Marco terico

Con el permanente inters de estudio y anlisis de las bacterias se han

desarrollado tcnicas para visualizar cada una de ellas con sus respectivas
morfologas, pero se descubri que con aadir colorante a las mismas se podan
observar an ms cada una de sus estructuras y caractersticas de acuerdo al
color que cada bacteria retenga en su membrana externa, con esto descubierto
se desarroll el siguiente concepto tincin. Segn Balbuena, B. (2017), tincin
es una tcnica, utilizada en microscopa para mejorar el contraste en la imagen
vista al microscopio. Los diferentes colorantes pueden ser utilizados para
aumentar la definicin y examinar grandes cortes de tejido, poblaciones celulares
o incluso para resaltar organelos dentro de clulas individuales.

TIPOS DE TINCIN

Simples: El azul de metileno, por ejemplo este tipo, nos permite observar la
existencia de bacterias, su morfologa, su agrupacin, la presencia de esporos y
la existencia de otros tipos de clulas.

Diferenciales: Por ejemplo la coloracin Gram y la Ziehl Nielseen, cumple la

funcin de la tincin simple y adems, permite la diferenciacin de las bacterias,
porque usan diferentes colorantes que se comportan distinto segn el
microorganismo en cuestin la coloracin Gram es la ms usada en
bacteriologa. Se dividen en Gram positivas y Gram negativas las primeras se
tienen de color azul violeta y las segundas adquieren un color rosado o rojo,
segn Balbuena, B. (2017).

Especiales o Negativa. Se usan para objetivar distintas estructuras como la

cpsula, el ncleo, los flagelos, los esporos, etc.
Tipo de tincin diferencial

Empleado en microbiologa para la visualizacin de bacterias, sobre todo en

muestras clnicas, tincin Gram, debe su nombre al bacterilogo dans Christian
Gram, que desarroll la tcnica en 1884 .Este mtodo se utiliza para referirse a
la morfologa celular bacteriana , como para realizar una primera aproximacin
a la diferenciacin bacteriana, segn Balbuena, B.(2017).
Para dicho experimento se cuenta con bacterias Gram positivas, el Bacillus sp.,
Staphylococcus sp., y Gram negativas como son la Escherichia coli y la
Salmonella sp.

Adems de ello, estn los reactivos, componentes fundamentales para llevar a

cabo el proceso: Alcohol acetona, cristal violeta, safranina y el aceite de
inmersin.
Cristal violeta: Es el nombre dado a un grupo de compuestos qumicos
empleados como indicadores de pH y colorantes. Son mezclas de: N-tetra, N-
penta y N-hexametil p-rosanilinas. Por la mezcla de diferentes versiones, el
fabricante puede crear diferentes tonos de violeta en el colorante final. Cuanto
ms mutilado est el colorante, su color ser de un violeta ms oscuro:

Safranina: Es un colorante biolgico, de contraste que se utiliza en la Tincin de

Gram para proporcionar un color violeta ms intenso a las bacterias Gram+ y
tie de rosa a las bacterias G- ; en histologa y en citologa. La safranina se usa
como lquido de contraste en algunos protocolos de tincin, coloreando el ncleo
celular de rojo. Tambin para detectar cartlago, mucina y grnulos de
mastocitos.

Lugol: Es una disolucin de yodo molecular y yoduro potsico en agua destilada.

Fue preparada por primera vez en 1829 y nombrada en honor al mdico francs
J.G.A. Lugol. Este producto se emplea frecuentemente como desinfectante y
antisptico, para la desinfeccin de agua en emergencias y como un reactivo
para la prueba del yodo en anlisis mdicos y de laboratorio.
Aceite de inmersin: Se utiliza para aumentar la resolucin de un microscopio
mediante la inmersin de la lente objetivo y el espcimen en un aceite
transparente de alto ndice de refraccin.

Fuente: Balbuena, B. (2017).

Bacteria Gram positiva y negativa

Las bacterias Gram positivas y Gram negativas tienen de forma distinta debido
a las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared
de la clula Gram positiva, es gruesa y consiste en varias capas internectadas
de peptidoglicano asi como algo de cido teicoico. Generalmente, 80%-90% de
la pared de la clula Gram positiva es peptidoglicano, segn Balbuena, B.(2017).

Por otro lado, la pared de la clula Gram negativa, contiene una capa mucho
ms delgada, nicamente de peptidoglicano y est rodeada por una membrana
exterior compuesta de fosfolpidos, lipopolisacridos, y lipoprotenas. Slo el
10%-20% de la pared de la clula Gram negativa es peptidoglicano. Las clulas
fijadas al calor sobre un porta objetos se tienen, primero con una solucin de
cristal violeta otros colorantes bsicos no son tan efectivos y son lavadas
despus para quitar el exceso de colorante en este estado, todas las clulas,
tanto las Gram positivas como las Gram negativas, estn teidas de azul, segn,
Balbuena, B. (2017).

