Apoptosis: un paradigma funcional para la muerte programada de clulas vegetales inducida por una fitotoxina

selectiva para el husped y invocada durante el desarrollo

Las toxinas AAL selectivas para el husped segregadas por Alternaria alternata f sp lycopersici son determinantes qumicos
primarios en la enfermedad del canario de alternaria del tomate. Las toxinas AAL son miembros de una nueva clase de
micotoxinas anlogas a esfinganina que causan la muerte celular tanto en animales como en plantas. Aqu, informamos de la
deteccin de estereotipos distintivos de apoptosis durante la muerte celular inducida por estas toxinas en el tomate. Se
observaron escaleras de ADN durante la muerte celular en toplastos y fololos de tomate tratados con toxina. La intensidad
de las escaleras de ADN fue potenciada por Ca2 e inhibida por Zn2. La progresiva delimitacin del ADN fragmentado en
cuerpos distintos, coincidiendo con la aparicin de escaleras de ADN, tambin se observ durante la muerte de los
protoplastos de tomate tratados con toxina. El anlisis in situ de las clulas que mueren durante el desarrollo tanto en tapones
de raz de cebolla como en elementos traqueales de hoja de tomate revel fragmentacin del ADN localizada en las clulas
moribundas, as como la formacin adicional de cuerpos de Ilke de apoptosis en clulas de tapa raz desprendibles. Se
concluye que los elementos fundamentales de la apoptosis, como se caracteriza en los animales, se conservan en las plantas.
El proceso apopttico se puede expresar durante algunas transiciones de desarrollo y es el proceso funcional por el cual se
forman lesiones sintomticas en la enfermedad del canario de alternaria del tomate. Pueden usarse micotoxinas anlogas de
esfinganina para caracterizar ms vas de sealizacin que conduzcan a la apoptosis en plantas.

INTRODUCCION
Una cuestin no resuelta en la biologa vegetal es si las vas de transduccin de seal conservadas conducen a la muerte
celular por cambios metablicos especficamente ordenados durante el desarrollo normal, el estrs ambiental o el ataque
patgeno. El concepto de un programa funcionalmente conservado y dirigido por genes para el mantenimiento de la
homeostasis celular que depende de la muerte celular localizada se establece en sistemas animales, incluyendo humanos,
nematodos e insectos (Tomei y Cope, 1991, 1994, Gerschenson y Totello , 1992, Hengartner y Horvitz, 1994). Este proceso
ordenado de muerte celular programada (pcd), conocido como apoptosis, depende de la participacin activa de la clula
moribunda y est regulado por una serie de genes bien caracterizados (Schwartzman y Cidlowski, 1993; Williams y Smith,
1993). Funcionalmente, la apoptosis es una forma distinta de PCD que difiere de la muerte o necrosis degenerativa en su
naturaleza y significacin biolgica (Martin, 1993; Vaux et al., 1994, Kerr y otros, 1995, Steller, 1995). Aunque la apoptosis
es un proceso en el que la clula dirige su propia muerte, la necrosis es esencialmente lo contrario. Es el resultado de
graves cambios perjudiciales en el medio ambiente de las clulas afectadas y no es una forma de muerte celular activa
dependiente de genes (Kerr et al., 1995).
La apoptosis, invocada en el desarrollo morfolgico y en circunstancias en las que las clulas son innecesarias o que de otro
modo seran perjudiciales para el organismo (Tomei y Cope, 1991), ha sido legitimada cientficamente por estudios genticos
y moleculares del proceso (Alison y Sarraf, 1992). Williams y Smith, 1993, Whyte y Evan, 1995). Aunque la apoptosis puede
haber evolucionado por razones morfogenticas y de desarrollo, parece representar tanto un efector positivo contra la
enfermedad como un objetivo de supresin activa por muchos patgenos exitosos (Savill, 1994; Vaux et al., 1994). La
apoptosis tambin puede ser invocada como un programa de suicidio despus de la aparicin o desaparicin de muchas
seales diferentes, incluyendo patgenos y toxinas (Corcoran et al., 2003). al., 1994). Por el contrario, en las situaciones de
enfermedad en las que se produce la inmortalizacin de una clula, la expresin de diversos proto-oncogenes y genes
codificados por virus que suprimen activamente la apoptosis parece estar generalizada (Carter et al., 1993; , 1994). En cada
uno de estos casos, est claro que mltiples vas de sealizacin distintas estn involucradas en la induccin de apoptosis,
pero finalmente hay convergencia en los eventos seminales que dan lugar al fenotipo de apoptosisHay una serie de marcas
morfolgicas y bioqumicas de apoptosis en animales (Tomel y Cope, 1991, 1994). Animal

Las clulas sometidas a apoptosis exhiben retraccin, prdida de contacto clula a clula en tejidos organizados y
fragmentacin ordenada del ADN nuclear en sitios internucleosmicos. El ADN fragmentado puede entonces organizarse en
cuerpos enlazados a membrana claramente definidos, denominados cuerpos apoptticos. En clulas animales, estos cuerpos
apoptticos son absorbidos por clulas adyacentes y degradados en cuestin de minutos a horas (Bursch et al., 1990). La
escisin internuctoosmica del ADN es catalizada por una endonucleasa endgena dependiente de Ca2 que genera
fragmentos de 180 pb y mltiplos de estas unidades, los cuales se resuelven por electroforesis en gel como patrn escalonado
de ADN que corresponde a los fragmentos nucleosmicos (Collins et al. 1992, Cohen et al., 1994). La fragmentacin del ADN
durante la apoptosis tambin puede detectarse in situ mediante reactivos que reaccionan con los hidroxilos 3 'expuestos en
las unidades nucleosmicas (Gavrieli et al., 1992, Gold et al., 1994, Li et al., 1995). El procedimiento de ensayo implica el
marcado final de los fragmentos de ADN por la desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) con UTP conjugado con un
marcador detectable (Gorczyca et al., 1993).

Cambios fenotpicamente anlogos impuestas por la muerte en la ho meostasis ocurren en las plantas tanto durante el
desarrollo (Woodson et al., 1992, O'Neill et al., 1993, Zhang y O'Neill, 1993, Chasan, 1994, Smart, 1994) como en respuesta
a patgenos (Keen, 1990, Lamb, 1994). Recientemente, se ha considerado especulativamente que la muerte celular asociada
a la resistencia hipersensible en varias interacciones incompatibles entre plantas y microbios puede seguir un patrn de
muerte similar a la apoptosis en animales (Bachmann et al., 1990, Dietrich et al. , 1994, Greenberg et al., 1994, Lamb, 1994,
Vaux et al., 1994, Mittler et al., 1995). Debido a que se sabe mucho sobre el proceso y los genes moduladores en los animales,
la bsqueda de homlogos funcionales de estos genes en las plantas puede resultar til si los aspectos del proceso se han
conservado en las plantas como parecen estar en los animales. Los signos estereotpicos de la apoptosis, incluyendo
escaleras de ADN y cuerpos apoptticos (Wyllie, 1995), y homlogos de genes que muestran que regulan la apoptosis en
animales no se han reportado en plantas. Sin embargo, los informes recientes, basados en la deteccin in situ de la
fragmentacin del ADN en clulas moribundas, presumiblemente como resultado de la divisin especfica de endonucleasas
del ADN nuclear en sitios internucleosmicos durante la diferenciacin del xilema y la expresin de resistencia a
enfermedades, han sugerido que un evento inicial consistente con pcd en animales puede ocurrir en plantas (Mittler et al.,
1995).

