Laboratorio final

1. OBJETIVOS
Realizar el mtodo de susceptibilidad de ciertos microorganismos a
ciertos antimicrobianos.
Observar como algunos microorganismos son resistentes o no a ciertos
microorganismos.

Creo que podemos resumir coloando algunas cosas no todas para que
no se vea tan clinico y sea mas bien un concepto general yo en la parte
de agentes pondra

2. Introduccin

ANTIBIOGRAMA: Consiste en el estudio de la sensibilidad o resistencia de

determinado microorganismo (o grupo de ellos) a varios antibiticos. Se puede
utilizar para tratar un patgeno, aadir a alimentos, en definitiva para saber
como se comporta un germen frente a determinado antibitico.

Los antibiticos en general pueden ser de amplio espectro o de espectro

reducido, estos ltimos van a matar grmenes ms especficamente.
Dependiendo del origen o localizacin de la infeccin, se va a utilizar uno u
otro.

AGENTES ANTIMICROBIANOS (ANTIBITICOS O ATB)

Un antibitico ha sido definido como una sustancia qumica producida por un
microorganismo capaz de inhibir el desarrollo de otros microorganismos. Los
antibiticos modificados por manipulaciones qumicas aun se consideran como
tales. Un agente antimicrobiano es activo contra los microorganismos y puede
ser producido en forma natural por microorganismos o sintticamente en el
laboratorio.

Antibiticos primariamente bactericidas: Ejercen una accin letal e

irreversible sobre el microbio: (Fosfomicina Vancomicina. B-Lactmicos
Polimixina. Aminoglucsidos Rifampicina. Acido Nalidxico Quinoleinas.
Nitrofurantoinas)

Antibiticos primariamente bacteriostticos.Inhiben el crecimiento

pero no matan al microorganismo, permitiendo que las propias defensas
del huesped pueden eliminar a las bacterias: tetraciclina, cloranfenicol,
sulfonamidas, trimetropin, lincomicina, clindamicina, macrolidos.

Cefalosporinas, grupo de antibiticos semisintticos de amplio espectro y de

estructura betalactmica, que actan sobre las bacterias sensibles mediante la
inhibicin de la sntesis de la pared celular.
Entre las cefalosporinas de primera generacin se pueden incluir, por ejemplo,
la cefalotina, la cefazolina y la cefalexina. En el grupo de las de segunda
generacin estn la cefoxitina, el cefaclor y el cefonicid, y en el ltimo grupo,
las de tercera generacin, destacan la cefotaxima y la ceftriaxona

TIPOS: Pueden ser Bactericidas o Bacteriostticos

1 Bactericidas: ATB con capacidad para destruir microorganismos sensibles
o susceptibles, sin que medie la participacin de las defensas humorales
o celulares del husped.
2 Bacteriostticos: ATBG que inhiben de forma reversible los procesos
metablicos esenciales de cierta bacteria.

Origen de Agentes Microbianos:

ATB Verdaderos: Son sustancias de origen biolgico como por ej. las
penicilinas, quienes derivan de un hongo del gnero penicillium.
Quimioterpicos verdaderos: Son sustancias que derivan de sntesis
qumica, como por ej. las sulfamidas, las cuales surgieron de los estudios
realizados sobre las anilinas.
Agentes Antimicrobianos Nuevos: Son Sustancias obtenidas por
manipulacin molecular de ATB verdaderos y/o Quimioterpicos verdaderos,
con el fin de ampliar sus espectros de accin sobre microorganismos o bien
para mejorar sus caractersticas farmacolgicas.

.- RESISTENCIA BACTERIANA A LOS ATB:

Debido al uso excesivo, inadecuado, frecuente e irracional de los ATB, las
bacterias las bacterias se volvieron ms resistentes a ellos; esto contribuy a la
seleccin de especies resistentes y a la aparicin de microorganismos
multiresistentes, que ante el vaco ecolgico creado por el mal uso de ATB,
encuentran condiciones favorables para la multiplicacin y proliferacin
Los diferentes tipos de resistencia son:

(Teniendo en cuenta que bajo estas caracteristicas los microorganismos pueden

presentar sierto grado de resistencia bacteriana el cual consiste en un espectro
natural de actividad antibacteriana, Este espectro comprende las especies
bacterianas que, en su estado natural, sufren una inhibicin de su crecimiento por
concentraciones de su antibitico susceptibles de ser alcanzadas in vivo. A estas
especies bacterianas se les dice naturalmente sensibles a dicho antibitico ej:
Klebsiella pneumoniae a las penicilinas (ampicilina, amoxicilina) . Las especies
bacterianas que no se encuentran incluidas dentro de dicho espectro se denominan
naturalmente resistentes entre otras.)

