INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLGICAS

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGA
GENTICA MICROBIANA

AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIN DE DNA

CROMOSMICO

lvarez Lagunes Jorge Eliseo

Arias Gamarra Citlali Yolotzin

Equipo 1
Seccin 1

Biol. Sergio Mora Ramrez

Q.B.P. Octavio Gmez Guzmn
Q.B.P. Francisco Espaol Espaol
M. en C. Vernica Prez Enrquez

Grupo: 5QV1

07- Septiembre- 2017

INTRODUCCIN
El DNA es biopolmero de desoxirribonucletidos. Tales unidades monomricas se
componen de un grupo fosfato, desoxirribosa y una base nitrogenada que puede ser
prica (adenina o guanina) o pirimidnica (citosina o timina).
Las purinas y pirimidinas son heterociclos que contienen nitrgeno, estructuras cclicas
que contienen, adems de carbono, otros (hetero) tomos, como nitrgeno. La naturaleza
planar de las purinas y las pirimidinas facilita su asociacin estrecha, o apilamiento, que
estabiliza el DNA bicatenario. Los dobles enlaces conjugados de derivados de purina y
pirimidina absorben luz ultravioleta. Si bien los espectros son dependientes del pH, a pH
de 7.0 todos los nucletidos comunes absorben luz a una longitud de onda cercana a 260
nm. De este modo, la concentracin de nucletidos y cidos nucleicos suele expresarse
en trminos de absorbancia a 260 nm.
El grupo 5-fosforilo de un mononucletido puede esterificar un segundo grupo 3-
hidroxilo, lo que forma un fosfodister. La unin de desoxirribonucletidos por enlaces
fosfodister para formas cadenas sencillas es la estructura primaria.
La estructura secundaria del DNA se debe a la unin de dos cadenas complementarias
mediante puentes de hidrgeno y el apilamiento de bases que contribuye a su estabilidad
por fuerzas de Van der Waals. La complementariedad de bases fue descrita por Watson
y Crick, en la cual, la guanina se une a la citosina por tres puentes de hidrgeno y la
timina con la adenina por solo dos puentes de hidrgeno.
Cuando una doble cadena se separa, perdiendo los puentes de hidrgeno y el
apilamiento de bases, se dice que se desnaturaliza. Con la desnaturalizacin del DNA se
manifiesta un incremento de la absorbancia de 260 nm, enfecto denominado
hipercrmico. Tambin ocurre el efecto hipercrmico residual cuando aun una cadena
sencilla, al ser hidrolizada, aumenta su absorbancia de 260 nm.
La desnaturalizacin o fusin del DNA puede ocurrir por efecto del pH y principalmente
por aumento de la temperatura. Cada DNA de un organismo, tiene un punto de fusin
(Tm) caracterstico que representa la temperatura a la cual el 50% del DNA dplex, se
encuentra como cadena sencilla.
La representacin grfica de absorbancia a 260 nm contra temperatura es una curva de
desnaturalizacin, es sigmoidea. Resalta que un DNA no sufre cambios (efecto
hipercrmico) importantes hasta los 75 C aprox. y posteriormente ocurre un cambio
abrupto de absorbancia. Ese cambio es un aumento de alrededor de 35% de la
absorbancia en un intervalo de temperatura corto de alrededor de 4 C.
El DNA se puede renaturalizar si se enfra de forma lenta. La disminucin gradual de la
energa cintica favorece el apareamiento correcto de las bases de cadenas
complementarias.
OBJETIVOS
Aislar DNA cromosmico de alto peso molecular, a partir de una cepa de
Escherichia coli W3350, establecer el espectro de absorcin, as como el grado
pureza y concentracin por diferentes mtodos del DNA obtenido.
Emplear un programa bioinformtico para determinar el efecto del %G-C, la
secuencia y longitud del DNA sobre la Tm del mismo.
FUNDAMENTO
El propsito del aislamiento del DNA es separarlo de todos los componentes de la clula,
manteniendo la estructura del DNA, facilitando el
aislamiento y previniendo la modificacin