No se han caracterizado las bases metablicas y genticas de la muerte localizada funcionalmente significativa de clulas
vegetales asociadas con la enfermedad necrotrfica (susceptibilidad), la reaccin hipersensible (HR) (resistencia), la
reproduccin, la diferenciacin tisular y la senescencia natural (vase Ryerson y Heath, 1996). Hemos estado estudiando el
proceso de muerte celular en plantas que experimentan una respuesta susceptible a patgenos para identificar productos
gnicos que pueden modular el proceso. Esto es parte de un esfuerzo a largo plazo para detectar objetivos potenciales para
la ingeniera gentica de nuevos genes de resistencia mediante la modificacin de la expresin de los genes del husped
que facilitan o no bloquean la susceptibilidad. Uno de los sistemas que hemos estado usando para buscar marcadores
genticos y celulares de la muerte celular dependiente de la enfermedad es la enfermedad de la viruela del tallo de
Alternaria (Grogan et al., 1975, Gilchrist y otros, 1992, 1995, Moussatos et al., 1993a , 1993b, 1994) de tomate causado por
Alternaria alternata f sp Iycopersici. Las caractersticas clave de este sistema incluyen (1) la expresin por el patgeno de
las toxinas selectivas del husped (toxinas AAL) que son los terminales primarios de la enfermedad (Slier y Giichrist, 1983)
y (2) la expresin por el husped del gen Asc (canario del tallo de Alternaria) que determina la susceptibilidad (asc / asc) y
la resistencia (Asc / Asc) al patgeno ya las toxinas AAL (Clouse y Giichrist, 1986). La muerte celular en fololos de tomate,
causada por el agente patgeno o la toxina AAL purificada, aparece como manchas localizadas de clulas muertas
(Gilchrist y Grogan, 1976). Los protoplastos de las isolinas de Asc tambin reaccionan a las toxinas de AAL en una forma
dependiente de la concentracin de toxina especfica del genotipo, indicando que los alelos del gen Asc son funcionalmente
activos en protoplastos (Moussatos et al., 1993a). La muerte celular inducida por toxinas en protoplastos y fololos requiere
entre 36 y 48 horas, durante las cuales las clulas tratadas con toxina parecen mantener la integridad de la membrana
plasmtica hasta que se observan los sntomas de muerte (Gilchrist, 1983).

Las toxinas AAL son una familia de monosteres de cido tricarbaliano y alcoholes polihdricos (Bottini et al., 1981, Caldas
et al., 1994, 1995) estructuralmente relacionadas con la esfinganina, un precursor del esqueleto qumico de todos los
esfingolpidos. Las toxinas AAL y las fumonisinas, un grupo de congneres qumicamente relacionados producidos por
Fusariurn moniliforme (Nelson et al., 1993), son micotoxinas potentes y extendidas con importantes implicaciones para la
salud (Sydenham et al., 1991; Hopmans y Murphy, 1993; Merrill et al., 1993). Los congneres de toxinas ms abundantes y
activos son la toxina AAL TA y la fumonisina B1 (FB1). El espectro de efectos biolgicos inducidos por estas toxinas de
mico-anlogo de esfinganina (SAM) incluye la muerte celular en plantas (Gilchrist y Grogan, 1976, Clouse y Gilchrist, 1986,
Gilchrist et al., 1992, 1995, Abbas y col., 1994) y (Gelderblom et al., 1992, Syndenham et al., 1990) a enfermedades
degenerativas renales, neurales y hepticas (Ross y col., 1990, Norred et al., 1992, Thiel et al., 1992, Norred, 1993).
Funcionalmente, estas toxinas son potentes inhibidores de ceramida sintasa en plantas (Abbas et al., 1994, Gilchrist et al.,
1995) y animales (Wang et al., 1990, 1992, Merrill et al. , 1993, Schroeder et al., 1994), lo que sugiere que los cambios en
los niveles celulares de las bases esfingoides pueden estar relacionados con la muerte celular. Como segundos
mensajeros, ahora se sabe que los esfingolpidos y las bases de la gofina regulan el comportamiento celular a muchos
niveles, incluyendo la comunicacin celular, los receptores de los factores de crecimiento, el crecimiento, la diferenciacin y
la transformacin (Ghosh et al., 1994; Jarvis et al., 1994a, 1994b , Natarajan et al., 1994, Bose et al., 1995, Chao, 1995,
Jones y Murray, 1995, Khan et al., 1995, Merrill et al., 1995, Obeid y Hannun, 1995. Ohata et al. 1995). Recientemente, se
observ que las fumonisinas y las toxinas AAL inducen marcadores celulares de la apoptosis en clulas de cabrito de mono
verde africano (CV-1) (Wang et al., 1996, Winter et al., 1996), muy probablemente mediante la interdiccin de vas de
sealizacin basadas en lpidos.
Dada la relacin entre las ceramidas y la apoptosis en animales, las SAM y el metabolismo de las ceramidas, y nuestra
observacin de que los SAM inducen apoptosis en clulas CV-1, razonamos que las clulas de tomate asc / asc podran ser
un sistema til para determinarsi las caractersticas estereotpicas del proceso apopttico ocurren durante la muerte celular
inducida por toxina.
Evidencia de la existencia en las plantas de un proceso pcd que est disponible para su uso durante las transiciones de
desarrollo y que podra ser activado durante la enfermedad probablemente depender de genes de inters tanto para los
bilogos de plantas y patlogos. Se analizaron los protoplastos y el tejido foliar intacto de tomate para determinar las
caractersticas de la apoptosis despus del tratamiento con SAMs selectivas para el husped. Simultneamente, se
examinaron histolgicamente las secciones de hojas de tomate durante la formacin de elementos traqueales y las clulas
de tapa de raz de cebolla sometidas a desprendimiento durante la eliminacin de la raz para evidenciar caractersticas
apoptticas reguladas en el desarrollo. Presentamos aqu (1) la presencia de ADN cleav en sitios de enlace
internucleosomal durante la muerte celular inducida por la toxina, utilizando el TdT end-etiquetado (TUNEL) mtodo; (2)
escaleras de ADN dependientes de Ca24 del ADN nuclear de pro toposplantes y fololos tratados con toxina; y (3) la
formacin de cuerpos distintos, parecidos a cuerpos apoptticos, que contienen ADN fragmentado en ambos protoplastos
tratados con SAM y clulas de tapa de raz desprendibles.

RESULTADOS
Deteccin de escaleras de ADN despus del tratamiento con toxinas asc / asc Protoplastos
Los protoplastos se preincubaron en medio TM-2 (Shahin, 1985) durante 6 horas y se sometieron a centrifugacin suave en
sacarosa 0,6 M para eliminar las clulas que haban muerto durante el aislamiento de protoplastos; los protoplastos sanos
se trataron entonces con 20 M de TA durante 48 h. Se eligi esta concentracin de toxina porque condujo a la muerte de
"50% del nmero total de clulas tratadas dentro de las 48 horas en fololos y protoplastos. Este nivel de muerte celular
permiti la deteccin tanto de aumentos como de disminuciones en la muerte debido a diversos tratamientos impuestos en
estos estudios.
Como se muestra en la Figura 1, el anlisis en gel de agarosa de ADN aislado de clulas tratadas con TA revel escaleras
de ADN que consistan en fragmentos que aumentaban en tamao por mltiplos de 180 pb cuando se tieron con bromuro
de etidio (Figura 1, carril 2). Las clulas de control sanas, mantenidas en medio de cultivo solo, no mostraron fragmentos de
ADN bajo estas condiciones (Figura 1, carril 1). La adicin de 20 \ mu M de FB1 a los protoplastos indujo escaleras de ADN
equivalentes a las inducidas por TA (Figura 1, carril 2). En la Tabla 1 se enumeran tratamientos adicionales que indujeron
escaleras de ADN durante la muerte celular, incluyendo cido araquidnico, un inductor fngico de HR de Phytoptithora
infestans (Bostock et al., 1981) y KCN (ver Ryerson y Heath, 1996).

Figura 1. Anlisis de Gel de Agarosa de Protoplastos de Tomate para ADN fragmentacion

El carril 1 contiene protoplastos que se incubaron en medio TM-2 conteniendo 3,3 mM CaCl2 carril 2, medio ms 20 tM de
toxina AAL: carril 3, medio ms 20 llM F81 carril 4, medio ms 20 tM FB1 y 50 mM de cicloheximida; carril 5, medio ms 5
mM Fe2SO4 carril 6, medio que contiene 1 mM CaCl2 ms 20 mM FB1 carril 7, medio que contiene 10 mM CaCl2 ms 20
1iM FB: carril 8, medio que contiene 10 mM Ca2 * y 10 mM ZnSO4 ms 20 jiM FB1 y el carril M, marcadores de ADN de
fragmentos de 1 kb. El ADN se aisl 48 horas despus del tratamiento, se separ en un gel de agarosa al 1,5% por
electroforesis, teido con etidio bro fotografiado bajo iluminacin UV.