* Resistencia Natural

* Resistencia Secundaria
* Resistencia Mutacional

* Resistencia Transferible

SUSCEPTIBILIDAD DE LAS BACTERIAS A LOS ATB : Cuando la resistencia

bacteriana comenz a ser un fenmeno frecuente (debido al mal uso de los
ATB) adquiri gran importancia el empleo de pruebas de sensibilidad
antimicrobianas, ya que estas nos permiten determinar la respuesta a ellos por
parte de cepas individuales dentro de cada especie. El empleo de ATB para
cada antibiograma se debe decidir en funcin de : la especie aislada, de los ATB
disponibles en la institucin y del foco de la infeccin.
Conceptos:
CIM: concentracin mnima de inhibicin. Es la concentracin ms baja de
un ATB capaz de inhibir el crecimiento de un microorganismo en condiciones
estandarizadas
CBM: concentracin mxima bactericida. Es la concentracin ms baja de
un ATB capaz de destruir una porcin predeterminada de un inculo (en
general el 99,9 %) en un tiempo determinado
PIS: poder inhibitorio del suero. Es la mayor dilucin de un ATB en el suero
del paciente, capaz de inhibir el desarrollo visible de un microorganismo.

PBS: poder bactericida del suero. Es la mayor dilucin de un ATB en el

suero del paciente, capaz de matar al inculo en un 99,9 %

CONCEPTO DE ANTIBIOGRAMA: Conjunto de procedimientos que permiten

determinar la sensibilidad in vitro de un microorganismo ante un determinado
ATB.
Las pruebas de sensibilidad o susceptibilidad antimicrobianas que se utilizan
para determinar la actividad de un ATB frente a una cepa en particular, son
principalmente de 2 tipos: Antibiograma en medio lquido como en medio
slido.
No concidero que esto valla aqu creo que es la informacin que ya tenemos
arriba
DIFUSIN EN DISCOS DE AGAR Se realiza en medios slidos y es la prueba
ms usada (de rutina) en los laboratorios. Permite probar la eficacia de varios
ATB al mismo tiempo.

Con este mtodo determinamos la CIM. Para ello se siembra, en un medio de

cultivo slido (Agar), una suspensin de microorganismos (10 8 UFC/ml) y sobre
esto se colocan discos o monodiscos de papel embebidos en concentraciones
arbitrarias y conocidas de ATB. En el Agar hmedo, el ATB difunde desde los
discos, con lo cual su concentracin va decreciendo a partir del disco. Luego se
incuba adecuadamente (EJ. 24 48 HS) y a continuacin observaremos los
Halos de Inhibicin del Crecimiento Bacteriano; inmediatamente medimos (en
mm) el dimetro que poseen los halos de inhibicin.
El Punto de corte de los halos, corresponde a un valor de CIM equivalente a la
concentracin de ATB que se alcanza en suero. Finalmente se compara la
lectura realizada con tablas internacionales y se determina la sensibilidad o
resistencia del microorganismo, clasificando a la cepa como Sensible (S) o
Resistente y/o Intermedia (R) para ese ATB.

Agar de Muller-Hinton. Se utilizan para poner los antibiticos, unos discos

impregnados que llevan unas letras que nos indican el antibitico del que se
trata y un nmero que indica la concentracin en mg/ml que tena la disolucin
en la que se impregnaron.

Adems utilizamos unas pinzas para poner los discos sobre el agar. Pipetas
estriles para sembrar la placa. Un hisopo estril para extender por la superficie
el inculo. Y asa de siembra y mechero para esterilizar.

Partimos de un cultivo puro de 48 horas. La cepa es potencialmente patgena

de humano y como crece en nuestro cuerpo, la incubacin se ha hecho a 37C.
Vamos a sembrar 0.5ml que cogemos con la pipeta (agitando para resuspender
las clulas del fondo) y lo vertemos sobre la placa. Con el hisopo estril
extendemos bien el inculo por toda la superficie de la placa. Con las pinzas
cogemos los cuatro discos de antibiticos y los ponemos en la placa bien
separados entre si y de los bordes.

La placa se pone a incubar 48 horas a 37C y en posicin invertida. Tras la

incubacin va a aparecer toda la superficie llena de colonias y alrededor de
cada disco aparecer o no un halo de inhibicin dependiendo de que el germen
sea sensible a ese antibitico.

El tamao del halo nos va a permitir conocer el grado de sensibilidad al

antibitico o si es resistente. Puede aparecer un pequeo halo aun siendo
resistente, esto se debe a la alta concentracin de antibitico en el medio
inmediato al disco.
 Se observala especial disminucin de la intensidad de crecimiento del
microorganismo en la zona interior del halo de inhibicin del disco de CTX-30,
debido probablemente a la aparicin de mutantes resistentes de dicho
microorganismo capaces de soportar en mayor medida que el resto el efecto
inhibitorio del antibitico.