La diferencia esencial entre esos dos tipos de clulas est por tanto en su
resistencia a la decoloracin, esta resistencia se debe probablemente al hecho
de que en el caso de bacterias Gram negativas, la mezcla de alcohol acetona es
un solvente lipdico y disuelve la membrana exterior de la pared de la clula y
tambin puede daar la membrana citoplasma a la que se une peptidoglicano.

Las clulas Gram positivas, a causa de sus paredes celulares ms espesas

tienen ms peptidoglicano y menos lpidos, no son permeables al disolvente, ya
que, ste deshidrata la pared celular y cierra los poros, disminuyendo as el
espacio entre las molculas y provocando que el de complejo cristal violeta
quede atrapado dentro de la pared celular despus de la decoloracin las clulas
Gram positivas son todava azules, pero las Gram negativas son incoloras, segn
Balbuena, B. (2017).
Discusin

Pudimos observar con la tincin de Gram que la bacteria staphylococcus y el

Bacillus, es una bacteria Gram positiva, esto se debe a que esta bacteria
posee una gruesa capa de peptidoglucano. El cristal violeta penetr, en esta
clula, el lugol hizo que el cristal violeta se fijara intensamente en la pared
bacteria de la clula y se formara un complejo entre los dos.

Dicho resultado ocurre , porque la capa de peptidoglicano le proporciona una

gran resistencia a estas bacterias y es la responsable de retener el tinte durante
la tincin de Gram al poseer una gran proporcin de este polmero complejo
(murena) la cual no la hace susceptibles a la accin del solvente orgnico, sino
que este acta deshidratando los poros cerrndolos, lo que impide que pueda
escaparse el complejo cristal violeta, y manteniendo la coloracin azul-violcea,
segn Gonzlez , J(2013).A diferencia de las Gram-negativas Escherichia Coli y
Salmonella, estas bacterias no presentan una segunda membrana lipdica
externa.

El alcohol acetona nos sirvi para

realizar la decoloracin, pero como esta es una bacteria positiva (staphylococcus
y el Bacillus), no se
descolor a diferencia de la otra muestra de la bacteria enterobacter, que se
pudo observar que es una bacteria Gram negativa (Escherichia Coli y
Salmonella) en este procedimiento con el alcohol acetona estas se decoloran y
por eso se usa la safranina que es un colorante de contraste y podemos observar
su color rosado. Estas clases de bacteria pose una capa de
peptidoglucano delgada.

De manera ms amplia , el autor menciona que , la coloracin de las bacterias

Gram negativas, se debe a las caractersticas que poseen dichas bacterias en
su pared celular , lo cual poseen en su pared celular una capa delgada de
peptidoglicano (murena) unida a una membrana externa formada por protenas,
fosfolpidos y polisacridos, la cantidad de colorante cristal violeta y del lugol
que retiene es mnima, en comparacin a las bacterias Gram positivas, que tiene
varias capas de peptidoglucano unido a la membrana plasmtica.
Por lo cual el complejo de la molculas de cristal violeta, lugol y cido teicoico
que se forma en la pared celular de las Gram positivas, es muy difcil de remover,
lo que no sucede con las Gram negativas, porque el cristal violeta y el lugol no
reaccionan con el cido teicocio, debido a que las bacterias Gram negativas en
su pared celular no lo tienen, Segun Martnez R. (2009 ).Por otra parte, la
membrana externa que poseen las bacterias Gram negativas es soluble en
compuestos orgnicos, como a la mezcla de alcohol y acetona.

Concluyendo la discusin, la diferencia que se observ en la resistencia a la

decoloracin, se debe a que la membrana externa de las Gram negativas es
soluble en solventes orgnicos, como por ejemplo la mezcla de alcohol/acetona.
La capa de peptidoglucano que posee es demasiado delgada como para poder
retener el complejo de cristal violeta que se form previamente, y por lo tanto
este complejo se escapa, perdindose la coloracin azul-violcea. Por el
contrario, las Gram positivas, al poseer una pared celular ms resistente y con
mayor proporcin de peptidoglicanos, no son susceptibles a la accin del
solvente orgnico, sino que este acta deshidratando los poros cerrndolos, lo
que impide que pueda escaparse el complejo cristal violeta/yodo, y manteniendo
la coloracin azul-violcea, segn Daz , C. (2011)

.
Referencias bibliogrficas.

Balbuena, B(2017). Tincin Gram. Lima-Per. Recuperado de:

http://www.academia.edu/18829021_tincion_gram.

Martinez Roberto. (2009). Bacteria gram positiva [En lnea]. Disponible:

http://martinez-roberto.blogspot.com/. Citado: 19/10/2013

Daz Camilo (2011). Definicin de tincin. [En lnea]. Disponible:

http://es.scribd.com/doc/52811425/Tinciones-en-Microbiologia-Seminario.
Citado: 19/11/2013