Otra observacin frecuente con respecto a la induccin del ADN escaleras en animales es que la apoptosis es inhibida por
la cicloheximida, lo que sugiere que el proceso requiere la expresin gnica, al menos en algunas situaciones, para llegar a
la conclusin (Schwartzman y Cidlowski, 1993). En los protoplastos de tomate, la adicin de 50nM de cicloheximida reduce
sustancialmente el grado de ADN fragmentacin inducida por 20 u, M FB, (Figura 1, carril 4) o TA (datos no mostrados). La
reduccin de Ca2 + (como CaCl2) de 3,3 a 1 mM en el medio TM-2 (Figura 1, carril 6) condujo a una reduccin en la
fragmentacin del ADN, mientras que un aumento a 10 mM Ca2 + (Figura 1, carril 7) aument la intensidad de las escaleras
de ADN inducida por 20 M FB ,. El efecto activador de Ca2 + sobre La fragmentacin del ADN fue completamente negada
por la adicin de ZnSO _ {4} 10 mM (Figura 1, carril 8). La concentracin-dependiente activacin por Ca2 + e inhibicin por
Zn2 + de la toxina inducida.
La fragmentacin del DNA de la planta en el DNA es consistente con la ampliamente reconocido de estos cationes
divalentes sobre el endgeno endonucleasa responsable de la escisin del ADN durante la apoptosis en sistemas animales
(Barry y Eastman, 1992; Lohmann y Beyersmann, 1993; Peitsch et al., 1993).
Considerando que la muerte celular en el sistema de protoplastos de tomate generado ADN de muchos efectores (Tabla 1),
encontramos que 5 mM de Fe2SO4 mat de 90 a 100% de los protoplastos dentro de las 12 horas pero no indujo la
fragmentacin del ADN (Figura 1, carril 5; Schwartzman y Cidlowski, 1993).
Deteccin de escaleras de ADN por anlisis de transferencia de gel de ADN despus del Tratamiento de Folletos
con SAMs
Los fololos separados se trataron con TA mediante el folleto estndar bioensayo (Gilchrist y Grogan, 1976) en el que se
toma la toxina durante 36 horas a travs del pecolo del folleto de papel de filtro impregnado con 20 u, M TA o FB, en H _
{2} O. A esta concentracin de toxina,lesiones tpicas cubiertas del 50 al 60% del total folleto, lo que indica que el ADN de
las reas muertas se combinara con una cantidad casi igual de ADN de aparentemente reas sanas fuera de las lesiones
cuando todo el fololo fue extrado. Los experimentos preliminares indicaron que el anlisis por transferencia de gel
fue ms sensible que la tincin con bromuro de etidio en detectar escaleras de ADN. Por lo tanto, para maximizar la
visualizacin de escaleras de los fololos tratados que contienen tanto lesin como regiones, se realiz anlisis de
transferencia de gel de ADN sobre ADN que se aisl mediante el mtodo de nonfenol (Tai y Tanksley, 1991)
y despus se separaron en gel de agarosa al 1,5%. El ADN separado se transfiri a una membrana de nylon y se hibrid
con 32 ADN genmico total de tomate. Como se muestra en estas condiciones en la Figura 2, ambas toxinas (Figura 2,
carriles 1 y 2) indujeron
Fragmentacin del ADN en los fololos tratados; esta fragmentacin apareci como una serie de bandas que corresponden
a mltiplos de fragmentos de 180 a 200 pb. No se produjo ninguna fragmentacin.observado en el tejido de control de agua
(Figura 2, carril C). en adicin se obtuvieron resultados idnticos con ADN aislado de fololos extrados directamente de
plantas infectadas con A. a. lycopersici que indujeron los sntomas tpicos del chancro del tallo de Alternaria
enfermedad (Gilchrist y Grogan, 1976).

Deteccin In Situ de la Fragmentacin Nuclear por la Mtodo TUNEL en Protoplastos

La apoptosis se revela adems en animales por la compartimentacin ordenada
del ADN en distintos cuerpos apoptticos ligados a la membrana que persisten durante periodos variables de tiempo. Los
cuerpos que contienen ADN fragmentado eventualmente se desplazan a la periferia de las clulas afectadas, las cuales luego
se distorsionan en forma
alrededor de estos cuerpos, un proceso llamado blebbing (Tomei y Cope, 1991). La deteccin in situ de la fragmentacin del
ADN nuclear y la visualizacin de los cuerpos apoptticos implica el uso de un TUNEL de los grupos 3 '-OH libres en los
fragmentos nucleosmicos con un marcador detectable (Gorczyca et al., 1993). El mtodo TUNEL se utiliz para determinar
si la fragmentacin se restringa al ADN nuclear de los protoplastos tratados con TA y si el ADN fragmentado se
compartimentalizaba en varios cuerpos distintos, como ocurre en los sistemas animales. En estos experimentos, se
incubaron los protoplastos asc / asc en anillos de plstico directamente sobre portaobjetos de microscopio durante 24 horas
en medio TM-2 que contena TA 20 nM y se compararon con clulas incubadas en medio TM-2 solo despus de la
aplicacin del mtodo TUNEL y counterstaining clulas con Hoechst 33342 para el ADN total.
Como se muestra en la Figura 3, microscopa de luz revel la ubicacin y la forma de las clulas tratadas con TA en
comparacin con el control
Figura 2. Fragmentacin del ADN inducida por toxinas en los fololos de tomate.
Las lminas de tomate excisadas se trataron durante 36 h con H _ {2} O (lnea C), 20 de la toxina AAL (carril 1) o FB 20 nM
(carril 2). Se aisl ADN y separados como se describe en Mtodos. Se realiz anlisis de transferencia de gel por
hibridacin del ADN con un ADN genmico de tomate marcado con 32P. los las puntas de flecha indican marcadores de
ADN de 500 y 1000 pb
protoplastos (Figuras 3A y 3D) y permiti la distincin de clulas que se estaban volviendo clorticas, oscurecidas y
ligeramente distorsionadas en forma despus de una exposicin de 24 horas a la toxina. Tincin de ADN revel un solo
ncleo dentro de las clulas individuales que aparecieron para estar ubicados centralmente y de tamao y forma similares
en control(Figura 38). Por el contrario, las clulas tratadas con TA exhibieron con tamaos y formas ms variables,
frecuentemente con mltiples cuerpos distintos que contenan ADN que a menudo estaban asociados con la periferia de la
clula (Figura 3E).
Aplicacin del mtodo TUNEL a los fragmentos fragmentados
ADN con dUTP-digoxigenina seguido de tratamiento con antidigoxigenina anticuerpo y isotiocianato de fluorescena (FITC) -
el anticuerpo anti-cabra marcado revel ADN nuclear fragmentado en clulas tratadas con toxina (Figuras 3C y 3F). En
conjunto, estas tcnicas permiti ver exactamente las mismas celdas para aparicin con microscopa ptica (Nomarski),
localizacin de nuclear (Hoechst 33342), y la deteccin de fragmentos de ADN nuclear (TUNEL), utilizando diferentes
longitudes de onda de luz UV.
El mtodo TUNEL revel que -50% de las clulas eran positivas para grupos 3 '-OH en exceso y que algunas de estas
clulascontena mltiples cuerpos TUNEL-positivos, claramente separados.
El tamao, forma y localizacin del ADN manchado por Hoechst en cada una de las clulas TUNEL-positivas correspondi
exactamente con los cuerpos positivos TUNEL (comparar las Figuras 3F y 3E) en las clulas tratadas con TA. No se
observ fluorescencia derivada de FITC cuando el TdT, el sustrato dUTP, o el respectivo se omitieron los anticuerpos de la
reaccin. Tincin vital de la muerte protoplastos con diacetato de fluorescena indicaron que estos cuerpos distintos, incluso
cuando se separaron de la celda, limitada por una membrana intacta, aunque no estudios de microscopa electrnica para
confirmar este punto. Estos resultados son sorprendentemente coherentes con las caractersticas de la apoptosis en clulas
de animales, en las que se han utilizado tcnicas similares como estrategias in situ para visualizar ncleos sometidos a
fragmentacin ndurante la apoptosis y la posterior formacin de apoptticos (Gorczyca et al., 1993).