DILUCIN EN CALDO Puede realizarse en medios de cultivos lquidos o

slidos. Es un mtodo cuantitativo que sirve para determinar la sensibilidad y
resistencia de las bacterias.

Consiste en determinar el crecimiento de una bacteria en presencia de

concentraciones decrecientes de ATB.
Este mtodo permite determinar la CIM
(concentracin Inhibitoria mnima) y la CBM
(concentracin bactericida mnima). Para
determinar la CIM se utilizan una serie de tubos
de ensayo en los cuales se va colocando
sucesivamente el ATB a doble dilucin; luego se
siembra el microorganismo. La CIM corresponder
al primer tubo de ensayo donde no se observe
turbidez (la turbidez indica que existe crecimiento
bacteriano). Para determinar la CBM
seleccionamos los tubos donde no observemos
turbidez y sembramos su contenido sobre un
medio de cultivo slido, luego observaremos si
hay o no desarrollo de colonias. LA CBM
corresponder a aquella dilucin donde no ha
crecimiento bacteriano alguno.

METODO DE E-TEST Es uno de los mtodos ms recientes que se han

presentado en el mercado y resulta de una curiosa combinacin de
caractersticas de los mtodos anteriores. Se trata de una tcnica cuantitativa
en placa que permite obtener una lectura directa de CMI en g/ml, ya que se
emplean tiras plsticas impregnadas en concentraciones crecientes de
antibitico indicadas en una escala graduada sobre la propia tira.

Una de sus grandes ventajas, dadas sus caractersticas, es que resulta un

mtodo ideal para estudiar cualquier tipo de microorganismo, aerobio o
anaerobio, incluyendo aquellos llamados "fastidiosos" o los que tengan
requerimientos especiales para crecer.

El microorganismo a investigar se inocula en una placa y sobre ella se deposita

la tira del antibitico (o antibiticos) a ensayar. Tras la incubacin de 16-24
horas a 35C se observan las placas y se valora la zona de inhibicin, de forma
elptica, alrededor de cada tira. La CMI se lee directamente observando el punto
ms bajo de la elipse que presente crecimiento.

PRUEBA : DIFUSIN DE DISCO EN PLACA(por ser el mas utilizado en

los laboratorios)
(MTODO DE KIRBY BAUER)
Esta tcnica es aplicable a la mayora de las bacterias aerbicas, tomando
algunas consideraciones para bacterias nutricionalmente exigentes. No es til
en el caso de bacterias anaerbicas ni otras bacterias de crecimiento lento, no
slo por la tasa de replicacin sino por las condiciones de incubacin, ya que la
presencia de una atmsfera anaerbica puede modificar el pH del medio de
cultivo (Meller Hinton) e interferir con la difusin del antibacteriano, por lo cual
se prefiere determinar la susceptibilidad de estas bacterias por dilucin en
caldo.( el metodo de dilucion en agar creo que es para medir la concentracin
bacrteriana para saber que concentracion de ellas vamos a hechar en las cajas
de petri para saber que concentracin de bacterias necesitamos debemos de
tener en cuentea que para la preparacin del inoculo es necesario recoger 45
colonias de un cultivo puro tranferir a un tubo con 35 ml de caldo incubar a
35C de 28h hasta observar turbidez o por encima de la escala0.5 de
McFarland realizamos vortex y ajustamos turbidez visualmente con agua esteril
o solucion salina o caldo hasta q de= o parecido al estandar de
12*10exp8UFC/ml y alternativamente medir la suspensin en un
espectofotometro teniendo como blanco al caldo patron y la muestra

Finalidad de los antibiograma Bajo estos conocimientos previos

comprenderemos que la finalidad de un antibiograma el de medir la
sensibilidad de una cepa bacteriana que se sospecha es la responsable de una
infeccin a uno o varios antibiticos orientando a desiciones teraputicas
individuales, adems de llevar un control acerca de la evolucin de la
resistencia microbiana frente a decisiones epidemiolgicas.
:
3.Materiales:
1. Cepa bacteriana pura en caldo BHI o Nutritivo
2. Placas de Agar Meller Hinton
3. Discos de Antibiticos
4. Mechero
5. Pinza algodonera (trae tu propia pinza para aligerar el trabajo)
6. Tubos con agua destilada estril
7. Asa de platino en aro
8. Patrn McFarland 0,5 (equivalente a 1 x 108 bacterias / mL)
9. Aplicadores de madera estriles
Muestras:
1. Cepa de Escherichia coli
2. Cepa de Staphylococcus aureus
4.Procedimiento:
1. Inicialmente se debe preparar una suspensin bacteriana en agua
destilada estril, utilizando la cepa a evaluar y alcanzando una densidad
ptica comparable visualmente con el patrn 0,5 de McFarland
(equivalente a 1 x 108 bacterias / mL). Esto se logra con repetidas tomas
del cultivo original con el asa, haciendo pases al tubo con agua destilada
estril hasta que la turbidez sea cercana al patrn.
2. Se impregna un aplicador de madera estril en la suspensin de la
bacteria preparada y se procede a inocular la placa de agar Meller
Hinton haciendo una dispersin uniforme sobre toda la superficie del
mismo. Para ello se debe recorrer toda la superficie con el aplicador de
extremo a extremo de la placa con un estriado bien cerrado, girando el
aplicador y cambiando la direccin del estriado una vez que se ha
culminado de cubrir toda la placa (figura 1). Esto con la finalidad de
garantizar un inculo homogneo en forma de csped regular.

