D E PA RTA M E N T O L A B O R AT O R I O B I O M D I C O N A C I O N A L Y D E R E F E R E N C I A

Instituto de
Salud Pblica
Ministerio de Salud

DOCUMENTOS TCNICOS PARA EL LABORATORIO CLNICO

RECOMENDACIONES PARA LABORATORIOS

QUE REALIZAN LA TCNICA DE REACCIN
EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR):
REAS Y FLUJOS DE TRABAJO
ENERO, 2017 | VERSIN 1
RECOMENDACIONES PARA LABORATORIOS QUE REALIZAN LA TCNICA
DE REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR): REAS Y FLUJOS DE TRABAJO

AUTORES
Biol. Jorge Fernndez Ordenes. PhD.
Jefe Subdepartamento Gentica Molecular.
Departamento Laboratorio Biomdico Nacional y de Referencia.
Instituto de Salud Pblica de Chile.
BQ. Soledad Ulloa Urrutia.
Profesional Subdepartamento de Gentica Molecular.
Subdepartamento de Gentica Molecular.
Departamento Laboratorio Biomdico Nacional y de Referencia.
Instituto de Salud Pblica de Chile.

REVISORES INSTITUTO DE SALUD PBLICA REVISORES EXTERNOS

Winston Andrade Lillo. PhD. Dra. Marcela Lagos Lucero.
Profesional Seccin Virus Respiratorios y Exantemticos. Jefe de Laboratorio de Biologa Molecular y Citogentica.
Subdepartamento de Enfermedades Virales. Departamento de Laboratorios Clnicos.
Departamento Laboratorio Biomdico Nacional y de Referencia. Facultad de Medicina, Pontificia Universidad Catlica de Chile.
Instituto de Salud Pblica de Chile.
Dra. Gabriela Muoz Gmez.
BQ. Pamela Araya Rodrguez. Jefe de Laboratorio de Biologa Molecular.
Jefe de Seccin Bacteriologa. Servicio de Laboratorio Clnico.
Subdepartamento Enfermedades Infecciosas. Hospital Clnico Universidad de Chile.
Departamento Laboratorio Biomdico Nacional y de Referencia.
Instituto de Salud Pblica de Chile.
BQ. Monserrat Balanda Apey.
Profesional Seccin Virus Oncognicos.
Subdepartamento Enfermedades Virales.
Departamento Laboratorio Biomdico Nacional y de Referencia.
Instituto de Salud Pblica de Chile.
BQ. Rodrigo Fasce Pineda.
Jefe Subdepartamento de Enfermedades Virales.
Departamento Laboratorio Biomdico Nacional y de Referencia.
Instituto de Salud Pblica de Chile.
Dr. Juan Carlos Hormazbal Opazo.
Jefe Subdepartamento Enfermedades Infecciosas.
Departamento Laboratorio Biomdico Nacional y de Referencia.
Instituto de Salud Pblica de Chile.
Biol. Daniel Ibez Cabrera.
Profesional Seccin Bacteriologa.
Subdepartamento Enfermedades Infecciosas.
Departamento Laboratorio Biomdico Nacional y de Referencia.
Instituto de Salud Pblica de Chile.
Dra. Vernica Ramrez Muoz.
Jefe Subdepartamento Coordinacin Externa.
Departamento Laboratorio Biomdico Nacional y de Referencia.
Instituto de Salud Pblica de Chile.
BQ. Javier Tognarelli Santiago.
Profesional Subdepartamento de Gentica Molecular.
Subdepartamento de Gentica Molecular.
Departamento Laboratorio Biomdico Nacional y de Referencia.
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RECOMENDACIONES PARA LABORATORIOS QUE
REALIZAN LA TCNICA DE REACCIN EN CADENA DE
LA POLIMERASA (PCR): REAS Y FLUJOS DE TRABAJO
RESUMEN
El siguiente documento entrega recomenda-
ciones sobre las reas y flujos de trabajo para los
laboratorios que realizan tcnicas de PCR, conside-
rando principalmente dos elementos que se deben
tener en cuenta al disear e implementar un labo-
ratorio de PCR: la separacin de reas de trabajo
con sets independientes de equipamiento, que no
se comparten entre reas, y el flujo unidireccional
de trabajo desde el rea ms limpia (Pre-PCR) hacia
la ms sucia (Post-PCR). La rigurosa aplicacin de
las medidas presentadas en este documento per-
mitir un control efectivo de la contaminacin con
cidos nucleicos, asegurando resultados confiables
en laboratorios que realizan la tcnica de PCR. Cabe
destacar que, tanto la infraestructura y disposicin
de las reas en el laboratorio como el entrenamiento
que reciba el personal dedicado a realizar esta tcni-
ca, son fundamentales para el xito en la aplicacin
de estas recomendaciones.
ALCANCE
Estas recomendaciones aplican a los laborato-
rios que realizan tcnicas de PCR de punto final y
de tiempo real. Se excluyen de estas recomenda-
ciones aquellos formatos de PCR automatizados
que realizan el proceso completo desde extraccin
a deteccin.
INTRODUCCIN
La Reaccin en Cadena de la Polimera-
sa (PCR) fue descrita en el ao 1986 por Kary
Mullis como una amplificacin enzimtica espec-
fica de ADN realizada in vitro, es decir, donde un
segmento particular de ADN es copiado y espec-
ficamente amplificado al ser delimitado por un par
de partidores (oligonucletidos) que lo flanquean.
El copiado se logra de forma exponencial a travs
de repetidos ciclos de diferentes etapas y tempe-
raturas de incubacin en presencia de una enzima
ADN-polimerasa termoestable.
La PCR es una tcnica rpida y verstil, convir-
tindose hasta la fecha en una tcnica comnmente
utilizada en diversos laboratorios. Tiene ventajas ta-
les como requerir una cantidad mnima de templado
en la reaccin, el cual no necesariamente debe estar
puro, permitiendo una fcil y rpida obtencin de
resultados. Sin embargo, la experiencia ha permi-
tido identificar una gran limitante, como es la alta
susceptibilidad de contaminacin en alguna de las
etapas de la tcnica: la extraccin del templado, la
preparacin de reactivos, la dispensacin o carga
del templado y la etapa de electroforesis (slo para
el PCR de punto final).
Para minimizar este problema existen cier-
tas condiciones que deben ser controladas, tales
como: separar reas de trabajo contaminadas con
templado de aquellas reas libres de l con sets
independientes de equipamiento que no se deben
compartir entre reas (micropipetas, gradillas,
delantales, guantes, coolers, toalla absorbente,
alcohol, lpices marcadores, microtubos, mini-
centrfugas, refrigeradores, etc) y mantener un flu-
jo unidireccional de trabajo desde las reas ms
limpias hacia las ms sucias.
Este documento est dedicado a describir las
recomendaciones de consenso a nivel internacio-
nal sobre cmo establecer un laboratorio de PCR
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 RECOMENDACIONES PARA LABORATORIOS QUE REALIZAN LA TCNICA
DE REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR): REAS Y FLUJOS DE TRABAJO