Deteccin In Situ de Fragmentacin Nuclear en Folletos de tomate tratado con TA

Los folletos de tomate (asc / asc) se dejaron tomar 20 pM TA durante 24 horas en el procedimiento estndar de bioensayo
de folleto individual.
Zonas muertas localizadas y reas circundantes en el borde de la lesin sin sntomas se fijaron en 10% de formalina
tamponada, cortado en pedazos pequeos, incrustado en HistoPrep (Fisher), y congelado en nitrgeno lquido antes de
seccionar con una micrtomo con un grosor de 10 m. Las reas de clulas muertas fueron fcilmente detectado por su
color marrn bajo luz normal, as como fuerte autofluorescencia en las reas muertas bajo luz UV. En Adems, hubo una
prdida completa del contacto clula a clula, que se ve en las figuras 48 y 4D. Autofluorescencia fuerte en las zonas de
lesin fluorescencia de FlTC desactivada en contraste el protoplastos. Este problema fue eludido mediante el uso de
antidigoxigenina anticuerpo conjugado a fosfatasa alcalina con foliar, aunque la tincin con color TUNEL positivo podra
bloquear la mancha Hoechst. Como se muestra en la Figura 4, las reas que contienen las clulas muertas exhibieron
consistentemente un TUNEL positivo reaccin que se limitaba al rea de la lesin (designada
como dc en la figura 48). El rea TUNEL-positive no se extendi ms all del margen de la lesin, ni las clulas TUNEL-
positivas aparecen en los controles tratados con agua (Figura 4C). Lo mismo seccin (Figura 4A) contrastado con Hoechst
33342 revelado que el ADN estaba presente en todas las clulas, pero los ncleos intactos confinados a las clulas en
reas que no expresaban una concentracin alcalina fosfatasa.
La dependencia del etiquetado final por TdT en las reas de lesin fue confirmada por los resultados de las reacciones de
control negativo en ausencia de la transferasa (figura 4D) que no mostr desarrollo de color en el rea de las clulas
muertas. Adems, las clulas en el rea de la lesin pareca haber perdido clula a clula y exhibi mrgenes
distorsionados pero retenidos el ADN fragmentado dentro de los mrgenes celulares, aunque el ADN ya no estaba
confinado a un nico cuerpo nuclear, como ser visto en clulas con contraste de ADN fuera del rea de la lesin
(comparar las Figuras 4A y 48). Todos estos resultados son consistentes con las caractersticas morfolgicas de la
apoptosis los tejidos animales organizados (Gorczyca et al., 1993).

Cuantificacin de la muerte celular inducida por TA en asc / asc Protoplastos

La asociacin positiva entre la deteccin de escaleras de ADN y ADN TUNEL-positivo en protoplastos tratados con 20 M
TA o FB, sugiere que la mayora de los protoplastos pueden haber muerto en de una manera consistente con la induccin
de un proceso apopttico.
Hemos examinado esta relacin ms en experimentos adicionales en el que los protoplastos se aislaron de la misma
manera que los de las Figuras 3 pero se cultivaron a 24C durante 48 horas en 250C pL de medio TM-2 con o sin
cualquiera de las toxinas en placas de 24 pocillos con una concentracin de 105 protoplastos por ml. Las clulas viables,
detectadas por tincin con diacetato de fluorescena, y las clulas totales se observaron en un microscopio invertido. Para la
aplicacin in situ del ensayo TUNEL, los protoplastos de los mismos aislamientos que se muestran en la Figura 3 se
cultivaron directamente sobre placas, y la reaccin de TUNEL se realiz con fosfatasa alcalina conjugada con el anticuerpo
anti-digoxigenina. El uso de fosfatasa alcalina fue necesario debido a que la fluorescencia de FlTC se desvaneci
demasiado rpido para permitir un recuento preciso. Aproximadamente el 50% de las clulas murieron en los tratamientos
TA y FB, de estos, 85 y 95%, respectivamente, fueron TUNELpositivos (Figuras 5A y 58). La adicin de Ca2 + 10 mM al
tratamiento TA dio como resultado 100% de las clulas muertas que reaccionaban con TUNEL positivo, en contraste con la
adicin de Zn2 + 10 mM, que no protega contra la muerte celular pero redujo la fragmentacin detectable por la reaccin
TUNEL a <10% de las clulas muertas totales. El tratamiento con cicloheximida dio como resultado una reduccin tanto de
la muerte asociada a TA como de las clulas TUNEL positivas a los respectivos valores de control, lo que sugiere que la
inhibicin del gen
expresin redujo la cantidad absoluta de muerte celular resultante del tratamiento con toxinas. Estos datos tambin sugieren
que el efecto de Ca2 + 10 mM aadido al medio TM-2 no era aumentar el nmero de clulas muertas, sino aumentar la
actividad de la endonucleasa en aquellas clulas que haban sido activadas para morir.
Progresin de los cambios nucleares durante la muerte celular inducida por AT en asc / asc Protoplastos
En el transcurso de la visualizacin de miles de protoplastos cosechados en diferentes momentos despus del tratamiento
con TA que estaban sufriendo muerte celular, observamos que los cambios en el ADN nuclear siguieron un patrn
consistente una vez que el material nuclear primero reaccion positivamente en el procedimiento TUNEL. Como se muestra
en la Figura 6, esta progresin de cambios comenz con un ncleo intacto (Figuras 6A y 6F) que mantuvo su forma y
tamao pero reaccion TUNEL positivo con el ADN localizado en un solo cuerpo nuclear (Figuras 6B y 6G). A esto le sigui
una expansin o diseminacin de los materiales nucleares, que comenzaron entonces a mostrar la delimitacin en varios
cuerpos nucleares (Figuras 6C y 6H). Estos cuerpos mantenan una forma generalmente redonda pero a veces adoptaban
una forma ms alargada a medida que avanzaba el proceso (Figuras 6D y 61). Despus de la migracin de estos cuerpos a
la periferia de la clula, la etapa final pareca ser una en la que la clula comenz a perder forma (blebbing) y luego se
desintegran, en cuyo punto los cuerpos distintos que contienen el ADN fragmentado fueron liberados en el medio Figuras
Figura 5. Cuantificacin de pcD inducida por toxinas AAL en tomate Protoplastos.
(A) Se aislaron los protoplastos y se cultivaron en 250 l de solucin de tratamiento en una placa de 24 pocillos con una
concentracin de 105 protoplastos por ml.
Las placas se incubaron a 24C durante 48 h. Las clulas viables se contaron en tres pocillos con 10 vistas por pocillo y
cada vista que contiene 400 clulas.
(8) Los protoplastos se cultivaron directamente sobre portaobjetos y se fijaron, como se describe en Mtodos. Despus de
la marcacin final de TdT-digoxigenina in situ, las diapositivas fueron teido con anticuerpo anti-digoxigenina seguido de
fosfatasa alcalina-anticuerpo anti - cabra marcado. Se contaron los protoplastos apoptticos en dos diapositivas con 10
vistas por diapositiva y cada vista que contiene ~ 2 0 0 Clulas.
Medios y SEM de tres experimentos se indican por encima de los respectivos barras: (1) indica el control; (2), tratamiento
con 20 M de TA; (3,20 pM FB; (4), TA 20 mM ms Ca2 + 10 mM; (5), 20 M de TA ms 10 mM de Caz + y 10 mM de Zn2
+; y (6), 20 pM de TA y 15 pM