qumica del DNA por componentes liberados
durante el rompimiento celular.
Todos los mtodos de aislamiento incluyen
cuatro pasos esenciales: rompimiento de la
clula, remocin de protenas y RNA, concentrar
y determinar la pureza y concentracin de DNA.
Los dos obstculos ms comunes para obtencin de DNA son las fuerzas hidrodinmicas
y la degradacin por DNAsas no especficas. Durante el mtodo se usan diferentes
reactivos con el fin de cumplir con los cuatro pasos mencionados anteriormente. (Tabla
2).
Paso Reactivo Uso
El TRIS es un buffer que tiene una gran
capacidad de regulatoria a pH entre 7.6 y 9.0.
El EDTA es un agente quelante que
secuestra los iones Mg++ necesarios como
cofactor para la actividad de las DNAsas esto
resulta en la
Tris/EDTA (50/20 mM)
Preparacin Se usa dos veces, la primera es para remover
del medio el caldo y todos los componentes del mismo,
para el donde se encontraban suspendidas las
rompimiento clulas, la segunda adicin se realiza con el
celular fin de mantener un pH estable para la adicin
de la RNAsa.
Enzima degradadora de RNA, requiere ser
activada y agregada antes de la lisis celular,
RNAsa 10mg/mL para que lleve a cabo sus funciones desde el
momento en que se lisan las primeras
clulas.
Enzima que rompe los enlaces 1-4 de la
Lisozima 50mg/mL
Rompimiento peptidoglicana.
celular Los detergentes ayudan a inhibir DNAsas
SDS al 10%
como a la lisis celular por la formacin de
 micelas mixtas, ya que se insertan micelas
del detergente a la membrana fosfolipdica,
una vez que la lisozima ha roto los enlaces
dichos.
El medio interno de la clula contiene muchos
metabolitos secundarios e iones, por lo que
su funcin es regular al liberarse estos de la
Tris/EDTA (10/1 mM)
clula, adems de brindar el volumen
necesario para que la concentracin de NaCl
disminuya a 0.5 aproximadamente.
Al adicionarla su concentracin disminuye a
0.5M, aproximadamente, la cual es suficiente
para mantener fuerza inica del medio y con
NaCl 5M esto la rigidez del DNA, a su vez puede
solubilizar a los detergentes, de esta manera
cuando se retire el Tris/EDTA, los
detergentes tambin se retiraran.
Este penetra al centro hidrfobo de las
protenas, cambiando su conformacin y
hacindolas ms solubles en fenol que en
Fenol saturado
agua, aunque el DNA tiene una parte
hidrofbica esta no interacciona tan
fuertemente con el fenol.
El cloroformo es un solvente orgnico que
Remocin de
funciona de manera similar al fenol, sin
RNA y
embargo al ser totalmente inmiscible en
protenas
agua, este requiere de un agente
Cloroformo: Alcohol emulsificador, el cul es el alcohol isoamlico,
isoamlico (24:1) de esta manera al agitar, las protenas con
grupos no polares expuestos quedan en la
fase fenlica, la interfase mantiene molculas
medianamente polares. De la misma manera
remueve las trazas de fenol.
Precipita al DNA por fenmeno de
desolvatacin, adems de disminuir la
Isopropanol fro energa cintica de las molculas al estar fro,
Concentracin a la vez remueve aminocidos, nucletidos y
del DNA componentes de bajo peso molecular
Funciona de manera similar al isopropanol,
Etanol fro al 70% pero este adems remueve sales y restos de
isopropanol que pudieran quedar.
Determinacin Con esto tendremos como resultado una
Agua destilada estril
de conc. Y solucin de DNA aislado, til para leer en el
o Tris/EDTA
pureza espectrofotmetro.

RESULTADOS
Tabla 1. Resultados de absorbancia, pureza y concentracin obtenidos. Las lecturas de absorbancia fueron obtenidas con

nanodrop, la concentracin uno se calcul ocupando la formula = , la concentracin 2 se calcul considerando que una
22,500
unidad de absorbancia de DNA de doble cadena equivale a 50g/ml de DNA de doble cadena; la concentracin 3 corresponde a
la obtenida por Nanodrop.