con condiciones fsicas ptimas para el control donde la acumulacin de amplicones generados se
de la contaminacin y obtencin de resultados visualiza al final de un nmero predeterminado de
confiables. ciclos, generalmente mediante electroforesis.
Muchas veces, algunos de los recursos necesa- PCR de tiempo real: Permite detectar la cintica
rios para el ptimo desarrollo de las actividades ya de la acumulacin de amplicones durante cada ciclo
estn presentes, por lo que el proceso de conver- inmediatamente, sin necesidad de una electrofore-
sin es ms fcil. Sin embargo, es preciso mencio- sis posterior mediante la deteccin y cuantificacin
nar que cada laboratorio de PCR tiene sus propios en cada ciclo de una seal de fluorescencia emitida
requisitos, los cuales deben ser cuidadosamente por una molcula reportera: sonda (TaqMan, FRET,
considerados cuando se evala lo necesario para Scorpion, Molecular Beacons, etc), Primers (Ampli-
iniciar y operar este tipo de laboratorio con xito. fluor, D-Lux) intercaladores de cidos nucleicos
En cuanto al personal encargado de realizar en- (SYBR-Green, Yoduro de propidio,etc).
sayos de PCR, ste debe estar capacitado en el co-
rrecto uso de los implementos, reactivos, equipos Templado: cido nucleico (ADN o ARN) utilizado
y todo aquello que est relacionado con la tcnica. como molde para la PCR, es decir, a partir de esta
molcula sern sintetizadas las copias idnticas co-
nocidas como amplicones.
DEFINICIONES Termociclador: Equipo que permite realizar de
forma automtica los ciclos de temperatura necesa-
Amplicn: Conjunto de molculas de ADN idnti-
rios para una PCR. El termociclador es diferente si
cas, resultado de una reaccin en cadena de la po-
se realiza una PCR de punto final o una PCR de
limerasa (PCR). Tambin se conoce como producto
tiempo real, ya que este ltimo debe detectar fluo-
de PCR, producto amplificado o amplificado.
rescencia y en diferentes canales de absorcin.
rea limpia: Espacio fsico libre de amplicones,
Fluorforo: Molcula o parte de ella que emite
templados de ADN y de muestras biolgicas que
fluorescencia luego de ser excitada con luz.
pudieran contaminar futuras PCR. Corresponde al
rea de preparacin de reactivos, tambin llamada
Pre-PCR.
DESARROLLO
rea sucia: Espacio fsico donde existe presen-
cia y manipulacin de amplicones, ADN/ARN y/o I.- REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERA-
muestras biolgicas. Comprende las reas de Ex- SA (PCR)
traccin del templado, rea de Carga dispensacin Esta tcnica se realiza en un equipo Termocicla-
del templado, rea de Amplificacin (donde estn dor y consta, generalmente, de tres etapas:
los termocicladores) y, para el caso de PCR de pun- 1.- Denaturacin inicial.
to final, el rea de Electroforesis.
2.- Amplificacin, en una treintena de ciclos repe-
Mezcla de PCR: Preparacin y mezcla de los titivos.
componentes necesarios para que ocurra una reac-
cin de PCR tales como agua libre de nucleasas, 3.- Elongacin final, si es PCR de punto final.
tampn (buffer), Mg+2, dNTPs, partidores, sondas A su vez, cada uno de los ciclos repetitivos de la
(para PCR de tiempo real) y enzima polimerasa ter- etapa 2 est conformado por 3 subetapas:
moestable (Taq polimerasa, Pfu).
i. Denaturacin a 94C-96C, que provoca
PCR de punto final: Tambin conocido como la ruptura de los puentes de hidrgeno y
PCR convencional permite visualizar, mediante una la separacin de la doble hebra del ADN
electroforesis, la acumulacin de amplicones ge- en simple hebra, quedando expuestas las
nerados al final de un nmero predeterminado de bases nitrogenadas del templado.
ciclos. Tambin conocido como PCR convencional,