6E y 6J). Despus de que los cuerpos se movieran fuera de la clula, muchos parecan permanecer intactos, conservaban
su forma y permanecan estrechamente asociados entre s en el medio protoplstico osmtico alto.
No pudimos estimar cunto tiempo tard una clula en atravesar estos cambios una vez que la fragmentacin comienza,
porque el proceso de muerte en estos protoplastos no est totalmente sincronizado y todas las determinaciones se hacen
en clulas destructivamente muestreadas.
Sin embargo, hemos sido capaces de detectar etapas equivalentes a las ilustradas aqu de 6 a 36 h bajo condiciones de
ensayo estndar.
En clulas animales sometidas a apoptosis, eventos anlogos pueden ocurrir en cuestin de minutos a unas pocas horas.
En algunos casos, las etapas discretas no son detectables de forma fcil o consistente porque los sucesos se desarrollan
con tanta rapidez. La condensacin y brotacin para formar cuerpos apoptticos puede completarse en cuestin de minutos
(Matter, 1979) y puede permanecer visible slo durante unas pocas horas (Bursch et al., 1990), prorrogando Kerr et al.
(1991) para comentar que los cuerpos apoptticos son notablemente discretos histolgicamente. Sospechamos que el
sistema de protoplastos de tomate est sesgado hacia la deteccin de etapas, porque somos capaces de muestrear
peridicamente durante la ventana de muerte de 24 a 48 horas. Esto probablemente mejor nuestras posibilidades de ver
etapas progresivas, en contraste con la observacin de eventos similares en el tejido organizado sometidos a la toxina
inducida o desencadenada por el desarrollo de la muerte por este proceso.

Efecto de la toxina AAL en los protoplastos de tomate y folleto

Tejido en Ascsolinas Asc resistentes 60 protoplastos y foliolos de la aislina AsdAsc se trataron con TA a 5 a 20 pM en las
mismas condiciones que la isolina asc / asc. No se observ ninguna muerte aparente inducida por toxina en ninguna de las
dos situaciones, ni haba escaleras de ADN o TUNELpositivo reacciones observadas, y los tejidos no difirieron de los
controles no tratados. Sin embargo, tanto protoplastos como foliolos produjeron escaleras de ADN en la isolina Asc / Asc
cuando se trataron con otros inductores de muerte celular (Tabla 1). Estos otros efectores con potencial para inducir
apoptosis basados en estudios con animales incluidos los metabolitos de la esfinganina (ceramida C-2), un inductor de la
muerte celular (cido araquidnico) basado en lpidos, el inhibidor de la protena quinasa estaurosporina y el shock trmico.
Las concentraciones utilizadas se basaron en informes anteriores en la literatura sobre animales. Entre las sustancias
qumicas ensayadas, muchas escaleras de ADN inducidas y la muerte celular en ambos genotipos, pero slo los SAM
fueron genotipo especfico en la toxicidad y la fragmentacin del ADN. Sin embargo, las clulas muertas con Fe2S04 pero
no indujeron la formacin de escaleras de ADN y por lo tanto se usaron como control negativo para muerte celular no
apopttica.
Deteccin de clulas TUNEL-positivas y Apoptotic-likeCuerpos en las clulas de la tapa de la raz de Sloughing
La deteccin de las caractersticas morfolgicas de la apoptosis en clulas de tomate desafiadas por varios estimulantes
externos negativos ha confirmado la existencia de varios elementos funcionales elementos del proceso apopttico en las
clulas vegetales bajo estrs (ver la eliminacin de clulas bajo estrs puede ser motivo suficiente para que este proceso se
haya conservado en las plantas, parece probable que un proceso tan complejo con el potencial de mltiples entradas de
seales y vas paralelas que conduzcan a la expresin de determinantes genticos de la muerte celular pueda ser invocado
durante normal en las plantas como en los animales.
Debido a que la apoptosis en los animales se reconoce como un proceso rpido una vez que se invoca, observar las
diversas etapas de este proceso en las plantas probablemente sera facilitado examinando los tejidos en los que el proceso
est en continuo continuo. En este contexto, hemos razonado que las clulas de la tapa de raz pueden ser sincronizadas
en nmero suficiente para permitir la observacin de dnde y cundo, en relacin con su origen meristemtico, un programa
de muerte celular puede ser invocado. El tapn radicular consiste en clulas vivas del parnquima derivadas continuamente
del meristema apical (Esa, 1977).
A medida que se producen nuevas clulas en el interior, las que se encuentran en la periferia de la raz se desprenden de
forma ordenada y recuerdan la base original de Kerr para la derivacin del trmino apoptosis para describir pcd como un
proceso natural (Kerr et al., 1972). Se ha estimado que en las races de avena, el tiempo desde el origen hasta el
desprendimiento es un perodo de 5 a 6 das (Harkes, 1973), lo que sugiere que las etapas, si existen, podran ser
detectables.
Las puntas frescas de raz de cebolla, fijadas y seccionadas crosticamente, se trataron usando el mtodo TUNEL y se
contracoloraron con Hoechst 33342. Como se muestra en la Figura 7, el contraste de DMA revel ADN nuclear en clulas a
lo largo de las secciones de raz, del meristema apical, sometindose a divisin, a la superficie exterior, donde las clulas
cap se desprendan de la raz (Figura 7A). El mtodo TUNEL detect el ADN fragmentado slo en clulas cerca de la
superficie de la tapa de raz (Figura 7B) en secciones longitudinales, lo que se confirm en secciones transversales (datos
no mostrados). El rea de clulas TUNEL-positivas fue restringida
a la ms externa de una a tres clulas de la tapa, y no se detect ninguna fragmentacin del ADN en el interior de la raz,
incluidas las clulas que estaban experimentando la replicacin activa del ADN durante la divisin celular. Cuando se
visualiza con mayor aumento, la aparicin del ADN nuclear (Figura 7C) cambi de una forma circular compacta a
estructuras TUNEL-positivas alargadas que finalmente adquirieron la forma de numerosos cuerpos circulares bien definidos
(Figura 7D). La formacin de estos cuerpos pareca ser el ltimo paso alcanzado antes de una clula fue arrojado de la raz
de tapa (Figura 7D]. Los mismos campos de vista de la punta de la raz que reaccionaron con el mtodo TUNEL (Figuras 7B
y 7D) se contrastaron para el ADN con Hoechst 33342 (Figuras 7A y 7C). La seal de tincin de ADN ms dbil en la capa
externa de las clulas cap se debi a la prdida significativa de ADN, as como el hecho de que el ADN fragmentado ya no
estaba en un solo ncleo compacto en estas clulas en contraste con el marcaje TUNEL fuerte en las mismas clulas
debido a la alta sensibilidad de este ensayo (vase la advertencia en Mtodos). La facilidad con que estos hallazgos pueden
ser observados fue revelado por el
Figura 6. Progresin Temporal de los Cambios Nucleares Asociados con la Muerte de las Clulas Inducidas por Toxina AAL
en Protoplastos de Tomate Asc / Asc.
Los protoplastos de tomate se trataron con TA 20 \ mu M durante 24 h. (A) a (E) muestran protoplastos marcados usando el
mtodo TUNEL. ADN fragmentado
y los cuerpos apoptticos fueron vistos a 510 a 560 nm como fluorescencia de amarillo a verdoso. La fluorescencia roja
representa la autofluorescencia de
clorofila. (F) a (J) muestran el mismo campo de vista que en la fila superior, excepto que los protoplastos se tieron con el
contraste de ADN Hoechst 33342.
(A) y (F) Protoplastos normales, aparentemente sanos.
(B) y (G) Las primeras etapas de la apoptosis, con la fragmentacin del ADN nuclear y el brote nuclear se muestra como
fluorescencia verde claro.
(C) y (H) Mismas etapas que las mostradas en (B) y (G).
(D) y (I) Etapas tardas de apoptosis con fragmentos de ADN y cuerpos distintos mostrados como fluorescencia verde
despus del ensayo TUNEL.
(E) y (J) Mismas etapas que las mostradas en (D) y (I).
Barra en (F) = 10 urnas.

Figura 7. Apoptosis durante el desarrollo de la planta.