Abs Abs Conc. 1 Conc. 2 Conc. 3

Equipo Pureza
(260nm) (280nm) (g/mL) (g/mL) (g/mL)
1 1.43 0.757 1.89 63.5 71.5 71.5
2 2.881 1.493 1.924 128 144.05 144
3 0.345 0.208 1.658 15.33 17.25 17.2
4 1.115 0.347 1.84 49.5 55.75 70.2
5 1.181 0.664 1.77 52.48 59.05 59
6 1.533 0.768 1.95 68.13 76.6 76.6

Fig. 1 Espectro de absorcin del DNA aislado

DISCUSIN
En esta prctica se sigui el protocolo descrito en el fundamento (vese tabla 1) para
aislar DNA de Escherichia coli. El cual se caracteriz por espectrofotometra midiendo las
absorbancias a 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290 y 300 nanmetros (vese tabla 2).

El DNA aislado tuvo una pureza de 1.89, esta es una relacin para evaluar la pureza del
DNA frente a la contaminacin con protenas, particularmente de aminocidos
aromticos. El valor obtenido es lo suficientemente alto para considerarse apto para
posteriores anlisis. En caso de haberse obtenido una pureza menor, se precisa de un
lavado con cloroformo-alcohol isoamlico 24:1 y volver a precipitar con etanol al 70%
En el espectro de absorcin (vese fig. 1) se obtuvo un pico mximo a 260 nm, que
corresponde a la molcula de DNA, descartando la posibilidad de RNA ya que se utiliz
RNAsa en el proceso de aislamiento y los ribonucletidos remanentes fueron descartados
al decantar el sobrenadante de los lavados con etanol al 70%.
Otro ndice de pureza es Abs260/Abs270 para determinar contaminacin por fenol, ya
que, este tiene un pico de absorbancia mximo a 270 nm. Las preparaciones de cidos
nucleicos sin contaminacin fenlica presentan este ndice de alrededor de 1.2 En
nuestro caso este ndice es de 1.28

La absorcin de luz UV a una longitud de onda de 230 nm significa que lamuestra est
contaminada con iones pptidos, compuestos aromticos u otras sutancias. Para
muestras puras de cidos nuclicos el ndice 260/230 se espera en el rango 2.0-2.2;
muestras con un ndice menor indican la presencia de contamintantes que absorben a
230 nm, como EDTA, carbohidratos y fenol. Nuestra lectura de 230 nm fue cero; pudiendo
deberse a que el blanco estuviera contaminado con alguna de las sutancias que absorben
a 230 nm como el EDTA y carbohidratos.
La concentracin determinada por el equipo Nanodrop fue de 71.5 g/ml, la misma
calculada con la relacin que establece que una unidad de absorbancia es igual a 50
g/ml. Tambin se calcul la concentracin con la formula (Abs 260)/(22500/b) dando el
valor de 63.55 g/ml, donde b es el paso de luz por la celda utilizada en un
espectrofotmetro convencional. La razn por la cual, las lecturas de absorbancia del
Nanodrop son mayores a 2 (como si la transmitancia fuese menor al 0%) se debe a que
este aparato no utiliza celdas y la alcuota utilizada es del oreden de 1 a 3 L dejando un
minsculo paso de luz que se refleja en la ecuacin como una disminucin del
denominador y aumento neto de la absorbancia.