Figura 1. Tcnica de inoculacin del agar para la prueba de difusin del disco

3. Se procede a colocar con una pinza algodonera los diferentes discos de

antibiticos a ensayar, cuidando de esterilizar la misma antes de tomar el
 disco y despus de colocarlo. Resulta importante en este paso tratar de
colocar los discos sobre la superficie del medio sin daar el agar pero
ejerciendo suficiente presin para que el disco no se desprenda al voltear
la placa. Tambin se debe cuidar de no colocar los discos muy cerca
unos de otros ni exagerar en la cantidad de discos por placa para evitar
que los halos de inhibicin, de haberlos, se superpongan e interfiera esto
con la lectura (Figura 2).

Figura 2. Colocacin de los discos de antibiticos

4. Una vez colocados todos los antibiticos a ensayar se procede a cerrar la
placa y voltearla para evitar la precipitacin de humedad condensada en
la tapa. Se puede dejar unos minutos en el refrigerador para favorecer la
difusin del antibitico en el agar y posteriormente se lleva a la
incubadora por 24 horas a 37C.
5. Transcurrido el tiempo de incubacin se procede a realizar la lectura del
antibiograma midiendo con regla milimetrada el dimetro de los halos de
inhibicin de los discos. Se comparan las lecturas con las tablas indicadas
por el CLSI y se realiza el reporte del resultado: R = resistente, S =
susceptible, I = intermedio (margen de seguridad para manejo de
efectos colaterales en dosis elevadas o inseguridad del efecto)

Advertencias:
1. Los discos de antibiticos no deben ser manipulados con las manos
pues podran ejercer efecto sobre la flora habitual de la piel.
2. De caerse uno de los discos fuera de la placa, este debe ser
desechado.
3. De caerse uno de los discos dentro de la placa el mismo no debe ser
removido ni movilizado hacia otra zona del agar.

Escala McFarland

TuboNo 0.5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Cloraron de 0.05 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0
bario

H2SO4 9.95 9.9 9.8 9.7 9.6 9.5 9.4 9.3 9.2 9.1 9.0
 1.5 3 6 9 12 15 18 21 24 27
D108m.o/mL

Su origen se debi al descubrimiento de la actividad antibitica de un

hongo, el Cephalosporium acremonium. Se pudo comprobar que los
cultivos de este hongo inhiban el crecimiento in vitro de
Staphylococcus aureus y curaban las infecciones estafiloccicas y la
fiebre tifoidea en el hombre.no veo necesario que esto valla aqui

El mecanismo de actuacin de las cefalosporinas es de tipo bactericida

(destruyen las bacterias susceptibles), y slo es eficaz sobre las bacterias que
se encuentran en fase de crecimiento. En funcin de su espectro de actividad
estos antibiticos se han ido agrupando en distintas generaciones.. creo que
el mecanismo de actuacin frente a todos lo ATB son de la misma actuacin
son o R,I,S.

PERFILES FENOTIPICOS EN BACILOS GRAM NEGATIVOS

1. Produccin de enzimas inactivadotas de antibiticos, acetil transferasas y -

lactamasas (incluyendo -lactamasas de espectro extendido o BLEE).

2. Alteracin de los sitios de accin del antibitico, p.e., protenas de unin a la

penicilina (PBP) alteradas.

3. Disminucin de la concentracin antibitica ya sea por impermeabilidad o

mecanismos de bombeo hacia el exterior5

FALTA COMO SE LEE LECTURA QUE NO LO EN CONTRE

5. Informe de antibiograma

use el criterio especificado por CLSI para interpretar las zonas de

inhibicin para cada agente antimicrobiano.

reporte el resultado con la categoras:

Ejemplo:
Ampicilina R
Cefazolina S
Ciprofloxacina I

6. Realice las siguientes preguntas

1. cree usted que se puede hacer unn estudio de susceptibilidad a un
cultivo mixto? explique por que
2. Que hara usted si a un viedo lo ataca una bacteria que le quito
sus propiedades? Enuncie que hara usted?