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ii Hibridacin de los partidores (y la sonda si sntesis o extensin de la cadena. Esto provoca

es PCR de tiempo real) a una temperatura la liberacin del fluorforo y su separacin del
que oscila entre 45C-65C (que depende apagador, producindose fluorescencia.
del contenido y proporcin de nucletidos 3.- Sondas Molecular Beacons: oligonucletido
de los partidores). En esta etapa ocurre la que contiene un fluorforo en su extremo 5 y
hibridacin de los partidores especficos un apagador (quencher) en su extremo 3. Los
con su regin complementaria en el tem- extremos de esta molcula son complementa-
plado. La temperatura de esta etapa es rios entre s, encontrndose en forma de hor-
variable, y es dependiente de la tempera- quilla y el fluorforo apagado. Al unirse la son-
tura de fusin (Tm) de los partidores. En da al templado, fluorforo y apagador se alejan,
el caso de la PCR de tiempo real realizada producindose la fluorescencia.
con sondas TaqMan (las ms comunes),
esta etapa generalmente se realiza a 60C Para diagnstico clnico, se recomienda la utili-
e incluye la hibridacin y elongacin junto zacin de sondas (puntos 2 y 3) dadas su alta es-
con la lectura de la fluorescencia. pecificidad.
iii. Elongacin a 68C-72C, temperatura a la
que la polimerasa va aadiendo los dife-
rentes nucletidos libres, en el orden que III.- CONTAMINACIN DE LA PCR
le va dictando la secuencia de nucletidos La contaminacin de las reacciones de PCR es
de la cadena que acta como templado, un problema inherente para los laboratorios que
desde el extremo 3` de los partidores. realizan este procedimiento. Sin embargo, hay una
serie de medidas para controlar o minimizar esta
Una vez finalizada la reaccin en el termocicla- contaminacin, y el grado de rigor que se requiere
dor, se obtienen millones de copias de amplicones. en un laboratorio a menudo se determina segn el
Si ha ocurrido contaminacin durante la prepa- formato de PCR y de extraccin que se utilice.
racin de la PCR, podran obtenerse amplicones Antes de planificar el diseo del laboratorio es
inespecficos, es decir, que no correspondan al ADN primordial conocer las fuentes y las vas comunes
diana requerido, o bien falsos positivos por conta- de contaminacin:
minacin con templado o amplicones, alterndose
la confiabilidad de los resultados. 1.- Fuentes de contaminacin:
Corresponden a templados y amplicones.
Las fuentes de contaminacin pueden provenir
II.- FLUORFOROS PARA PCR DE TIEMPO de las muestras biolgicas que se manipulan
REAL durante la etapa de extraccin y/o la etapa de
carga o dispensacin durante la preparacin de
1.- SYBR Green: fluorforo que es capaz de unirse la reaccin de PCR, y en el caso de la PCR de
a cualquier molcula de ADN de doble hebra punto final, de los amplicones manipulados en
(amplicn especfico, amplicn inespecfico el rea de Post-PCR.
y dmeros de partidores). Por lo tanto, es una Ellas pueden ser muy problemticas debido a
tcnica menos especfica y no se recomienda su gran estabilidad, contaminando equipos,
su uso en diagnstico clnico, ya que puede superficies, micropipetas, microtubos, solu-
producir falsos positivos. ciones, guantes, delantales, gradillas, coolers
2.- Sondas TaqMan: oligonucletido que contiene y lpices marcadores.
un fluorforo en su extremo 5 y un apagador 2.- Vas de contaminacin:
(quencher) en su extremo 3. Durante la PCR, - Generacin de Aerosoles
la sonda se une al templado y luego es hidro- La formacin de estas microgotas con
lizada por la enzima Taq polimerasa durante la cidos nucleicos puede originarse por la