(A) Seccin longitudinal de la punta de la raz de cebolla teida para el ADN con Hoechst 33342.
(B) La misma seccin que se muestra en (A) pero marcada usando el ensayo TUNEL. Se muestran las clulas tapn raz
sometidas a apoptosis.
(C) Clulas tapn raz teidas para ADN con Hoechst 33342.
(D) El mismo campo de clulas de tapa raz que se muestra en (C) teido usando el mtodo TUNEL. Se muestra la
formacin de cuerpos apoptticos.
(E) Corte transversal del fololo de tomate en expansin joven manchado para el ADN con Hoechst 33342
(F) El mismo campo de seccin de hoja que se muestra en (E) teido usando el mtodo TUNEL. Se muestra que estn
desarrollando traqueidas sometidas a fragmentacin de ADN.
Barra en (B) = 50 | jm tor (A), (B), (E) y (F); barra en (D) = 2 atasco para (C) y (D).

hecho de que las secciones de las tapas de las races de tomate resultados como los observados con la cebolla (datos no
mostrados). Tambin examinamos criosecciones de tomate en expansin joven foliolos manchados usando el mtodo TUNEL
(Figura 7F) ycounterstained con Hoechst 33342 (Figura 7E). Desarrollando los elementos traqueales fueron consistentemente
positivos para el TUNEL reaccin slo en el punto en el que los elementos se (Figura 7). Todas las dems reas del folleto
estaban libres de TUNEL-positivo, aunque Hoescht 33342 counterstain confirm que el ADN estaba presente en todas las
clulas que rodeaban los elementos traqueales. Se muestra la misma seccin de campo y hoja
en la Figura 7E se ti para ADN. Finalizacin del etiquetado del ADN en secciones demostrando el desarrollo de la traqueida
es consistente conclusin de Mittler et al. (1995), quienes proporcionaron anlisis histolgicos
evidencia de que el ADN fragmentado est presente durante el desarrollo de elementos traqueales.

Discusin
La capacidad de un patgeno, a travs de seales secretadas, para interceptar y perturban vas de transduccin de seales
evolutivamente conservadas dedicado al desarrollo de las plantas cumplira los requisitos funcionales
de los factores de patogenicidad y exponen una vulnerabilidad gentica de las plantas a patgenos. Nuestros resultados
indican que un proceso que conduce de la endonucleasa activada ca * + clivaje del ADN a la formacin de cuerpos
apoptticos puede inducida en tejidos enfermos por toxinas selectivas del husped o araquidnicos cido, un inductor de la
FC derivado de P infestans, y pueden aparecer durante el desarrollo normal de la planta. Acoplado con la aparicin de
escaleras de ADN y clulas TUNEL positivas en regiones de hojas sometidas a HR en una interaccin incompatible
entre Uromyces vignae (un parsito obligado) y (vase Ryerson y Heath, 1996), estos datos sugieren que
que diversos agentes patgenos pueden interceptar vas en las plantas, lo que conduce a la muerte celular. Molecular
la diseccin de las vas de sealizacin implicadas podra genes comunes al desarrollo de las plantas y enfermedades de
las plantas. Elucidacin de la funcin de los genes de las plantas en el husped determinado susceptibilidad podra
proporcionar la base para las estrategias moleculares para reducir la gravedad de la enfermedad y puede ser especialmente
importante en situaciones en las que actualmente no existe resistencia gentica efectiva existe. Por ejemplo, si la expresin
de un (los) genoma a la muerte celular predispone al tejido a la infeccin o si un gen de la planta inducida durante la
infeccin por un patgeno especfico contribuye a la severidad de la enfermedad, la expresin reducida por antisentido
tecnologa, bajo el control de un promotor, tiene el potencial de reducir o limitar la enfermedad.
La expresin gnica de las plantas ha sido ampliamente estudiada en plantas experimentando reacciones resistentes a
patgenos microbianos (Lamb, 1994), pero se ha tratado con moderacin como un componente necesario de
susceptibilidad en enfermedades de las plantas. En cambio, los estudios de genes que pueden desempear un papel
determinante en la susceptibilidad de las plantas se han centrado en la expresin de genes microbianos o la actividad
de los productos gnicos microbianos en patognesis o aumento de la virulencia (Collmer, 1986). Los resultados aqu
descritos, en los que un la toxina selectiva para el husped y un inductor de hongos del equivalente inducido por HR
caractersticas de la muerte celular, sugieren que plantas los genes regulan la susceptibilidad y resistencia a patgenos, al
menos en algunos casos. Escaleras de ADN detectadas en protoplastos de tomate tratado con cido araquidnico, un
inductor del HR fenotipo en la patata y otras plantas (Bostock et al., 1981), son consistentes con los resultados de Ryerson
y Heath (1996).
La asociacin de la peroxidacin lipdica y las especies de oxgeno activo en la enfermedad de las plantas est bien
documentado (Keppler et al., 1989; Levine et al., 1994), como es el papel crtico de los segundos lpidos mensajeros en la
regulacin de la estabilidad celular en animales (Khan et al., 1995). Los hidroperxidos de araquidonato, conocidos por
inducir todos los principales cambios morfolgicos y cromatnicos de la apoptosis en clulas T humanas (Sandstrom et al.,
1995), se forman en minutos en clulas vegetales expuestas al cido araquidnico (Ricker y Bostock, 1994). Nuestros
resultados iniciales indican que la oxidacin el estrs que implica la peroxidacin lipdica puede desencadenar la
transduccin de la seal vas conducentes al fenotipo apopttico en plantas, como se ha informado para los animales.
En contraste con la coevolucin de factores de patogenicidad y susceptibilidad o resistencia, nuestros resultados nos llevan
a especular que los genes condicionan la sensibilidad a las toxinas selectivas del husped y los elicitores pueden ser
anteriores a la interaccin patgena. En el presente situacin, la planta funcionara como un ensayo sensible para
una capacidad adquirida por parte del patgeno para secretar biolgicamente homlogos funcionales activos de seales
endgenas de la apoptosis. Esta interaccin molecular, facilitando la susceptibilidad o resistencia, podra ocurrir como
resultado de estas molculas de sealizacin que surgen para el desarrollo o razones nicas para el patgeno, as como la
planta y no por coevolucin dirigida. En este contexto, un patgeno "necrosante" capaz de secretar seales a las que la
planta es sensible podra conducen a la adquisicin fortuita de una base de antes de lo que sera adquirido despus de la
senescencia normal pero sin ninguna presin de seleccin para hacerlo (Gilchrist et al.,
1995). Por el contrario, la supresin controlada por patgenos de plantas la muerte celular en interacciones biotrficas, en
las que la base de nutrientes es una clula vegetal viva, podra ser la presin de seleccin positiva sobre el patgeno en
lugar de un fallo por parte del husped para reaccionar con una respuesta de HR. Aunque no conocemos ninguna analoga
en plantas, hay por lo menos una docena de virus de mamferos que se ha demostrado que codifican actividades que
modulan la apoptosis durante la infeccin (Shen y Shenk, 1995).
Puede ser til buscar directamente pruebas de supresin activa de apoptosis en plantas durante la infeccin por parsitos
obligados.
Claramente, hay varias opciones que permiten a la clula seguir percepcin de una seal endgena o exgena potencialmente
capaz de alterar la homeostasis. El resultado final puede ser proliferacin, quiescencia, muerte o diferenciacin, dependiendo
sobre el tipo de clula, el estado fisiolgico de la clula, el ciclo celular etapa, o la mezcla de otras seales procesadas por la
clula en el momento en que se percibe un estmulo diferente(Williams et al., 1992, Williams y Smith, 1993). En animales
medicina, tanto las seales que regulan la expresin gnica como
el impacto de la alteracin de la expresin gnica en la apoptosis (Wyllie, 1995) son objeto de un intenso inters por la
investigacin bsica enfermedades humanas que van desde el cncer (Anderson et al., 1994; Fisher, 1994) a enfermedades
autoinmunes (Critchfield y Lenardo, 1995; Thompson, 1995). Curiosamente, el trmino apoptosis se deriv del griego por
J.F.R. Kerr en 1972 para reflejar el proceso mediante el cual caen de los rboles para enfatizar el proceso natural de una
forma programada de muerte celular que estaba estudiando en el tejido heptico
(Kerr et al., 1972). Anlogamente a los animales, la confirmacin y manipulacin de un proceso apopttico dependiente de la
expresin gnica en plantas requerir vinculacin a genes especficos, conjuntos de genes que interactan o productos
gnicos que responden a las seales transduced por la gama de los estmulos que elicitan esta forma de
pcd. Por ahora los principales criterios para la apoptosis en plantas son:los utilizados por los bilogos animales, a saber,
cambios rpidos en la estructura de la cromatina, etiquetado in situ de ADN fragmentado, ADN escaleras y la formacin de
cuerpos apoptticos.
Estamos conscientes de las limitaciones de depender nicamente de una como la fragmentacin del ADN para atribuir la
muerte celular a un proceso apopttico (Collins et al., 1992); por lo tanto, tenemos examin facetas adicionales y
conexiones metablicas entre los eventos observados en plantas y los reportados en animales.
La clonacin de genes vegetales funcionalmente homlogos a los que se ha demostrado que afectan a la apoptosis en
animales ser necesario para resolver an ms las similitudes y las diferencias en la conservacin del reino cruzado de este
proceso (Takayama et al., 1994). Por desgracia, la homologa en el nivel del ADN es a menudo <200/0 entre diferentes
especies animales, y la dilucin de mensajes expresados en poblaciones de clulas de plantas que responden
diferencialmente podra ser otra dificultad (Hengartner y Horvitz, 1994; Shen and Shenk, 1995). Para los genes inducidos, el
nmero de clulas en un tejido organizado sometido a apoptosis puede ser pequeo con la masa celular total, el proceso
puede ser asncrono, y el nmero de clulas inducidas a morir apoptticamente comparado con los que realmente
completan las etapas estereotipadas deel proceso antes del colapso metablico puede representar slo un fraccin del
total.
Una cuestin corolario se refiere a la base por la cual la clula particular grupos (manchas) estn destinados a la muerte en
las enfermedades de las manchas foliares, HRinduced manchas y puntos de imitacin de lesiones. El hecho de que slo
mueren, incluso en situaciones en las que las clulas rea de respuesta se exponen simultneamente al estmulo
(elicitor, toxina, patgeno infiltrado, estrs, o inapropiado seales de desarrollo) sugiere que existe diversidad temporal o
permanente en elementos que controlan la respuesta de clulas individuales a diferentes estmulos en redes de tejido
organizadas.
El destino de los cuerpos de tipo apopttico que contienen fragmentos.El ADN es desconocido. Se piensa que el papel de
los cuerpos apoptticos en los tejidos animales facilita la fagocitosis de los una clula moribunda como un medio eficaz para
proteger el entorno los tejidos a partir de contenidos de clulas potencialmente dainos. En la ausencia de las clulas
fagocticas, el contenido de una clula vegetal, los cuerpos apoptticos similares al papel de las vacuolas pero que
componentes adicionales, podra representar una funcin profilctica durante la liberacin del contenido celular de una
clula moribunda en tejido. Lo que est claro es que el mecanismo para organizar este material en cuerpos estables,
equivalente a cuerpos apoptticos en clulas animales, se conserva en las plantas, como lo demuestra la formacin
de dichos cuerpos durante las fases finales de desprendimiento de las clulas tapa raz durante el crecimiento de la raz de
cebolla.
Si el programa completo de apoptosis o slo fases del programa se producen en clulas vegetales que estn programadas
para morirno se sabe. Adems, los tipos y el nmero de vas que pueden converger para dar los sellos estereotpicos son
desconocidos.
Si la situacin en plantas era como la apoptosis en animales, la la induccin de PCD en una o unas pocas clulas en una
regin o tejido dado puede provocar la muerte rpida de las clulas circundantes; las ltimas clulas pueden no mostrar el
fenotipo apopttico pero morir (Collins et al., 1992). La conclusin ms destacada que sacamos de estos estudios y de
Ryerson y Heath (1996) es que las propiedades funcionales de la apoptosis ocurren en las plantas, y el papel de pcd en las
plantas parece abarcar lo propuesto en los animales, tanto en la salud como en la enfermedad.

