Prctica N2: Tcnicas de Aislamiento de cidos Nucleicos:

Aislamiento de ADN genmico

El ADN genmico puede obtenerse a partir de cualquier microorganismo,

planta o animal en cualquier etapa de su desarrollo y nos provee copias
moleculares de genes de cada organismo. Este material puede entonces ser
utilizado para la construccin de bibliotecas, en anlisis de hibridacin, como
molde en reacciones de amplificacin y/o secuenciamiento, entre otras diversas
aplicaciones. celulares que pueden interferir con los experimentos
Para manipular o amplificar el ADN es necesario eliminar otros
componentes celulares como protenas, ARN y lpidos, sin daar al ADN. El
primero en aislar y purificar el ADN fue el qumico suizo Johann Friedrich Miescher
(1844-1895). En 1869, Miescher aisl a partir del ncleo de los globulos blancos
varias molculas ricas en fosfatos, a las cuales les llam nuclenas (cidos
nucleicos). El protocolo original de Miescher era burdo y el ADN obtenido no era
puro. La contaminacin con protenas era una de sus preocupaciones, por lo que
modific su protocolo agregando pepsina, una proteasa, para digerir las protenas
presentes
Actualmente existen varios mtodos para la extraccin y purificacin de los
cidos nucleicos, los cuales son seleccionados segn:
El tipo de cido nucleico a extraer (ADN genmico, ADN plasmdico, ARN
total, ARN mensajero, etc)
El organismo de donde se extraer (clulas animales, plantas, levaduras,
bacterias, virus, etc.)
El material de extraccin (rganos completos, tejidos, cultivos celulares,
sangre, muestras ambientales, etc.)
Los resultados deseados (rendimientos, pureza, tiempo de purificacin, etc.)
La aplicacin posterior (amplificacin, clonacin, expresin, transcripcin
reversa, etc.)
Los mtodos de aislamiento de cidos nucleicos, sin importar de que tipo o
procedencia, siguen siempre cuatro etapas fundamentales: Lisis celular, inhibicin
de nucleasas, desproteinizacin y precipitacin de cidos nucleicos. La diferencia
de cada mtodo radica en el pre-tratamiento, lo cual depender del origen de la
muestra, tambin debe considerarse que el mtodo de purificacin sea
perfectamente compatible con el uso futuro que se dar al ADN o ARN purificado.
El ADN puede aislarse, luego de la ruptura celular, aprovechando las
diferencias en las propiedades de los cidos nucleicos, protenas y dems
constituyentes celulares. Tras la lisis celular se trata de inhibir las nucleasas, que
de otra forma degradaran el material a purificar (suele utilizarse una solucin con
detergentes para solubilizar las membranas y sales caotrpicas fuertes para
inactivar las nucleasas). La muestra puede desproteinizarse ya sea por mtodos
qumicos (solventes orgnicos, detergentes no inicos, precipitacin salina) o
enzimticos (proteasas) y los cidos nucleicos suelen concentrarse mediante
precipitacin en alcohol y sales monovalentes como acetato de sodio o de amonio,
a bajas temperaturas.
Purificacin de cidos nucleicos
Los protocolos de purificacin de los cidos nucleicos a partir de los
extractos celulares frecuentemente son combinaciones de mtodos.
Extraccin/precipitacin
Extraccin con solventes para eliminar contaminantes, un ejemplo es la
combinacin de fenol y cloroformo para eliminar protenas.
Precipitacin selectiva mediante la utilizacin de altas concentraciones de sal
o cambios en el pH para precipitar las protenas.
Precipitacin de los cidos nucleicos con isopropanol o etanol, dado que el
ADN es insoluble en altas concentraciones de sal y alcohol. El ADN
precipitado forma unas finas hebras blancas, mientras que el resto de las
sustancias permanecen disueltas.
Cromatografa
Filtracin en gel, separando las molculas por su tamao molecular.
Intercambio inico, permite la separacin y concentracin de las molculas
por interacciones electrostticas con la matriz de la columna.
Adsorcin, los cidos nucleicos son retenidos selectivamente sobre
membranas de slica en presencia de altas concentraciones de ciertas sales,
mientras que otras molculas no lo son. Los cidos nucleicos posteriormente
son eludos con agua o un buffer (amortiguador).
Afinidad, los cidos nucleicos se unen a un ligando particular, el resto de
molculas se elimina con lavados, posteriormente se agrega una molcula
que compite por el ligando dejando libre a los cidos nucleicos.
Centrifugacin
La centrifugacin es un mtodo de purificacin importante utilizado
frecuentemente en combinacin con otros mtodos, como la filtracin en gel
y la cromatografa de adsorcin.
Electroforesis
La electroforesis se utiliza frecuentemente para determinar el tamao y la
integridad del ADN extrado.
Los cidos nucleicos pueden ser separados por electroforesis con base en su
peso molecular. Esta separacin se realiza ms comnmente en geles de
agarosa.
