanne boucle d'chantillonnage

Elle possde 2 positions. La premire permet le remplissage de la boucle d'injection de volume fixe (load), la
seconde permet la mise en circulation de l'chantillon dans le systme chromatographique (inject).

Le remplissage de la boucle d'injection se fait l'aide d'une seringue.

5.4. Colonne

En mode analytique, les colonnes en inox ont gnralement un diamtre interne de 4,6mm. La longueur est de 5,
10, 15, ou 25cm. Le remplissage (en silice, silice greffe ou particules polymriques) a une granulomtrie de 3, 5, ou
10m. Le diamtre interne d'une colonne est usuellement de 4 ou 4,6 mm. Si des substances pures doivent tre
collectes en fin de chromatogramme des colonnes de gros diamtre seront ncessaires.

Paramtres de colonne utilise en HPLC de phase rverse

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5.5. Dtecteurs

Le dtecteur suit en continu l'apparition des soluts. Pour dtecter, on utilise diffrents phnomnes
physico-chimiques. Le signal obtenu est enregistr en fonction du temps. Gnralement, on compare le signal
obtenu pour la phase mobile et le solut celui de la phase mobile seule.

Le dtecteur le plus utilis en CLHP est un spectrophotomtre d'absorption UV-visible (190-600 nm) reli la sortie
de colonne.

Il existe d'autres dtecteurs :

rfractomtre diffrentiel
UV barrette de diodes
lectrochimique
fluorimtrique...

ainsi que diffrents types de couplage :

Spectromtrie infrarouge
Spectromtrie de masse
Rsonance Magntique Nuclaire...

5.6. Intgrateur

La chromatographie est une mthode de sparation utilise en vue d'un dosage. Il faut donc avant tout chercher
sparer correctement les pics avant de les intgrer. Une intgration consiste mesurer la surface sous un pic.

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La dtection d'un pic chromatographique par l'intgrateur, dpend de 2 paramtres :

* la largeur attendue des pics


* le seuil d'intgration (sensibilit)

La largeur de pic est peu prs prvisible en fonctions de la technique d'analyse et des conditions opratoires. Elle
dtermine la frquence d'chantillonnage du signal. Le pic est alors dcoup en tranches. Le seuil d'intgration est la
valeur du signal partir de laquelle le calculateur repre un dbut de pic.

Pour en savoir plus : http://hplc.chem.shu.edu/HPLC/index.html

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