MTODOS
Materiales vegetales
Las plantas de tomate (Lycopersicon esculentum) utilizadas para los ensayos de foliolos fueron cultivadas a partir de
semillas de isolares de Chancera de Alternaria (Asc) (Clouse y Gilchrist, 1986). Las plantas se cultivaron en el suelo en
condiciones de invernadero durante 4 semanas, se transfirieron a cmaras de crecimiento (25C / 2C de noche,
fotoperodo de 16 horas) en la etapa de cinco hojas y se usaron en experimentos en la etapa de siete hojas. Las plantas se
iluminaron con una combinacin de
lmparas fluorescentes de color blanco fro y lmparas incandescentes que dan una intensidad de irradiancia de 112 W m-2
en la copa de las hojas. Se colocaron foliolos de tomate extirpados en un papel de filtro saturado con soluciones de
tratamiento en un Petridish de vidrio y se colocaron bajo luz continua durante 36 a 48 horas a 25C, como se describe
previamente (Moussatos et al., 1993b).

Fumonisina, Toxina AAL y Otros Tratamientos Qumicos

Fumonisin 8, (FB,) se adquiri de Sigma (& gt; 95O / o puro). La toxina TA de AAL (Alternaria alternata f sp lycopefsici) se
produjo y se purific como se describi anteriormente (Caldas et al., 1994). La preparacin utilizada fue> 98% pura basada
en el anlisis por HPLC y espectrometra de masas con electrospray. La ceramida C-2 se obtuvo de Calbiochem (La Jolla,
CA) y estaurosporina y cido araquidnico, preparados como una emulsin
en agua (Bostock et al., 1981), eran de Sigma.
Preparacin de Protoplastos
Se aislaron protoplastos de hoja de tomate de plantas Asc isolneas cultivadas bajo condiciones aspticas en medio
Murashige y Skoog (Moussatos et al., 1993a). Despus de 3 a 4 semanas de crecimiento, las plantas se transfirieron a una
cmara oscura a 24C durante 2 das, seguido de 6 a 8 horas de oscuridad a 4C. Despus del tratamiento en fro, los
fololos se suspendieron y se aislaron los protoplastos como se describi anteriormente (Moussatos et al., 1993a). Despus
del aislamiento, los protoplastos se liberaron de los desechos celulares por flotacin sobre una solucin de sacarosa 0,6 M,
usando centrifugacin a baja velocidad (1009 durante 5 minutos).

Los protoplastos viables se recogieron en la interfase y se lavaron tres veces por centrifugacin en solucin de mannitol al
10% antes de resuspenderse en medio de cultivo. Los protoplastos fraccionados se preincubaron durante 12 horas en
medio TM-2 que contena Caz + 3,3 mM sin hormonas aadidas (Shahin, 1985) a una densidad de 2 x 105 protoplastos por
ml. Despus de la preincubacin, los protoplastos se centrifugaron sobre una sacarosa
cojn como se ha dado anteriormente, y los protoplastos viables se lavaron y resuspendieron en el mismo medio de
incubacin antes de la exposicin al tratamiento como se indica. Despus del tratamiento, los protoplastos se centrifugaron
a 100 g durante 5 min. Los protoplastos en forma de grnulos se colocaron inmediatamente en Nz lquido y se almacen a -
8 C para el anlisis de ADN. Para la deteccin in situ de la fragmentacin del ADN. los protoplastos se incubaron
directamente sobre portaobjetos de microscopio SuperFrost Plus (Fisher Scientific) dentro de un Incu-Ring
(Polyscientific, Inc., Warrington, PA) a 24C bajo luz continua.