Objetivos:
1. Reconocer e identificar las etapas indispensables en los protocolos de
extraccin de ADN
2. Comparar tcnicas de extraccin de ADN
3. Establecer y emplear el procedimiento modelo para obtencin de ADN desde
la muestra establecida
Experimento I: Aislamiento de ADN genmico de Escherichia coli
Objetivos:
1. Extraer y purificar ADN genmico de clulas procariotas
Teora:
El ADN genmico es fcil de aislar y caracterizar pero ser de escasa
utilidad a menos que sea de elevado peso molecular, es decir, debe obtenerse con
la mnima ruptura y en abundancia, como para ser posteriormente manipulado. En
el caso de las bacterias, el pretratamiento que se lleva a cabo est destinado a la
digestin de la pared celular para liberar el contenido citoslico, y luego separar el
cromosoma usando sus propiedades diferenciales.
Materiales y Reactivos:
1. Cultivo de Escherichia coli en medio LB
2. Buffer High TE (Tris-HCl 25mM, pH 8; EDTA 20mM)
3. Buffer de lisis (High TE; NaCl 0.15 M; SDS 0.2%)
4. Buffer Low TE (Tris-HCl 50mM, pH 8; EDTA 1 mM)
5. Fenol saturado con TE
6. Cloroformo
7. Isopropanol o Etanol absoluto Grado biologa molecular a analtico
8. Etanol al 70%.
9. Solucin de precipitacin de protenas (Acetato de amonio 10M)
Procedimiento:
1. Cultivar por 16 horas la cepa de E.coli en 5ml de medio LB a 37C
2. Colectar las clulas por centrifugacin por 10 minutos a 2500 rpm o separar el
cultivo en tubos Eppendorf (1.5 ml) y centrifugar en microcentrfuga 1 minuto a
12000 rpm
3. Resuspender las clulas en 1ml de buffer High TE.
4. Centrifugar a 2500 rpm durante 10 minutos o 12000 rpm durante 1 minuto
5. Desechar el sobrenadante dejando un volumen de 40 l aproximadamente y
resuspender muy bien las clulas con el vrtex.
6. Agregar 1ml de solucin de lisis y mezclar suavemente por inversin e incubar a
80C por 5 minutos.
7. Dejar enfriar a temperatura ambiente y luego aadir 3 l de ARNasa. Mezclar
por inversin 2 a 5 veces e incubar a 37C por 1 hora
 El paso 7 se omitir en esta practica
8. Dejar enfriar a temperatura ambiente y luego *aadir 1ml de fenol y
homogeneizar por inversin cuidadosamente por 5 minutos.
9. Centrifugar a 3000 rpm por 10 minutos para separar las fases y aspirar la fase
superior (acuosa) que contiene el ADN y transferir a un nuevo tubo.
10. Adicionar a la fase acuosa 1 ml de cloroformo y homogeneizar por inversin
durante 5 minutos. Centrifugar a 3000 rpm por 10 minutos.
11. Transferir 1 ml del sobrenadante a un tubo nuevo, teniendo mucho cuidado.
12. Aadir 1 volumen (1ml) de isopropanol o etanol absoluto helado.
13. Mezclar muy bien por inversin y dejar en hielo por 45 minutos.
14. Centrifugar a 14000 rpm por 5 minutos o 3500 rpm por 15 minutos.
15. Desechar cuidadosamente el sobrenadante y lavar el sedimento con 1ml de
etanol al 70%.
16. En un tubo de microcentrfuga, centrifugar a 14000 rpm por 5 minutos.
17. Desechar el sobrenadante y dejar secar al aire.
18. Resuspender el ADN en 300 l de solucin de resuspensin (LowTE).
* Los pasos 8, 9 y 10 pueden reemplazarse por:
8. Dejar enfriar a TA y luego aadir 1ml de la solucin precipitacin de protenas
9. Mezclar muy bien con el vrtex por 1minuto e incubar en hielo por 10 minutos.
10. Centrifugar a 14000 rpm durante 10 minutos o 3500 rpm por 20 minutos
Experimento II: Aislamiento de ADN genmico animal
Objetivos:
1. Extraer y purificar ADN genmico a partir de tejido animal.
2. Observar el aislado yconfirmar su estructura fibrilar.
3. A partir de la gran longitud de las fibras de ADN verificar su replegamiento
en el ncleo celular.
Teora:
El ADN en eucariotas es el componente de la cromatina o el material
gentico. En la cromatina, el ADN se encuentra asociado a protenas conocidas
como nucleoprotenas de tipo histonas, protaminas y en menor proporcin con
protenas de tipo cidas. Para extraer el ADN sin arrastrar sus protenas asociadas
se podra emplear soluciones cidas. Sin embargo, stas soluciones podran daar
la estructura de la hebra, de modo que se prefiere emplear solventes orgnicos
como cloroformo, detergentes no inicos, sales o enzimas como proteasas, ya que
permiten extraer las protenas dejando insoluble al ADN.
El mtodo de aislamiento de ADN genmico que se emplear en la prctica
es una adaptacin del mtodo de aislamiento de Laird (1991) que se describe en
Sambrook et al. (2001) y que no emplea extraccin con fenol, ni cloroformo, ni
tampoco centrifugacin.