En cuanto al rendimiento, Surzycki menciona que, de un ttulo de entre 2 y 4x10 10 de

Escherichia coli, se pueden obtener de 200 a 300 g/ml. Si nuestro cultivo en caldo Luria
se encontraba al menos en fase estacionaria, tenemos que nuestro rendimiento es bajo
y se pudo deber a fallas en la precipitacin del DNA debido una insuficiente agitacin o
incluso a una prdida parcial del pellet de DNA.
Influencia de los parmetros longitud, secuencia y porcentaje de guanina-citosina
sobre la desnaturalizacin de desoxirribonucletido determinada por el software
DNAMAN
Influencia del contenido GC
AAAAACCCCCTTTTTGGGGGAAAAACCCCCTTTTTGGGGG
50%GC
Thermo %GC GC+AT
83.2 C 67.9 C 120 C
AAAAATTTTTCCCCCCCCCCGGGGGGGGGGAAAAACCCCC
62.5% GC
Thermo %GC GC+AT
88.5 C 73.0 C 130 C

GGGGGGGGGGCCCCCCCCCCGGGGGCCCCCAAAAACCCCC
83.5% GC
Thermo %GC GC+AT
97.5 C 83.3 C 150 C

Influencia de la variacin en la secuencia

AAAAAAAAAAGGGGGGGGGGTTTTTTTTTTCCCCCCCCCC
Thermo %GC GC+AT
83.4 C 67.9 C 120 C

AAAAAGGGGGTTTTTCCCCCAAAAAGGGGGTTTTTCCCCC
Thermo %GC GC+AT
82.8 C 67.9 C 120 C

AGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTC
Thermo %GC GC+AT
75.2 C 67.9 C 120 C

Influencia de la longitud de la secuencia

AGTCAAGTCAAGTCA
Thermo %GC GC+AT
35.6C 43.0 C 42.0 C

AGTCAAGTCAAGTCAAGTCAAGTCAAGTCA
Thermo %GC GC+AT
65.7 C 59.6 C 84.0 C
AGTCAAGTCAAGTCAAGTCAAGTCAAGTCAAGTCAAGTCAAGTCAAGTCAAGTCAA
GTCA
Thermo %GC GC+AT
81.8 68.0 168.0

El aumento en el contenido de guanina-citosina aumenta los tres valores de Tm dados

por DNAMAN. El contenido de pares de bases guanina y citosina es determinante en la
temperatura de fusin porque estas bases pueden formar tres puentes de hidrgeno
resultando ms fuertes que solo dos puentes que se forman entre adenina-timina. De
hecho al graficar el porcentaje de guanina-citosina contra la Tm de diversos
microorganismos se obtiene un comportamiento lineal que brinda una ecuacin para
relacionar Tm y %GC (Tm=69.3+0.41(%GC)

La modificacin de la secuencia, cuando la longitud y porcentaje GC son constantes, solo

afecta al valor de Tm thermo. Esperamos que la Tm, en general sea modificada por la
secuencia. En los oligonucletidos diseados se manifiesta que conforme se intercalan
ms pares G-C con pares A-T la Tm thermo disminuye. Una razn para explicar lo anterior
es el efecto cooperativo en la desnaturalizacin; En el primer oligonucletido hay
segmentos largos de GC en el segundo y tercer oligo se intercalaron pares A-T, en este
ltimo parece fcil que los pares GC se separen teniendo de vecinos a dos pares de
bases A-T
Por ltimo, el aumento de la longitud de los oligonucletidos incrementa los tres valores
de Tm.

Si no se conociera la estructura de un oligonucletido sera ms til, entonces, valerse

del valor thermo dado por el software DNAMAN.

CONCLUSIONES
El DNA cromosmico de E. coli aislado es til para trabajar, por su pureza de 1.89
y su concentracin de 71.5 g/mL.
El DNA aislado es casi libre de protenas.
La combinacin de los mtodos de Marmur y Kyrbi con fenol y cloroformo-alcohol
isoamlico, es efectiva en la extraccin de DNA
El DNA cromosmico de E. coli aislado presenta un espectro de absorcin
caracterstico para DNA.
El nanodrop es til para determinar concentraciones de DNA que son pequeas.
Los factores longitud, secuencia y %GC son determinantes en la Tm de
oligonucletidos
REFERENCIAS
Surzycki, S. Basic Techniques in Molecular Biology. Springer Science & Business. 2000.
Pp. 1-25
Nelson D, Cox M.. (2009). Principios de bioqumica Quinta edicin. Barcelona, Espaa:
Ediciones Omega.