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apertura de tubos que contengan: partido- IV.- Recomendaciones para disminuir la

res, sondas (PCR en tiempo real), templa- contaminacin:
dos y/o amplicones. Los aerosoles son de 1.- Generales
fcil dispersin y pueden contaminar los
materiales (guantes, gradillas, tubos) y las 1.1 Limpiar las reas de trabajo antes y des-
superficies de trabajo. pus de su uso con Etanol 70%

- Derrame de soluciones 1.2 Utilizar guantes (sin talco) durante todos

El contacto de soluciones que contengan
cidos nucleicos (partidores, templado
y amplicones) con la superficie de traba-
jo es una va comn de contaminacin.
Esto puede ocurrir por volcamiento de
microtubos (y el consecuente derrame de
la solucin) o por la disposicin de tapas
de microtubos y puntas de micropipeta ya
utilizadas sobre las superficies, que dejan
residuos contaminantes.
Las fuentes de contaminacin pueden prove-
nir de las muestras biolgicas que se manipulan
durante la etapa de extraccin y/o la etapa de car-
ga o dispensacin durante la preparacin de la
reaccin de PCR, y en el caso de la PCR de punto
final, de los amplicones manipulados en el rea
de Post-PCR.
Ellas pueden ser muy problemticas debido a
su gran estabilidad, contaminando equipos, su-
perficies, micropipetas, microtubos, soluciones,
guantes, delantales, gradillas, coolers y lpices
marcadores.
Para disminuir los riesgos de contaminacin
en esta metodologa, debe realizarse un cuidadoso
estudio de la ubicacin de las diferentes reas del
proceso. A su vez, es fundamental el uso exclusi-
vo de equipamiento, guantes sin polvo, soluciones
descontaminantes y material de laboratorio en cada
rea. En caso de disear una nueva infraestructura,
es recomendable considerar los flujos de aire con
presiones positiva en el rea limpia y negativa en el
rea sucia, as como el uso de cabinas de PCR que
posean luz ultravioleta.
los procedimientos
1.3 No tocar reactivos, tubos y/o equipos con
las manos descubiertas (sin guantes)
1.4 No almacenar en un mismo refrigerador/
congelador, reactivos libres de templado
junto con cidos nucleicos purificados y/o
con muestras biolgicas. Los refrigerado-
res/congeladores deben encontrarse en el
rea designada (sucia o limpia) para evitar
el traslado de muestras o reactivos de un
lugar a otro dentro del laboratorio.
1.5 Eliminar cualquier reactivo donde se de-
tecte o sospeche contaminacin: partidor,
sonda, agua, enzima, etc. Para evitar pr-
didas de los stocks de reactivos por con-
taminacin, se recomienda preparar al-
cuotas previo a su uso, de manera de slo
eliminar la alcuota en uso si se detecta
contaminacin.
1.6 Centrifugar brevemente (spin) los tubos
que contengan cidos nucleicos y luego
abrirlos cuidadosamente (sin tocar la zona
interna de tapas y tubos) para evitar conta-
minar los guantes y las superficies.
1.7 Descontaminar la superficie utilizada para
preparar las reacciones de PCR y los
materiales (gradillas, micropipetas, lpi-
ces, contenedores de desechos, coolers,
guantes) con soluciones descontaminan-
tes como DNAZap (Invitrogen), RNase
Away (Ambion), DNA Away (VWR),
DNA Remover (Minerva Biolabs), entre
otras, con radiacin ultravioleta 15 a 30
min (degrada cidos nucleicos) y/o Eta-
nol al 70% (alto poder germicida) antes y
despus de la preparacin. Si se sospecha
contaminacin, adicionalmente, una vez
terminado el trabajo, pueden limpiarse las