Materiales y Reactivos:
1. Manto de choro e Hgado de pollo
2. Buffer de lisis (Tris-HCl 10mM, pH 8; EDTA 5mM; SDS 0.2% NaCl 200mM;
Proteinasa K 0.1 mg/ml)
3. Isopropanol o etanol absoluto Grado biologa molecular a analtico
4. Buffer TE (Tris-HCl 10mM, pH 8; EDTA 1 mM)
Procedimiento
1. Lisis: Agregar 1 ml de buffer de lisis por cada 0.25 gramos de tejido e incubar a
55C por 20 minutos
2. Filtrar el homogenizado empleando una gasa estril
3. Precipitacin: Agregar un volumen de isopropanol al lisado y mezclar por
inversin hasta completar la precipitacin (unos 10-20 minutos, hasta que
desaparezca la viscosidad)
4. Recuperacin del precipitado: El ADN se recupera levantndolo con una punta
descartable de micropipeta.
5. Colocarlo en un tubo nuevo y dejar secar al ambiente el exceso de lquido
6. Resuspender el ADN entre 100 a 500ul de buffer TE pH 8 dependiendo de la
cantidad de tejido procesado. La resuspensin total requiere de varias horas en
agitacin a 37C o 55C (mejor overnight)
Experimento III: Aislamiento de ADN genmico vegetal
Objetivos:
1. Extraer y purificar ADN genmico vegetal
Teora
El ADN vegetal es ms difcil de obtener de una forma que sea luego
clonable o digerible, que el proporcionado por clulas animales, debido
principalmente a la presencia de metabolitos secundarios y polisacridos, los
cuales interfieren con el procedimiento de extraccin y se co-purifican con el ADN;
algunos de estos problemas pueden superarse usando hojas sin expandir.
Los tejidos de plantas son robustos y por lo tanto requieren pre-
tratamientos intensivos, tales como largas incubaciones enzimticas, molienda en
nitrgeno lquido con polvo de almina seguida por extraccin con el buffer CTAB,
etc. El mtodo aqu descrito proporciona cantidades relativamente puras de ADN
genmico que puede usarse como molde de amplificacin para tcnicas
fingerprinting (RAPDs, microsatelites, etc) (Griffin y Griffin, 1994)
Materiales y Reactivos
1. Hojas jvenes sin expandir de plntulas
2. Buffer de maceracin (Tris-HCl 200mM, pH 8; EDTA 25mM; SDS 0.5%; NaCl
0.25 M)
 3. Cloroformo
4. Isopropanol o Etanol absoluto Grado biologa molecular a analtico
5. Buffer TE (Tris-HCl 10mM, pH 8; EDTA 1 mM)
Procedimiento
1. Agregar 500 ul de buffer de maderacin por cada 0.15 gramos de hojas en un
tubo de microcentrfuga nuevo. Homogenizar hasta que se muestre de color
verde intenso.
2. Centrifugar a 14000 rpm por 1 minuto.
3. Agregar 1 volumen (400 ul) de cloroformo al sobrenadante y homogenizar por
inversin por 5 minutos.
4. Centrifugar a 14000 rpm por 1 minuto.
5. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo, teniendo cuidado de no tocar el
precipitado.
6. Aadir 1 volumen de isopropanol helado. Mezclar muy bien por inversin y
dejar en hielo por 20 minutos.
7. Centrifugar a 14000 rpm por 5 minutos y desechar cuidadosamente el
sobrenadante.
8. Lavar el sedimento con 1 volumen de etanol al 70% y centrifugar a 14000 rpm
por 5 minutos.
9. Desechar el sobrenadante y dejar secar al aire.
10. Resuspender el ADN en 50 l de bufferTE
Cuestionario
1. Explique la funcin del EDTA, SDS y NaCl para extraccin de ADN
2. Qu son la lisozima y la mutanolisina?
3. Cul es la diferencia entre extraccin y purificacin de cidos nucleicos?
4. Cul es la diferencia entre ADN genmico y ADN cromosmico?
5. Para qu se realiza el macerado de la muestra biolgica?
6. Qu aplicaciones se permiten con las tcnicas de extraccin y purificacin de
ADN?
7. Consulte otras tcnicas o kit de extraccin de ADN y explique el fundamento de
una de estas, especificando el uso de los reactivos claves
Bibliografa
Ausubel F, Brent R, Kingston R, Moore D, Seidman J, Smith J y Struhl K,
editores. Current Protocolos in Molecular Biology. Massachusetts General
Hospital: Harvard Medical School; 1990.
David LG, Dibner MD y Battery JF. Bassin methods in molecular biology.
Elsevier Science Publishing Co. Ind. NY. 1986
 Laird PW, Zijderveld A, Linders K, Rudnicki MA, Jaenisch R y Berns A .
Simplified mammalian DNA isolation procedure. Nucleic Acids Research 1991;
19(15): 4293
Perbal B. A practical guide to molecular cloning. 2nd edition John Wiley 6 Sons;
1988
Griffin HG y Griffin AM, editores. PCR technology Current Innovations. Boca
Ratn: CRC Press; 1994.
Sambrook J, Fritsch EF y Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual.
2da ed. Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1989.