Eliminacin del ADN nuclear para el anlisis de la fragmentacin

Las incubaciones de protoplastos se realizaron a 24C en medio TM-2 en presencia de las respectivas toxinas u otras
enmiendas a las concentraciones indicadas. El ADN de protoplastos se aisl primero en Tris 100 mM, EMA 50 mM, SDS al
1%, pH 7,5, como tampn de extraccin, seguido por extraccin en fenol, cloroformo y una precipitacin final con etanol.
Despus de la digestin con RNasa a 100 pg1mL durante 1 h a VC, se separaron cantidades idnticas de ADN en un gel de
agarosa al 15% mediante electroforesis. Estndar se realizaron bioensayos foliares en fololos AsdAsc y asc / asc, como se
describi anteriormente (Gilchrist y Grogan, 1976), a 20 pM de toxina AAL para inducir una muerte celular de V50% sobre
una base de rea foliar. Se aisl ADN de hoja de tomate tratado con toxina utilizando el mtodo de nonfenol descrito por Tai
y Tanksley (1991), seguido de digestin con Rnasa A 100 pg / ml durante 1 h al 37%. La electroforesis en gel de agarosa se
realiz inmediatamente despusAislamiento del ADN. Finalmente, el ADN se transfiri a una membrana Nytran Plus
(Scheicher & Schuell) y se hibrid con una sonda de DNA genmico marcado con 3zP.

Deteccin Histoqumica de la Fragmentacin Nuclear de ADN y Cuerpos Apoptticos

Para la deteccin in situ de la fragmentacin del ADN, se aadieron volmenes iguales de formol tamponada al 10% (Fisher
Scientific) directamente a los protoplastos en los portaobjetos. Despus de secar a temperatura ambiente, los protoplastos
fijadosse lavaron con tampn TBS (NaCl 150 mM, Tris-HCl 100 mM, pH 7,4), se digirieron con proteinasa K (10 pglmL)
durante 10 minutos a temperatura ambiente, se lavaron con agua destilada, se aclararon brevemente con tampn de
desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) (Tris-HCl 25 mM, cacodilato sdico 200 mM, cloruro de cobalto 5 mM), y luego
se incubaron con la mezcla de marcaje (20 unidades de TdT, Boehringer Mannheim) y 1 nM de digoxigenina-11-dUTP
(Boehringer Mannheim) en 100 pL de TdT buffer
durante 1 h al 37%. La reaccin se termin enjuagando la seccin en NaCl 300 mM, citrato sdico 30 mM durante 30 min a
temperatura ambiente y luego se bloque con tampn TBS que contena BSA al 2%, Triton X-100 al 0,3% durante 10 min.
Los portaobjetos se lavaron tres veces en tampn TBS y luego se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con
anti-digoxigenina(Boehringer Mannheim) a una dilucin de 1:25 en TBS conteniendo 1% de BSA y 0,05% de Triton X - 100.

Despus del bloqueo y lavado con BSA como se ha indicado anteriormente, los protoplastos fijos se incubaron con el segundo
anticuerpo (anti-cabra conjugado con isotiocianato de fluorescena [FITC] Pierce, Rockford, IL) y se diluyeron 1:25 en TBS
con BSA durante 2 horas antes de contracolorar el ADN con Hoechst33342 (Sigma) a 5 pg / ml durante 10 min a temperatura
ambiente. Las diapositivas se visualizaron con un microscopio de fluorescencia Nikon SA (Nikon, FosterCity, CA).
Para la cuantificacin de la muerte celular programada inducida por toxina (pcd) en protoplastos de tomate, se realiz el
ensayo de marcado final TdT (TUNEL). El anticuerpo anti-digoxigenina se conjug con fosfatasa alcalina (1: 1000), y se utiliz
lmmuno Pure Red Rpido como sustrato (Pierce) para marcar las clulas con ADN fragmentado. La viabilidad de los
protoplastos se determin usando tincin de diacetate de fluorescena (Sigma)
a 0,01 mg / ml en un microscopio invertido Nikon Diaphot TMD. El nmero de protoplastos que reaccionaron con los
respectivos tratamientos de tincin se determin contando clulas dentro de campos individuales antes y despus del
tratamiento de contra-tincin. Cada determinacin se realiz con al menos 3000 protoplastos en cada uno de los tres
experimentos independientes para cada tratamiento.

Preparacin de secciones de tejidos enteros y races

Para la deteccin in situ de la muerte celular TUNEL-positiva en tejidos vegetales, los fololos de tomate, las puntas de las
races de tomate y las puntas de raz de cebolla se fijaron en formalina tamponada al 10% durante 20 minutos a vaco y luego
se transfirieron a sacarosa 0,6 M y se expusieron a vaco para un adicional de 20 min. Los tejidos fueron cortados en trozos
pequeos e incrustados en Histo Prep (Fisher Scientific) congelado en NP lquido y almacenado a -8OOC antes de seccionar
en un microt- metro Cyrocut 1800 (Reichet-Jung, Leica, Foster City, CA) a una temperatura de 10 pm. Despus de una
fijacin de 5 min en formalina tamponada, las secciones se digirieron con proteinasa K (10 pg / ml) durante 10 min a
temperatura ambiente y luego se sometieron al mtodo TUNEL descrito anteriormente, excepto que el anticuerpo conjugado
con fosfatasa alcalinase utiliz en lugar de FITC debido a la autofluorescencia fuerte en las secciones de tejido.
Notas de precaucin al aplicar el procedimiento TUNEL a Tejidos vegetales
Se encontr que el ensayo TUNEL posea una alta capacidad de etiquetado (Gorczyca et al., 1993) que podra generar
fcilmente artefactos de etiquetado final debido a concentraciones inapropiadas de reactivos o manipulacin de tejidos. Se
observaron con frecuencia coloracin intensa y tincin inespecfica cuando TdT y concentraciones de nucletidos. La
reduccin sustancial de la concentracin de nucletidos y de la enzima TdT por debajo de la prescrita para la tincin de las
clulas animales permiti una fuerte tincin de controles positivos en ausencia de interferencia de fondo. Como un ejemplo
de la sensibilidad del ensayo, es posible terminar la etiqueta de ADN no cortado si la reaccin se hace funcionar con exceso
de reactivos. Definimos rutinariamente las condiciones de reaccin con ADN no cortado como un control negativo. Tambin
se encontr que el tratamiento en exceso de proteinasa K causaba tincin inespecfica en secciones de tejido.
Se encontr que ciertos enfoques para la preparacin, tanto para el corte de la planta como para el tejido animal (Grasl-
Kraupp et al., 1995) pueden conducir a la generacin de artefactos y la incapacidad para producir tratamientos de control
positivo.Por ejemplo, la incrustacin en plstico o parafina, seguido
por fijacin estndar, hicieron, en nuestras manos, causar suficiente corte de ADN nuclear para dar una reaccin TUNEL
positiva en las secciones fijas. Al principio de nuestros estudios, observamos que enfoques similares a los utilizados por Mittler
et al. (1995) hizo que tanto las secciones tratadas como las de control fueran marcadas fuertemente. Por lo tanto, a menos
que se utilice el recuento de ADN para asegurar que el ADN sano no se corta durante el procesamiento de las secciones,
puede producirse un artefacto positivo TUNEL. Evidentemente, esta tcnica, aunque til y confiable, debe llevarse a cabo
bajo condiciones controladas, y los tratamientos de control apropiados deben ser conducidos en todo momento. Todos los
experimentos informados en este documento se repitieron al menos cinco veces, con todos los resultados enacuerdo a travs
de los experimentos.

EXPRESIONES DE GRATITUD
Agradecemos a Jeffery Dangl, a Martin Dickman, a James Lincoln, a Thomas Moore, ya Bert Overduin por las discusiones
provechosas durante el curso de este trabajo. La investigacin fue apoyada en parte por el Acuerdo Cooperativo de la
Fundacin Nacional de Ciencias (NSF) N BIR-8920216 al CEPRAP, Centro de Ciencia y Tecnologa de la NSF, y por
CEPRAP corporativoasociados: Calgene, Davis, CA; Ciba Biotechnology Corporation, ResearchTriangle Park, NC; Sandoz
Seeds, Palo Alto, CA; y ZenecaSeeds, Bracknell, Berkshire, Reino Unido.