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 superficies con una solucin de 0,5- 1,0 %
de hipoclorito de sodio, que luego debe ser
removido con etanol 70%.
1.8 Mantener siempre un flujo de trabajo uni-
direccional.
1.9 Las puntas para micropipetas utilizadas en
todas las reas deben tener filtro para evitar
la contaminacin de las mismas por forma-
cin de aerosoles.
2.- Especficas
2.1.-Controles del proceso
Incorporar uno o ms de los siguientes
controles, para tener un mejor control y de-
teccin oportuna de las contaminaciones.
Cada uno de los controles mencionados
debe trabajarse en un tubo separado y ser
sometido a PCR.
a.- Control de extraccin:
Utilizar un reactivo, por ejemplo agua
estril libre de nucleasas, y manipularlo
como una muestra biolgica ms durante
el proceso de extraccin de cidos nu-
cleicos. Luego de la PCR y electroforesis
debe arrojar un resultado negativo.
b.- Control de reactivos:
Preparar la mezcla de reactivos en el rea
limpia y mantener el tubo cerrado durante
el resto del proceso. Permite chequear los
reactivos que se estn utilizando para la
preparacin de las mezclas de PCR. Lue-
go de la PCR y electroforesis debe arrojar
un resultado negativo.
c.- Control de manipulacin:
Agregar agua en uno o ms microtubos
en lugar de templado durante el proceso
de carga en la preparacin de la PCR.
Permite chequear la manipulacin, por
parte del operador, de las muestras con
templados. Luego de la PCR y electrofo-
resis debe arrojar un resultado negativo.
d.- Control de rplica:
Para todo laboratorio que trabaje con PCR
de tiempo real, adems de utilizar los
controles antes mencionados, se sugiere
trabajar cada muestra utilizando rplicas
para descartar posibles falsos positivos,
dada la alta sensibilidad de la tcnica.
2.2- Degradacin de contaminantes
Para la PCR de punto final, la adicin de
Uracil-N-Glicosilasa (UNG) en conjunto
con dUTP (en lugar de dTTP) a la mezcla
de PCR, permite inactivar enzimticamente
los amplicones de amplificaciones anterio-
res para evitar que sean futuras fuentes de
contaminacin. Durante la PCR, los ampli-
cones sern sintetizados utilizando dUTP
en vez de dTTP; para una prxima PCR, en
caso de haber contaminacin por amplico-
nes (contaminacin carry-over), la previa
incubacin con enzima UNG degradar los
productos que contengan dUTP, inactivn-
dolos como templado.
V.- INHIBICIN DE LA PCR
Existen diversas causas por las que se puede
inhibir una reaccin de PCR provocando resultados
falsos negativos:
1.- Sustancias inhibidoras de la PCR
1.1 Sustancias de origen biolgico presentes en la
matriz de la muestra. Se han descrito muchas
sustancias inhibidoras de la reaccin de PCR
dependiendo del material del cual proviene la
muestra a testear como sales biliares y poli-
sacridos complejos de las heces; colgeno
de tejidos animales; grupo hem, hemoglobina,
lactoferrina e inmunoglobulina G de sangre;
melanina y eumelanina de pelo y piel; miog-
lobina del tejido muscular; iones calcio de la
leche y huesos; urea de la orina, entre otros,
que pueden disminuir en distintas medidas la
eficiencia de la PCR. Otras sustancias como la
heparina tambin inhiben una PCR.
1.2 Sustancias qumicas de uso comn en los la-
boratorios. Fenol, SDS, el polvo de los guan-
tes, fijadores a base de mercurio, detergentes
como Tritn X-100, ditiotreitol, EDTA, filtros
de nitrocelulosa, formaldehido, dicromato de
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potasio, entre otros, se han descrito como inhi- e.- Controlar las condiciones de conservacin de
bidores de la PCR.
Para evitar que esto ocurra es crucial utilizar un
buen mtodo de extraccin de cidos nuclei-
cos, especfico para cada tipo de muestra, que
asegure la eliminacin de tales compuestos.
2.- Degradacin de cidos nucleicos
La principal causa de degradacin de los cidos
nucleicos es la presencia de nucleasas (ADNasas
y ARNasas) provenientes de tejidos/organismos
contaminantes, as como esporas de bacterias y
hongos, fluidos corporales y las clulas muertas de
las propias manos del operador de la tcnica, que
pueden contaminar micropipetas, gradillas, coolers,
superficies y reactivos, destruyendo los partidores
y/o las sondas de la reaccin de PCR y el templado
de la muestra, ocasionando como resultado falsos
negativos. Otra causa de degradacin es la mala
conservacin de las muestras: (a) a mayor tempera-
tura ambiente hay mayor degradacin y (b) a mayor
nmero de congelaciones y descongelaciones su-
cesivas hay mayor degradacin.
Para evitar estas degradaciones se recomienda:
las muestras desde su toma hasta su procesa-
miento.
VI.- FLUJOS Y REAS DE TRABAJO
Durante el desarrollo de una PCR se recono-
cen diferentes reas, limpias o sucias, segn su
potencial de contaminacin, las que deben ser
consideradas en el diseo del laboratorio y en el
flujo de trabajo, para la obtencin de resultados
de PCR confiables.
Cada vez que un operador ingrese a un rea
de trabajo diferente debe ponerse guantes nuevos
y delantal exclusivo, y utilizar slo los equipos y
materiales disponibles en esa rea. Los delantales,
guantes, gradillas, lpices, contenedores de dese-
chos, papel absorbente, micropipetas, soluciones
descontaminantes y etanol 70% presentes en cada
rea son exclusivos y no son intercambiables, es
decir, los insumos utilizados para trabajar en un
rea sucia deben ser distintos a los utilizados en
un rea limpia. Para esto, es necesario disponer de
percheros y un set de materiales ubicados en las
distintas reas de trabajo:

a.- Usar guantes en todo momento, los cuales de- - rea limpia: una vez que se ha ingresado a esta
ben ser libres de polvo (el polvo de los guantes rea, el operador debe vestir inmediatamente
inhibe tambin la PCR). Cambiarse de guantes un delantal exclusivo. Antes de retirarse, el de-
de rea en rea, y/o ante cualquier sospecha de lantal utilizado debe ser colgado en un perche-
contaminacin. ro para que permanezca en esta rea.

b.- Limpiar con soluciones descontaminantes las - rea sucia: siempre que el operador trabaje en
superficies, guantes, gradillas, micropipetas, un rea sucia debe vestir un delantal exclusivo.
coolers, vrtex, etc. antes y despus de usar - rea de carga o dispensacin de muestras: una
el rea. Hay soluciones que slo degradan AR- vez que se ha ingresado a esta rea, el ope-
Nasas, pero son ms eficientes aquellas que rador debe vestir inmediatamente un delantal
degradan ARNasas, ADNasas, ADN y ARN, evi- exclusivo. Antes de retirarse, el delantal utiliza-
tando tambin la posible contaminacin. do debe ser colgado en un perchero para que
c.- Todas las soluciones a utilizar (buffers, enzi- permanezca en esta rea y los guantes deben
mas, agua) deben ser certificadas libres de nu- ser eliminados.
cleasas.
Antes de salir del rea limpia, rea de carga o
d.- Todos los materiales plsticos utilizados: tubos salir del laboratorio, el delantal utilizado debe ser
de reaccin, puntas de micropipetas, tapas de colgado en un perchero para que permanezca en
tubos, placas tiras de tubos deben ser certifi- esta rea y los guantes deben ser eliminados.
cados libres de nucleasas. Los delantales deben ser renovados permanen-

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temente (o lavados frecuentemente) para asegurar
la eliminacin de contaminantes (delantales rea
sucia) y mantencin de la limpieza (delantales rea
limpia). Por esta razn, es altamente recomendable
el uso de delantales desechables y, en lo posible,
manguillas desechables.
1.- FLUJO DE TRABAJO
UNIDIRECCIONAL
Figura 1:
Esquema de trabajo, en un laboratorio de PCR, con flujo uni-
direccional.
En la Figura 1 se resume el flujo de trabajo uni-
direccional que debe seguirse al realizar las activi-
dades propias de un laboratorio de PCR, de manera
de trabajar siempre desde el rea ms limpia ha-
cia las reas ms sucias: Preparacin de reactivos,
Carga o dispensacin del templado, Amplificacin y
Deteccin (tanto para PCR de punto final como para
PCR de Tiempo Real).
El rea de procesamiento de las muestras (Ex-
traccin de templado) debe estar separada del rea
de amplificacin y deteccin.
Para mantener el flujo unidireccional de trabajo,
y evitar retroceder desde reas sucias hacia reas
limpias, cada una de las reas de trabajo debe con-
tar con recursos exclusivos tales como: agua libre
de nucleasas, centrfugas, vrtex, refrigeradores/
congeladores, micropipetas, puntas para micropi-
petas y todo lo que sea necesario para la realizacin
de la tcnica. Se incluye adems, elementos adicio-
nales como computadores, lpices y calculadoras
que deben ser exclusivos de cada rea y no inter-
cambiables. Asimismo, debern mantenerse canti-
dades suficientes de guantes y delantales en cada
rea, de forma que su uso sea exclusivo en cada
una de ellas y se disminuya al mnimo el riesgo de
contaminacin.
Todos estos elementos deben estar rotulados
segn el rea a la que pertenezcan y no deben ser
RECOMENDACIONES PARA LABORATORIOS QUE REALIZAN LA TCNICA
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trasladados a otro espacio del laboratorio.
Cabe destacar que las puntas para micropipetas
utilizadas en todas las reas deben tener filtro para
evitar la contaminacin de las mismas por forma-
cin de aerosoles.
El personal, una vez finalizada su tarea en cada
rea, debe sacarse los elementos de proteccin (de-
lantal, guantes y manguillas desechables) antes de
moverse al rea que el flujo unidireccional le indica.
2.- REAS DE TRABAJO
2.1. rea de Extraccin y Purificacin de
Templado
En este espacio deben realizarse las extracciones
y/o purificaciones de cidos nucleicos que luego
sern utilizados como templado para las reacciones
de PCR. El almacenamiento de este material debe
realizarse en un congelador exclusivo ubicado den-
tro de este espacio. La extraccin debe realizarse
en un gabinete de bioseguridad clase II, de forma
que el personal que manipule muestras biolgicas
se mantenga protegido y, al mismo tiempo, se asle
el templado de posibles contaminaciones externas.
El equipamiento de esta rea es exclusivo y no
puede ser usado en otra rea del laboratorio. El per-
sonal, al ingresar, debe utilizar delantal y guantes
exclusivos de esta rea y no puede trasladarlos a
otra rea del laboratorio.
2.2. rea de Preparacin de Reactivos
(Pre-PCR)
El rea de preparacin de reactivos se define
como aquella rea limpia donde se utilizan proto-
colos y equipamientos para preparar las mezclas
de reaccin que sern utilizadas en la PCR. Todo
equipamiento de esta rea es exclusivo y no se pue-
de utilizar en otra rea del laboratorio. En este lugar
debe haber un congelador de -20C de uso exclusi-
vo para almacenar los reactivos utilizados para pre-
parar reacciones de PCR, y nunca mezclarlos con
material biolgico (extractos de ADN o ARN, culti-
vos, material clonado y amplicones). Los stocks de
partidores (oligonucletidos) y los reactivos de PCR
nuevos deben almacenarse en una ubicacin dife-
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 RECOMENDACIONES PARA LABORATORIOS QUE REALIZAN LA TCNICA
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rente, dentro del mismo congelador, con respecto a
los reactivos de uso diario (alcuotas), para evitar su
posible contaminacin.
Como se mencion anteriormente, los delan-
tales y guantes utilizados en esta rea deben ser
exclusivos, ya que no debe existir contaminacin
desde otras reas. Por lo tanto, el personal que in-
grese a esta sala debe sacarse previamente los ele-
mentos de proteccin que est utilizando, y vestir
elementos de proteccin exclusivos una vez dentro
de esta rea.
Este espacio debe contar con una cabina de
PCR cerrada que posea luz ultravioleta. Dentro de
esta cabina deben manipularse todos los reactivos
para preparar mezclas de PCR. En su interior de-
ben mantenerse las micropipetas, tubos y gradillas
de uso diario.
La cabina cerrada va a permitir:
Irradiar la superficie de trabajo dentro de la
cabina con luz ultravioleta previo a su uso, de
forma que las pirimidinas de cualquier traza de
cido nucleico presente en la cabina formen
dmeros entre s (cross-link) bloqueando el
paso de la polimerasa en una futura reaccin
de PCR.
2.3. rea de Carga o Dispensacin de Tem-
plado
En esta rea deben dispensarse los templados
a las mezclas de PCR que han sido preparadas en
el rea limpia. El personal debe ingresar y utilizar
los elementos de proteccin exclusivos de esta rea.
Adems, debe contar con cabina de PCR cerrada
que posea luz ultravioleta, micropipetas, gradillas y
microcentrfuga de uso exclusivo. Antes de abrir los
tubos que contienen el ADN templado, debe reali-
zarse una breve centrifugacin (spin) para evitar el
escape de aerosoles al abrir el tubo. Una vez adicio-
nado el cido nucleico templado, cerrar hermtica-
mente los tubos y llevar al rea de amplificacin.
Al terminar este proceso, el personal nuevamen-
te debe quitarse guantes y delantal (exclusivos de
esta rea) y dirigirse a los termocicladores para dar
inicio a la reaccin de PCR.
Departamento Laboratorio Biomdico Nacional y de Referencia.
10 Instituto de Salud Pblica de Chile.
2.4. rea de Amplificacin y Deteccin
(Post-PCR)
Antes de entrar a esta rea sucia, el personal
debe vestir guantes y delantal exclusivos de este
sector.
En el caso del PCR de punto final, al finalizar
la reaccin en el termociclador, los amplicones son
manipulados en el sector de electroforesis para la
verificacin de resultados, el cual debe contar con
cmaras de electroforesis, fuentes de poder y los
materiales requeridos para su funcionamiento.
3. FLUJOS DE AIRE AMBIENTAL
Las diferencias de presin del aire pueden usarse
para inhibir el pasaje de contaminantes entre reas:
presiones ms altas se utilizan en reas limpias que
se encuentren prximas o contiguas a reas sucias
a fin de minimizar las contaminaciones.
Por esta razn, las reas de Pre y Post-PCR
idealmente deben contar con presiones de aire dis-
tintas y controladas individualmente. Mientras el
rea limpia de Preparacin de reactivos debe tener
una ligera presin positiva, entre 5-20 Pa por sobre
la presin existente en el pasillo de conexin entre
reas, las otras reas deben tener una ligera presin
negativa para ingresar aire desde el exterior y, por
ende, prevenir el escape de contaminantes hacia
otros lugares del laboratorio.
Es necesario, adems, que los controladores de
presin estn conectados a conductos de escape de
aire separados, de forma que cada uno lleve el aire
extrado/ingresado a lugares distintos y no exista
contaminacin por esta va.
CONCLUSIONES
La rigurosa aplicacin de las medidas pre-
sentadas en este documento permitir un control
efectivo de la contaminacin y la obtencin de re-
sultados confiables en laboratorios que realizan la
tcnica de PCR.
Cabe destacar que tanto la infraestructura y dis-
posicin de las reas en el laboratorio como el en-
 RECOMENDACIONES PARA LABORATORIOS QUE REALIZAN LA TCNICA
DE REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR): REAS Y FLUJOS DE TRABAJO

trenamiento que reciba el personal dedicado a reali- 12.- Schrader C. et al. PCR inhibitors ocurren-
zar esta tcnica, en el contexto de un slido sistema ce, propierties and removal. J Appl Microbiol.
de calidad, son fundamentales para el xito en la 2012; 113 (5): 1014-1026.
aplicacin de estas recomendaciones. 13.- Scherczinger C.A. et al. A systematic analysis
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Departamento Laboratorio Biomdico Nacional y de Referencia.

Instituto de Salud Pblica de Chile. 11